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  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este trabajo presenta un protocolo para establecer un cultivo de suspensión celular derivado del té (Camellia sinensis L.) hojas que se pueden utilizar para estudiar el metabolismo de los compuestos externos que pueden ser tomados por toda la planta, como insecticidas.

Resumen

Se desarrolló una plataforma para estudiar el metabolismo de insecticidas utilizando tejidos in vitro de la planta de té. Las hojas de las plantas de té estéril fueron inducidas a formar callos sueltos en murashige y Skoog (MS) medios basales con las hormonas vegetales 2,4-ácido diclorofenoxacetico (2,4-D, 1,0 mg L-1) y kinetina (KT, 0,1 mg L-1). Callus se formó después de 3 o 4 rondas de subcultura, cada una con una duración de 28 días. El callo suelto (alrededor de 3 g) se inoculó en medios líquidos B5 que contenían las mismas hormonas vegetales y se cultivaba en una incubadora de temblores (120 rpm) en la oscuridad a 25 oC. Después de 3 x 4 subcultivos, se estableció una suspensión celular derivada de la hoja de té en una relación subcultal que oscila entre 1:1 y 1:2 (líquido madre de suspensión: medio fresco). Usando esta plataforma, se añadieron seis insecticidas (5 g de ml-1 cada tiametoxam, imidacloprid, acetamiprid, imidaclothiz, dimetoato y omethoato) al cultivo de suspensión celular derivado de la hoja de té. El metabolismo de los insecticidas fue rastreado mediante cromatografía líquida y cromatografía de gases. Para validar la utilidad del cultivo de suspensión de células de té, los metabolitos de tiametoxano y dimetoato presentes en cultivos celulares tratados y plantas intactas se compararon utilizando espectrometría de masas. En los cultivos de células de té tratadas, se encontraron siete metabolitos de tiametoxano y dos metabolitos de dimetoato, mientras que en las plantas intactas tratadas, sólo se encontraron dos metabolitos de tiametoxam y uno de dimetoato. El uso de una suspensión celular simplificó el análisis metabólico en comparación con el uso de plantas de té intactas, especialmente para una matriz difícil como el té.

Introducción

El té es una de las bebidas no alcohólicas más consumidas en el mundo1,2. El té se produce a partir de las hojas y cogollos de la perley perenne Camellia sinensis L.Las plantas de té se cultivan en vastas plantaciones y son susceptibles a numerosas plagas de insectos 3,4. Los insecticidas organofosforados y neonicotinoides se utilizan a menudo como insecticidas sistémicos5 para proteger las plantas de té de plagas como las moscas blancas, las tolvas de hojas y algunas especies de lepidópteros6,7. Después de la aplicación, estos insecticidas son absorbidos o translocados en la planta. Dentro de la planta, estos insecticidas sistémicos pueden transformarse a través de hidrólisis, oxidación o reacciones de reducción por enzimas vegetales. Estos productos de transformación pueden ser más polares y menos tóxicos que los compuestos principales. Sin embargo, para algunos organofosfatos, las bioactividades de algunos productos son más altas. Por ejemplo, el acefato se metaboliza en el metamidofos más tóxico8,9, y el dimetoato en el omethoato10,11. Por lo tanto, los estudios metabólicos de las plantas son importantes para determinar el destino de un pesticida dentro de una planta12.

Se ha demostrado que los cultivos de tejidos vegetales son una plataforma útil para investigar el metabolismo de los plaguicidas, con los metabolitos identificados similares a los que se encuentran en las plantas intactas13,14,15. El uso de cultivos tisulares, particularmente cultivos de suspensión celular, tiene varias ventajas. En primer lugar, los experimentos pueden llevarse a cabo sin microorganismos, evitando así la interferencia de la transformación o degradación de plaguicidas por microbios. En segundo lugar, el cultivo de tejidos proporciona materiales consistentes para su uso en cualquier momento. En tercer lugar, los metabolitos son más fáciles de extraer de cultivos de tejidos que de plantas intactas, y los cultivos de tejidos a menudo tienen menos compuestos intercaladores y menor complejidad de los compuestos. Por último, los cultivos de tejidos se pueden utilizar más fácilmente para comparar una serie de metabolismo de pesticidas en un solo experimento16.

En este estudio, se estableció con éxito una suspensión celular derivada de las hojas de la planta de té cultivada estérilmente. El cultivo de suspensión de células de té se utilizó entonces para comparar los comportamientos de disipación de seis insecticidas sistémicos.

