Análisis 3D de las respuestas multicelulares a los degradados Quimioattractant

Resumen

Describimos un método para construir dispositivos para la cultura 3D y la experimentación con células y organoides multicelulares. Este dispositivo permite el análisis de las respuestas celulares a señales solubles en microambientes 3D con degradados de quimioattractant definidos. Los organoides son mejores que las células individuales en la detección de entradas ruidosas débiles.

Resumen

Varias limitaciones de los sistemas de cultivo celular 2D han despertado interés en las plataformas de análisis y cultivo celular 3D, que imitaría mejor la complejidad espacial y química de los tejidos vivos y imitará las funciones de tejido in vivo. Los recientes avances en las tecnologías de microfabricación han facilitado el desarrollo de entornos 3D in vitro en los que las células pueden integrarse en una matriz extracelular bien definida (ECM) y un conjunto definido de biomoléculas solubles o asociadas a matrices. Sin embargo, las barreras tecnológicas han limitado su uso generalizado en los laboratorios de investigación. Aquí describimos un método para construir dispositivos simples para la cultura 3D y la experimentación con células y organoides multicelulares en microentornos 3D con un gradiente de quimioattractant definido. Ilustramos el uso de esta plataforma para el análisis de la respuesta de células epiteliales y organoides a gradientes de factores de crecimiento, como el factor de crecimiento epidérmico (EGF). Los gradientes de EGF fueron estables en los dispositivos durante varios días, lo que condujo a la formación de ramas dirigidas en organoides mamarios. Este análisis nos permitió concluir que la detección de gradiente colectiva por grupos de células es más sensible frente a células individuales. También describimos el método de fabricación, que no requiere instalaciones de fotolitografía ni técnicas avanzadas de litografía blanda. Este método será útil para estudiar los comportamientos celulares en 3D en el contexto del análisis del desarrollo y los estados patológicos, incluyendo el cáncer.

Introducción

En el entorno fisiológico, las células se incrustan en una matriz extracelular (ECM) y se exponen a una plétora de biomoléculas. Las interacciones entre las células y el microentorno circundante regulan los procesos intracelulares que controlan diversos fenotipos, incluyendo la migración, el crecimiento, la diferenciación y la supervivencia^1,2. Se ha aprendido mucho acerca de los comportamientos celulares en un cultivo celular 2D convencional. Sin embargo, con el advenimiento de la imagen intravital y la experimentación con células incrustadas en los hidrogeles 3D, se han reconocido importantes diferencias en los comportamientos celulares en los cultivos 2D in vitro simplificados frente a los entornos de tejido 3D. Mientras que las células interactúan con las fibras de ECM y detectan sus propiedades mecánicas dentro de la matriz 3D, la rigidez del material del gel no es una variable totalmente independiente en un sistema 2D in vitro. La dimensionalidad altera la formación de adherencia focal, resultando en diferentes morfología y comportamiento de las células. Además, las celdas en una superficie 2D se exponen a menos señales de señalización que las celdas abiertas a todas las direcciones en 3D.

Estas limitaciones han incrementado los intereses de los sistemas 3D que representan la complejidad espacial y química de los tejidos vivos y predicen mejor las funciones de tejido in vivo. Se han desarrollado en muchas formas a partir de organoides como microestructuras celulares de auto-ensamblaje a las células intercaladas aleatoriamente en ECM^3,4. Los recientes avances en las tecnologías de microfabricación han facilitado el advenimiento de varios tipos de sistemas de cultivo 3D^5,6,7,8,9 para estudiar los cambios fenotíricos y respuestas celulares a señales solubles; sin embargo, las barreras tecnológicas limitan el uso generalizado en los laboratorios de investigación. En muchos casos, los procesos de fabricación requieren técnicas de fotolitografía y conocimientos de fondo para la litografía blanda. Por otra parte, varios factores deben ser controlados para construir con éxito un dispositivo y para lograr una función óptima del dispositivo durante un largo período de tiempo.

Nuestro método describe cómo construir un dispositivo PDMS 3D para incorporar células y organoides multicelulares en un microentorno 3D con gradientes de prenilado definidos y luego analizar las respuestas epiteliales al EGF¹⁰. Nuestros datos revelan que la capacidad de los organoides para responder a los degradados de EGF superficiales surge del acoplamiento químico intercelular a través de uniones de brecha. Sugiere el potencial de los organoides para una detección más precisa de entradas débiles y ruidosas espacialmente graduadas. El proceso de fabricación no requiere una instalación de sala limpia ni técnicas de fotolitografía. Sin embargo, el dispositivo PDMS 3D incluye los factores necesarios del entorno fisiológico 3D. Este método será útil para estudiar comportamientos celulares en 3D y tiene un gran potencial de investigación con diferentes tipos de células, quimioattractantes, y combinaciones de ECM.

