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  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este protocolo presenta un método estandarizado para cultivar células VX2 en cultivo y para crear un modelo ortotópico VX2 de cáncer endometrial con metástasis de ganglios linfáticos retroperitoneales en conejos. Los modelos de cáncer de endometrio ortotópico son importantes para el estudio preclínico de nuevas modalidades de diagnóstico por imágenes para el diagnóstico de metástasis de ganglios linfáticos.

Resumen

El cáncer de endometrio es la neoplasia maligna ginecológica más común en América del Norte y la incidencia está aumentando en todo el mundo. El tratamiento consiste en cirugía con o sin tratamiento adyuvante dependiendo de la afectación de los ganglios linfáticos según lo determinado por la linfadenectomía. La linfadenectomía es un procedimiento mórbido, que no ha demostrado tener un beneficio terapéutico en muchos pacientes, por lo que se requiere un nuevo método para diagnosticar metástasis de ganglios linfáticos. Para probar nuevos agentes de imágenes, se necesita un modelo fiable de cáncer endometrial con metástasis de ganglios linfáticos retroperitoneales. El modelo de cáncer de endometrio VX2 se ha descrito con frecuencia en la literatura; sin embargo, existe una variación significativa con respecto al método de establecimiento de modelos. Además, no se han reportado estudios sobre el uso de células VX2 cultivadas para crear este modelo, ya que sólo las células propagadas in vivo se han utilizado previamente. En este documento, presentamos un método quirúrgico estandarizado y un método de monitoreo postoperatorio para el establecimiento del modelo de cáncer de endometrio VX2 e informamos sobre el primer uso de células VX2 cultivadas para crear este modelo.

Introducción

El cáncer de endometrio, o cáncer del revestimiento del útero, es la segunda neoplasia maligna ginecológica más común a nivel mundial y la neoplasia maligna más común en las naciones desarrolladas1. La incidencia de cáncer de endometrio ha aumentado constantemente, aumentando un 2,3% anual entre 2005-2013, con un correspondiente aumento del 2,2% en la mortalidad1,2,3. El diagnóstico de metástasis de ganglios linfáticos es primordial ya que la presencia de ganglios linfáticos positivos es un fuerte predictor negativo de supervivencia4,5,6,7 y puede guiar la administración de terapia adyuvante8,9,10,11,12,13. Actualmente, las metástasis de los ganglios linfáticos se diagnostican mediante la extirpación quirúrgica del tejido linfático que cubre los vasos sanguíneos principales de la pelvis y el abdomen. Este procedimiento, conocido como linfadenectomía, es controvertido debido a los datos de supervivencia contradictorios de dos grandes ensayos14,15,16,17,18 y los conocidos riesgo intraoperatorio15,19,20 y morbilidad postoperatoria21,22,23. Dado que las modalidades de imagen no invasivas actuales no tienen la sensibilidad y especificidad necesarias para reemplazar la disección24de los ganglios linfáticos, se ha producido un impulso para desarrollar nuevas técnicas de diagnóstico por imágenes. Para probar estas nuevas técnicas en un entorno preclínico, se requiere un modelo fiable de cáncer de endometrio con metástasis de ganglios linfáticos retroperitoneales.