Este protocolo detallado está destinado a proporcionar alguna orientación para que los investigadores puedan establecer una plataforma de cultivo de tejido vegetal útil para estudiar el destino metabólico de los xenobióticos en el té.

Protocolo

1. Cultura callo del té

NOTA: Las hojas estériles se derivaron de líneas de plantlet cultivadas in vitro desarrolladas por primera vez en el grupo de investigación17. Todos los procedimientos hasta la sección 5 se llevaron a cabo en una campana de flujo laminar estéril, excepto por el tiempo de cultivo en una incubadora.

  1. Ajustar el pH de los dos medios (Murashige y Skoog [MS] medio basal y medio líquido B5 de Gamborg) a 5.8 antes de autoclave (121 oC, 20 min).
  2. Cortar a lo largo de la vena media de una hoja estéril usando tijeras, y luego subdividir cada mitad en pequeños trozos de aproximadamente 0,3 cm x 0,3 cm en una placa de petri.
  3. Coloque los explantes estériles (las piezas de hoja pequeña) en los medios basales de EM que contengan las hormonas vegetales 2,4-D (1,0 mg L-1) y KT (0,1 mg L-1). Se pueden colocar seis explantas en un matraz de 300 ml que contiene 100 ml de medios basales de LaM.
  4. Cultivo de la hoja anterior explantes a una temperatura constante de 25 oC en la oscuridad. Después de 28 días, seleccione la primera generación de callo inducido y transfiera al matraz fresco (una subcultura). Adquiere el callo suelto y friable después de 3x4 subculturas.

2. Cultivo de suspensión de células de té

  1. Corte los callos vigorosos, friables y sueltos del medio sólido en trozos pequeños (rango aquí 0,5 x 2 mm) utilizando una cuchilla quirúrgica estéril en condiciones estériles.
  2. Pesar alrededor de 3 g de los pequeños trozos de callo. Colocar el callo en un matraz de 150 ml que contenga 20 ml de medios líquidos B5 complementados con 2,4-D (1,0 mg L-1) y KT (0,1 mg L-1).
  3. Cultivar la suspensión de la célula líquida a una temperatura constante (25 o1 oC) en una incubadora de agitación a 120 rpm en la oscuridad.
  4. Después de 7 a 10 días de cultivo, retire los frascos de cultivo y déjelos reposar durante unos minutos.
  5. Tome todo el sobrenadante como material de semilla para el subcultivo al medio fresco (relación de subcultivo de líquido madre de suspensión a medio fresco oscilado entre 1:1 y 1:2). Retire los callos precipitados y grandes.
  6. Obtenga el cultivo final de suspensión celular bien crecido después de 3 x 4 ciclos de subcultivo de 28 días cada uno.

3. Ensayo de cloruro de trifenilo tetrazolium de viabilidad celular

  1. Matar una muestra de células vivas a 100 oC durante 10 minutos como célula de control antes de la mancha de viabilidad.
  2. Centrifugar todo el cultivo de suspensión celular durante 8 min a 6000 x g. Retire el sobrenadante antes de suspender las células en 2,5 ml de tampón de solución salina con fosfato (PBS) (pH 7.3), y agítelo durante 1 min a mano.
  3. Añadir 2,5 ml de la solución de cloruro de tetrazolium de trifenilo (TTC) al 0,4%, y agitar a mano de nuevo.
  4. Incubar la mezcla durante 1 h en una incubadora de pie (30oC).