Protocolo

Todo el trabajo en animales se llevó a cabo de acuerdo con los protocolos revisados y aprobados por el Comité institucional de cuidado y uso de animales, Universidad Johns Hopkins, Facultad de medicina.

1. fabricación del dispositivo mesofluidic

1. Diseñe la máscara del molde para el dispositivo PDMS utilizando un software CAD 3D.
2. Imprima el molde con un equipo de estereolitografía con una resina resistente térmica.
   Nota: los procedimientos descritos aquí fueron llevados a cabo por un servicio de impresión 3D comercial.
3. Mezclar minuciosamente una solución de monómero de PDMS con el agente de curado en una relación de 10:1. se requirió 3 mL de mezcla de PDMS para la fabricación del dispositivo. El volumen total depende del número de moldes que se fabrique.
4. Degas la mezcla aplicando un vacío con el uso de una aspiradora de laboratorio o bomba de vacío en un desecador de vacío durante 1 hora.
5. Frote la superficie del molde con una cinta adhesiva para eliminar el polvo y, a continuación, vierta la mezcla de PDMS en el molde. Si se introducen burbujas en el proceso, repita la desgasificación en el desecador de vacío. Las burbujas atrapadas entre los pilares del molde se pueden quitar al pintarlas con una aguja afilada.
   Nota: el proceso de desgasificación a temperatura ambiente debe hacerse dentro de 1 hora o menos.
6. Curar el PDMS calentando a 80 ° c durante 2 horas. Deje enfriar el molde a temperatura ambiente.
7. Corte el contorno entre el molde y el PDMS con una cuchilla y, a continuación, despegue el PDMS del molde con cuidado.
8. Recorte la pieza PDMS para que encaje en el recubrimiento de 22 mm x 22 mm y golpee un orificio en la entrada.
   Nota: el protocolo se puede pausar aquí.
9. Limpie la parte PDMS y la cobertura de 22 mm x 22 mm limpiando las superficies con tejidos de baja pelusa y etanol al 70%. A continuación, extraiga las partículas de polvo grandes con una cinta adhesiva.
10. Esterilizar la parte PDMS y cubrirse con cualquier autoclave (121 ° c durante 8 minutos húmedos, 15 minutos secos) o la exposición a la luz UV durante 1 hora.
11. Trate la superficie inferior de la parte PDMS y el resguardo de la tapa con la pistola de descarga corona durante 5 min en la campana de cultivo de tejido y luego juntarlos.
    PRECAUCIÓN: Coloque cualquier material no conductora como espuma de poliestireno en la parte inferior y quite todos los materiales conductoras durante este proceso. Inyecte colágeno en el dispositivo inmediatamente, dentro de 5 minutos, después del tratamiento para aumentar la unión entre el gel de colágeno y el recubrimiento de vidrio.

2. preparación celular: aislamiento organoide mamario primario

Nota: los detalles del aislamiento organoide mamario se pueden encontrar en una obra anterior¹¹. Cualquier tipo de célula única o organoide puede prepararse de acuerdo con sus propios protocolos de aislamiento/desprendimiento.

1. Mince el tejido de las glándulas mamarias de los ratones con un bisturí hasta que el tejido se relaja y se agita durante 30 min a 37 ° c en 50 mL de solución de colagenasa/tripsina (10 mL por ratón) en DEME/F12 complementado con 0,1 g de tripsina, 0,1 g de colagenasa , 5 mL de FBS, 250 μL de 1 μg/mL de insulina, y 50 μL de 50 μg/mL de gentamicina.
2. Centrifugar la solución de colagenasa/tripsina a 1.250 x g durante 10 min, retirar el sobrenadante por aspiración. Dispersar las células en 10 mL de DMEM/F12, y centrifugar a 1.250 x g durante 10 min. Después de eliminar DMEM/F12 por aspiración, vuelva a suspender las células en 4 mL de DMEM/F12 suplementadas con 40 μL de DNase (2 unidades/μL).
3. Agitar la solución de DNase a mano durante 2-5 min y luego centrifugar a 1.250 x g durante 10 min.
4. Separe los organoides de las células individuales a través de cuatro centrífugas diferenciales (pulse hasta 1.250 x g y detenga la centrifugadora 3-4 s después de que alcance la velocidad prevista). Entre cada pulso, aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 10 mL de DMEM/F12.
5. Vuelva a suspender el pellet final en la cantidad deseada de medio de crecimiento de DMEM/F12 con 1% de penicilina/estreptomicina y 1% de insulina-transferrina-selenio-X para la preparación de colágeno.

3. preparación e inyección de colágeno

Nota: otros tipos de geles ECM se pueden preparar de acuerdo con sus propios protocolos de la gelificación.