El modelo tumoral de conejo VX2 es un modelo bien establecido que se ha utilizado ampliamente para estudiar múltiples tumores de órganos sólidos humanos25 incluyendo pulmón26,cabeza y cuello27,28, hígado29, riñón30, hueso31,32, cerebro33, páncreas34 y útero35,36,37. El modelo VX2 fue desarrollado originalmente en 1940 por Kidd y Rous38 trasplantando con éxito un virus del papiloma de conejo de cola de algodón descubierto por Shope en 193339. Desde entonces, el modelo VX2 se ha mantenido in vivo, requiriendo paso en serie en el músculo cuádriceps de conejos blancos de Nueva Zelanda40. Más recientemente, sin embargo, múltiples grupos han cultivado con éxito células VX2 in vitro40,41,42 y demostrado la tumorigeneidad retenida de la línea celular cultivada31, 42,43. Los tumores VX2 se definen histológicamente como carcinomas de células escamosas anaplásicas44 y contienen rasgos glandulares que se asemejan al adenocarcinoma26. Los tumores se caracterizan por la facilidad de implantación, crecimiento rápido e hipervascularización44,45 y metástasis fiable, más comúnmente a los ganglios linfáticos regionales y distantes45. Las similitudes en la anatomía uterina vascular y linfática46, así como en el sitio de crecimiento ortotópico aseguran que el patrón metastásico del carcinoma VX2 del conejo imita al del cáncer de endometrio humano, haciendo del modelo VX2 un modelo fiable para el estudio humano enfermedad metastásica. Además, características histológicas como la proliferación microvascular anormal47, así como las similitudes inmunológicas48 y genéticas49,50 entre humanos y conejos sugieren que el tumor microambiente puede reflejar el del cáncer de endometrio humano.

Múltiples grupos han informado sobre el uso de VX2 para crear un modelo de cáncer de endometrio con metástasis retroperitoneales con una alta tasa de éxito reportado36,51,52; sin embargo, existe una variación significativa dentro de la literatura actual con respecto al método de creación de modelos. Dosis de suspensión celular tan bajas como 4 x 105 células/cuerno uterino51 y tan altas como 5 x 109 células/cuerno uterino37,53 se han reportado sin consenso estándar sobre la dosis celular VX2 requerida. También, una variedad de métodos de inoculación se han divulgado incluyendo la implantación microquirúrgica del tumor en el miometrio uterino36, inyección de suspensión celular VX237,44,52 , 53 y en algunos casos, la adición de cuerno uterino suturando antes de la innoculación52. Por último, ningún grupo ha informado del uso de celdas VX2 cultivadas para crear este modelo. Por lo tanto, el propósito de este estudio es demostrar un método estandarizado exitoso de creación de modelos VX2 e informar del primer uso de células VX2 cultivadas para crear un modelo de cáncer endometrial con metástasis retroperitoneales en un conejo.

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Protocolo

Cierre profundo de la pared abdominal: Identificar el ápice de la incisión peritoneal y agarrar el peritoneo, el músculo rectus y la fascia con fórceps tisulares. Todos los estudios en animales se llevaron a cabo en las instalaciones aprobadas por el Centro de Recursos Animales (ARC) de la Red Universitaria de Salud y de acuerdo con los protocolos aprobados de uso y cuidado de animales (AUP #3994/#4299). La línea celular VX2 se obtuvo del Laboratorio del Dr. Aken en la Red de Salud de la Universidad.