4. Tratamiento y muestreo de cultivos de suspensión de células de té con insecticidas

  1. Añadir una alícuota de 400 ml de solución de stock esterilizada por filtro (500 g de ml-1) de cuatro neonicotinoides (tiametoxam, acetamiprid, imidacloprid e imidaclothiz) o dos organofosfatos (dimetoato y omethoato) en los cultivos de suspensión celular, Respectivamente.
    NOTA: Si el objetivo es comparar los comportamientos xenobióticos, utilice el mismo lote madre de suspensiones celulares para probar los diferentes compuestos.
  2. Cultivo de las muestras de las suspensiones celulares con insecticidas a temperatura constante (25 o1 oC) y velocidad de incubadora de agitación (120 rpm). Tome las muestras (ver paso 4.3 o 4.4) en 0, 3, 5 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 y 75 días.
  3. Para probar una muestra que contenga un neonicotinoide, retire una alícuota de 1 ml del cultivo celular homogéneo, colóquela en un tubo centrífugo de plástico de 1,5 ml y centrífuga a 4000 x g durante 2 min.
    1. Pase los sobrenatantes a través de una membrana de filtro de tamaño poro de 0,22 m antes del análisis por cromatografía líquida-ultravioleta de alto rendimiento (HPLC-UV) y cromatografía líquida de ultra alto rendimiento,cuadrúpo de tiempo de vuelo (UPLC-QTOF) de masa espectrometría (Tablade materiales).
  4. Para analizar una muestra que contenga un organofosfato, retire una alícuota de 500 l del cultivo celular y colóquela en un tubo centrífugo de 35 ml o en un tubo de centrífuga de plástico de 1,5 ml (prepare la última muestra como la de neonicotinoide).
    1. Añadir 0,1 g de cloruro sódico y 5 ml de acetona/acetato de etilo (3:7, v/v) en el tubo centrífugo de 35 ml de las muestras de 500 ml.
    2. Vortex las mezclas durante 1 min, y luego dejar que descansen durante 10 min.
    3. Tomar 2,5 ml del sobrenadante en un tubo de vidrio de 10 ml y evaporar hasta casi secarlo utilizando un evaporador de nitrógeno a 40 oC.
    4. Disolver el residuo con 1 ml de acetona, vórtice durante 1 min, pasarlo a través de una membrana de filtro de 0,22 m antes de su análisis por cromatografía de gases-detector fotométrico de llama (GC-FPD).

5. Preparación de muestras de planta de té intacta con insecticidas

NOTA: El ensayo intacto de la planta de té se llevó a cabo en un sistema hidropónico utilizando plántulas de té cultivadas en 50 ml de una solución nutritiva (30 NH4+, 10 NO3-, 3.1 PO4-, 40 K+, 20 Ca2+, 25 Mg2+, 0.35 Fe2+, 0.1 B 3+, 1.0 Mn2+, 0.1 Zn2+, 0.025 Cu2+, 0.05 Mo+, y 10 Al3+, en mg L-1)18. Un invernadero experimental estaba bajo un ciclo de luz-oscuridad (12 h de luz y 12 h de oscuridad) a 20oC en la Universidad Agrícola de Anhui.

  1. Poner cinco plantas en una olla de plástico de 4 L durante 15 días.
  2. Añadir 0 ppm (control) o 100 ppm de tiametoxam o dimetoato en macetas de plástico, respectivamente.
  3. Preparar la muestra de planta intacta de acuerdo con el método anterior, excepto para el presoaking19,y luego analizar con espectrometría de masas para un espectro de masas preciso.

6. Análisis de instrumentos

  1. Análisis de HPLC del comportamiento metabólico de los neonicotinoides
    1. Utilice un HPLC-UV (Tablade Materiales)para detectar el contenido y los productos metabólicos de tiametoxam y acetamiprid a una longitud de onda de 254 nm, y de imidacloprid e imidaclothiz a 270 nm en muestras de la sección 4.3.
      NOTA: La condición HPLC-UV fue la misma que la del estudio anterior19.
  2. Análisis GC del comportamiento metabólico de los organofosfatos
    1. Detectar el contenido de dimetoato y omethoato en muestras de la sección 4.4 por un GC-FPD utilizando una columna quiral (Tabla de Materiales).
    2. Utilice nitrógeno como gas portador y ajuste el caudalen 1,0 ml mín.1 .
    3. Ajuste la temperatura inicial a 120 oC, y sosténla durante 5 min. Aumente la temperatura a 150 oC a 30 oC mín.-1 y sosténladla durante 3 min. Por último, aumente a 210 oC a 30 oC min-1 y luego sostenga durante 5 min.
    4. Ajuste la temperatura de la inyección a 200 oC en modo sin divisiones; Ajuste la temperatura del detector a 250 oC.
    5. Ajuste el volumen de la inyección a 1 l.
  3. Análisis UPLC-QTOF de los metabolitos insecticidas en el cultivo celular
    1. Detectar los metabolitos de los insecticidas en el cultivo celular (muestras de la sección 4.3) utilizando UPLC-QTOF con una columna C18 (Tablade materiales).
    2. Establezca el caudal en 0,2 ml mín.:mín.1. Ajuste el volumen de la inyección a 10 s.
    3. Para las muestras tratadas con neonicotinoides, establezca la fase móvil inicial en 85% A (5 mM de agua formatea de amonio) y 15% B (acetonitrilo). Más de 10 min, aumentar la fase móvil B a 38% y volver a 15% sobre 1 min, mantener durante 9 min.
    4. Para las muestras tratadas con organofosfato, establezca la fase móvil inicial en 55% A (0,1% agua de ácido fórmico) y 45% B (acetonitrilo). Más de 5 min, aumentar la fase móvil B a 70%, luego volver al 45% de B sobre 0,5 min, mantener durante 2,5 min.
    5. Establezca los parámetros de funcionamiento QTOF de la siguiente manera: temperatura del gas, 325 oC; gas de secado (nitrógeno), 10 L min-1; temperatura del gas de la vaina, 350 oC; flujo de gas de vaina, 11 L min-1; tensión capilar, 4000 V; tensión de la boquilla, 1000 V; voltaje fragmentador, 100 V para insecticidas neonicotinoides o 110 V para insecticidas organofosforados; voltaje de skimmer, 65 V; en modo iónico positivo.
    6. Ajuste el instrumento al espectro de escaneado completo y al modo MS/MS objetivo.
    7. Procesar los datos utilizando herramientas de masa precisas; Inferir los metabolitos sin productos estándar de la anotación MS/MS, así como la literatura12,15,20,21,22.
  4. Análisis UPLC-Orbitrap de los metabolitos insecticidas en extracto de planta intacto
    1. Detectar los metabolitos de los insecticidas en el extracto de planta intacto utilizando espectrometría de masas UPLC-Orbitrap (Tabla de Materiales).
    2. Establezca los parámetros de funcionamiento de la espectrometría de masas (Tablade materiales)de la siguiente manera: presión de gas de vaina, 35 arb; temperatura del gas, 300 oC; tensión de la boquilla, 3.5 KV; temperatura capilar, 350oC.
    3. Establezca los programas de elución como los anteriores (pasos 6.3.3 y 6.3.4) para el análisis UPLC-QTOF del cultivo celular.