1. Prepare la solución de colágeno tipo I (3,78 mg/mL), 10X DMEM, 1 N NaOH solución, medio de crecimiento normal en hielo.
   Nota: Mantenga el hielo hasta que se complete el procedimiento.
2. Añadir 6 μL de 1 N NaOH solución, 200 μL de medio de crecimiento y 50 μL de 10x DMEM en un tubo de microcentrífuga pre-enfriado y mezclar la solución a fondo.
3. Añadir 425 μL de colágeno en la solución premezclada y mezclar bien mediante pipeteo.
4. Centrifugar la mezcla de colágeno brevemente (menos de 5 segundos) para separar y eliminar las burbujas de la mezcla.
5. Mantenga la solución de colágeno neutralizado en hielo durante 1 hora para inducir la formación de fibras.
6. Añadir 50 μL de suspensión celular a la mezcla de colágeno y mezclar bien.
   Nota: la concentración final de colágeno es de 2 mg/mL.
7. Inyecte la solución utilizando 200 μL de Pipet a través de la entrada del dispositivo PDMS hasta que se llene toda la cámara. Si la mezcla de colágeno se desborda a través de los huecos de los pilares, cortar el exceso de colágeno gel con cuchilla quirúrgica aguda después de la gelation.
8. Mantener el dispositivo en la incubadora a 37 ° c con 5% de CO₂ durante 1 hora para inducir la gelación.
9. Llene los embalses en ambos lados con medio de crecimiento y mantenga el dispositivo en la incubadora a 37 ° c con 5% de CO2 hasta que se realice la imagen confocal.

4. imágenes y cuantificación 3D

1. Instale una cámara de cultivo de imágenes de células vivas en un microscopio confocal y ajuste previamente la temperatura y el CO₂ a 37 ° c y el 5%, respectivamente. Para obtener humedad, agregue agua en el depósito de la cámara y coloque toallitas húmedas en la cámara si es necesario.
2. Colocar el dispositivo PDMS en la cámara y añadir EGF a uno de los reservorios como una ' fuente ' del EGF en la formación de gradiente. El otro reservorio servirá un "fregadero" necesario para el desarrollo de la distribución de EGF nivelalmente calificada. 2,5 nM de EGF se añadió en el fregadero para hacer el gradiente de 0,5 nM/mm en este estudio.
3. Establezca el rango de la pila Z cubriendo el volumen de organoides de interés e inicie la toma de imágenes.
   PRECAUCIÓN: para evitar la fototoxicidad, pruebe una menor intensidad del láser en las imágenes confocales o utilice técnicas de imagen multifotónicas.
4. Reconstruya una imagen 3D a partir de pilas de imágenes 2D utilizando software comercial o un programa hecho a medida. Mida la longitud y el ángulo de las ramas que se extienden desde los organoides o la migración de las células individuales. Aquí, realice la cuantificación dibujando un contorno a mano alzada alrededor del cuerpo organoide usando ImageJ.

Resultados

El EGF es un regulador esencial de la morfogénesis ramificada en las glándulas mamarias y un quimioattractante crítico que guía la migración de las células epiteliales del seno en el crecimiento invasivo del cáncer. Se utilizaron los dispositivos fluídico mesoscópicos descritos anteriormente para estudiar la respuesta de las células a los gradientes definidos de EGF (figura 1A, B)¹⁰. El dispositivo produce un...

Discusión

La fabricación de moldes PDMS se realizó utilizando un servicio de impresión 3D comercial, pero también puede ser logrado por una impresora 3D de alta gama en la casa. Entre los diversos métodos de fabricación 3D, la estereolitografía se recomienda para la generación de moldes de alta resolución. Debido a que el curado PDMS se produce a una temperatura alta (80 ° c), los materiales deben ser suficientemente resistentes térmicamente, lo que debe especificarse explícitamente, si la impresión es externalizada. ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
22mm x 22mm coverslip	Fisher Scientific	12-542-B
Collagen I, Rat	Fisher Scientific	CB-40236
Collagenease	Sigma-Aldrich	C5138
COMSOL Multiphysics 4.2	COMSOL Inc		Used for simulating diffusion dynamics
10x DMEM	Sigma-Aldrich	D2429
DEME/F12	Thermo Fisher	11330032
DNase	Sigma-Aldrich	D4623
EGF Recombinant Mouse Protein	Thermo Fisher	PMG8041
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life technologies	16140-071
Fiji-ImageJ			Used for measuring branching length and angles
Gentamicin	GIBCO	5750-060
IMARIS	Bitplane
Insulin	Sigma-Aldrich	19278
Insulin-Transferrin-Selenium-X	GIBCO	51500
Low-lint tissue	Kimberly-Clark Professional	Kimtech wipe
Mold Material	Proto labs	Accura SL5530
Mold printing equipment	Proto labs	Stereolithogrphy	Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm
Mold printing Service	Proto labs	Custom	https://www.protolabs.com/
NaOH	Sigma-Aldrich	S2770
Penicillin/Streptomycin	VWR	16777-164P
Spinning-disk confocal microscope	Solamere Technology Group
Sylgard 184	Electron Microscopy Sciences	184 SIL ELAST KIT	PDMS kit
Trypsin	Sigma-Aldrich	T9935