1. Creación de línea celular VX2 in vitro

  1. Cosecha el tumor VX2 del músculo del cuádriceps del conejo y el crecimiento en el flanco del ratón.
    1. Descongelar los bloques tumorales VX2 congelados (1 cm x 1 cm), picar en una placa de cultivo usando una cuchilla de bisturí y colar a través de un filtro de 70 m añadiendo pequeñas cantidades de Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) secuencialmente para asegurar que todas las células estén tensadas para un volumen final de 1 ml.
    2. Cuente las células y diluya con 0.9% solución salina tamponada de fosfato a una concentración de 1 x 107/ml y colóquelas en hielo en un tubo estéril.
      NOTA: Los bloqueos tumorales se obtuvieron de un colaborador de laboratorio de la propagación previa de tumores VX2 en músculos del cuádriceps de conejo.
    3. Anestesiar a una hembra de conejo blanco de Nueva Zelanda (peso 2,5-3,5 kg) con isoflurano inhalado al 2-5%, retirar el pelaje que cubre el lugar de inyección y limpiar el lugar de inyección con solución de povidona-yodo. Inyectar 500 l de la suspensión de células VX2 preparada (5 x 106 células/ml) en el músculo cuádriceps del conejo. Supervise clínicamente al conejo para detectar el crecimiento tumoral a partir del día 10.
    4. Eutanasia de los conejos después de que los tumores alcancen 1-1,5 cm de diámetro (medido externamente con pinzas) utilizando un método aprobado por un veterinario. Confirme la eutanasia comprobando los signos vitales, incluida la frecuencia cardíaca y la frecuencia respiratoria. Consube el tumor con instrumentos estériles después de limpiar el área con solución de betadina.
    5. En un armario de seguridad biológica utilizando instrumentos estériles, picar el tumor en trozos pequeños (0,2 cm) en un plato de cultivo de tejido de 10 cm usando una cuchilla de bisturí. Pasar los fragmentos tumorales a través de un colador de células de 70 m utilizando 1 ml de HBSS como se describe en el paso 1.1.1. Cuente las células y diluya utilizando una solución salina del 0,9% para obtener 7,5 x 105 células en 200 s.
    6. Anestetizar ratones gamma nodal masculinos NOD (peso 25 g) usando 4% de isoflurano a 1 L/min y mantener la anestesia usando 2% de isoflurano. Una vez anestesiados los ratones, inyectar 200 ml de la solución a partir del paso 1.1.5 en el tejido subcutáneo del flanco del ratón utilizando una aguja de calibre 27.
  2. Cosecha y paso de células VX2 in vitro
    1. Monitoree el crecimiento del xenoinjerto clínicamente dos veces por semana hasta que los tumores alcancen 1 cm de diámetro utilizando pinzas.
    2. Eutanizar ratones colocando en una cámara deCO2 o realizando dislocación cervical después de anestesiar con 4% de gas isoflurano. Impuestos especiales de tumores en condiciones estériles en un gabinete de seguridad biológica.
    3. Tumores de picado con un bisturí en trozos de 1-2 mm en un plato de cultivo de tejido de 6 cm que contiene 3 ml de medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco/F12+ 10% de suero bovino fetal (FBS) de Ham.
    4. Dejar fragmentos tumorales intactos en una incubadora de 37 oC con 5% deCO2 durante dos días hasta que las células comiencen a salir de las piezas tumorales. Posteriormente, revise las placas cultivadas diariamente mediante microscopía ligera para comprobar la confluencia celular. Al alcanzar el 70% de confluencia, trippsinizar las células agregando 1 ml de trippsina al matraz y colocándolo de nuevo en la incubadora de 37oC durante 5 min.
    5. Neutralice la trippsina con 6 ml de medio F12 + 10% FBS de DMEM/Ham, recoja las células y centrífuga a 4 oC durante 5 min a 300 x g. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 3,5 ml de los nuevos medios DMEM/Ham F12 + 10% FBS. Semilla fresca 6 cm colágeno I recubierto placas con 1.6 x 106 células por placa para lograr aproximadamente 50% densidad de semilla celular.
      NOTA: 50% de densidad celular se refiere a las células que toman hasta el 50% de la superficie de la placa cuando se unen.
    6. Paseo anticipado: Repita el proceso anterior (trippsinización, sembración) hasta que las células se hayan pasado 5 veces y luego evalúe la pureza de la línea celular con PCR utilizando un ensayo cuantitativo de PCR para distinguir el ADN genómico del conejo del ADN genómico del ratón (ver paso 1.3.1-1.3.4).
      NOTA: Después de 8 pasajes, las células se pueden propagar en placas de cultivo de tejido sadherente regular no recubiertas de colágeno.
    7. Pasaje, trippsinizar y congelar alícuotas de células en DMEM/HAM F12+30% FBS+10%DMSO a una concentración de 2 x 106 por vial. Almacene las células en nitrógeno líquido hasta que sea necesario para los experimentos.
  3. Confirmación del origen VX2 de las células supervivientes:
    1. Cree una cura estándar a partir del ADN genómico purificado de ratón y conejo (Paso 1.3.2 y Paso 1.3.3). Utilice imprimaciones que se dirijan a secuencias específicas de especies dentro del segundo marco de lectura abierto del elemento retrotransposon LINE-1.
      NOTA: Las secuencias de imprimación para CRPV E6 son: 5'- GATCCTGGACCACCAACCAGTGand 5'-CCTGCCGGTCCCTGATTTAT. Se utilizaron los elementos retrotransposon LINE-1. Las secuencias de imprimación para conejo LINE-1 son: 5'-TCAGGAAACCCCAGAAAGTATGC y 5'-TTTGATTTCTTGAATGACCCAGTGT Las secuencias de imprimación para ratón LINE-1 son: 5'-AATGGAAAGCCAACATTCACGTG y 5'-CCTTCCTTCACAATATATCATTGTG
    2. Para crear una curva estándar para CRPV E6, purifique el lisato de células tumorales VX2 (Paso 1.1.1) utilizando un kit comercial siguiendo el protocolo del fabricante. Cuantifique este ADN usando un ensayo comercial. Realice 6 diluciones en serie de 225 pg/L a 0.925 pg/L en un búfer EDTA-TE bajo. Para crear una curva estándar para el ADN genómico del ratón, diluir 100 g de ADN genómico de ratón comercial en un tampón EDTA-TE bajo en 5 diluciones desde 125 pg/L hasta 0,0125 pg/L.
    3. Coloque 4 l de cada solución diluida a partir de las muestras del paso 1.3.2 en pozos y ejecute las muestras en un termociclador PCR. Utilice los valores Cq de cada carrera junto con las cantidades de ADN por pozo para calcular una curva estándar utilizando la configuración de umbral automático del software termociclador.
    4. Utilice los procedimientos qPCR estándar para realizar la PCR con 40 ciclos de ciclo de 2 pasos (98 oC y 60 oC) en un termociclador. Establezca los valores umbral y establezca los valores de Ct delta en >35 para asegurarse de que hay una contaminación mínima del ratón en la línea celular VX2 del conejo. El volumen total de cada reacción fue de 10 l, que consisten en 5 l de 2x Mastermix, 1 l de imprimaciones delanteras + inversas con concentración de imprimación final en reacción a 250 nM, y 4 l de muestra de ADN.
      NOTA: Consulte las referencias54,55 para obtener más información sobre la realización de PCR. Se establecen valores de umbral y los valores Ct delta se establecen en >35 para garantizar que haya una contaminación mínima del ratón en la línea celular vx2 del conejo. El nivel recomendado de ADN VX2 para la detección fiable por qPCR es de 1-10 pg.