Resultados

La inducción de callos a partir de hojas cosechadas a partir de árboles de té cultivados en el campo y de hojas extirpadas de plantas de té cultivadas in vitro en un ambiente estéril se comparó midiendo la contaminación, el pardeamiento y la inducción después de 28 días de cultivo en medios de aseo ( Figura 1A). El crecimiento del callo se registró en 20, 37, 62 y 90 días de cultivo (Figura1B). El callo derivado de la...

Discusión

Este artículo presenta el proceso detallado de establecer un modelo de metabolismo de pesticidas en el tejido vegetal del té, incluyendo la selección de explantas, la determinación de la viabilidad celular y el establecimiento de un cultivo de suspensión de células de té con alto nivel metabólico Actividad. Cualquier parte de un tejido vegetal podría utilizarse para iniciar el callo en un ambiente esterilizado25. Las hojas de té fueron elegidas para la iniciación del callo en este estud...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional De Investigación y Desarrollo Clave (2016YFD0200900) de China, la Fundación Científica Natural Nacional de China (No 31772076 y No 31270728), China Postdoctoral Foundation (2018M630700) y Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Laboratorio Clave Estatal de Biología y Utilización de Plantas de Té (SKLTOF20180111).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetamiprid (99.8%)Dr. Ehrenstorfer46717CAS No: 135410-20-7
Acetonitrile (CAN, 99.9%)TediaAS1122-801CAS No: 75-05-8
AgarSolarbio Science & TechnologyA8190CAS No: 9002-18-0
Clothianidin (99.8%)Dr. Ehrenstorfer525CAS No: 210880-92-5
Dimethoate (98.5%)Dr. Ehrenstorfer109217CAS No: 60-51-5
Imidacloprid (99.8%)Dr. Ehrenstorfer91029CAS No: 138261-41-3
Imidaclothiz (99.5%)Toronto Research ChemicalI275000CAS No: 105843-36-5
Kinetin (KT, >98.0%)Solarbio Science & TechnologyK8010CAS No: 525-79-1
Omethoate (98.5%)Dr. Ehrenstorfer105491CAS No: 1113-02-6
Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP)Solarbio Science & TechnologyP8070CAS No: 25249-54-1
SucroseTocris Bioscience5511CAS No: 57-50-1
Thiamethoxam (99.8%)Dr. Ehrenstorfer20625CAS No: 153719-23-4
Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%)Solarbio Science & TechnologyT8170CAS No: 298-96-4
2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%)Guangzhou Saiguo BiotechD8100CAS No: 94-75-7
chiral columnAgilent CYCLOSIL-B112-6632Chromatography column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)
Gas chromatography (GC)Shimadu2010-PlusPaired with Flame Photometric Detector (FPD)  
High-performance liquid chromatography (HPLC)Agilent1260Paired with Ultraviolet detector (UV)
HSS T3 C18 columnWaters186003539Chromatography column (100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm)
Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC)Agilent1290-6545Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF)
Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC)Thermo ScientificUltimate 3000-Q Exactive FocusConnected to a Orbitrap mass spectrometer

Referencias

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