2. Cultivo celular VX2 y creación de suspensión celular

  1. Viales de descongelación que contienen células VX2 (congeladas en el paso 1.2.7) en un baño de agua a 37 oC durante 1 minuto y transfieren las células a un tubo de centrífuga cónica con 10 ml de medio de cultivo (1:1 DMEM/F-12 + 10% FBS y 1% Penicilina-estreptomicina). Centrífuga durante 8 min a 107 x g,deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 9 ml de medios.
  2. Transfiera las celdas resuspendidas a un matraz de cultivo grande. Incubar las células sin agitar a 37oC. Revise las células diariamente para ver si hay confluencia utilizando microscopía ligera y cambie los medios de cultivo cada tres días.
  3. Creación de suspensión celular VX2 cultivada para inyección
    1. Trippsinizar las células agregando 3 ml de 0.25% de trippsina al matraz una vez que las células han alcanzado 80% de confluencia. Colocar el matraz en una incubadora (37oC) durante 5 min. Transfiera la solución a un tubo centrífugo cónico y centrífuga durante 8 min a 107 x g y luego retire el sobrenadante.
    2. Lavar los gránulos celulares 3 veces con 9 ml de solución salina tamponada de fosfato, centrífuga y eliminar el sobrenadante como arriba. Cuente las células y diluya con 0.9% solución salina tamponada de fosfato a una concentración de 4 x 107 células/ml y colóquelas en un tubo de centrífuga cónica estéril sobre hielo.
  4. Creación de suspensión inyectable de células VX2 in vivo
    1. Descongelar los bloques tumorales VX2 congelados (1 cm x 1 cm), picar en una placa de cultivo usando una cuchilla de bisturí y colar a través de un filtro de 70 m como en el paso 1.1.1. Agregue pequeñas cantidades de HBSS secuencialmente para asegurarse de que todas las células estén tensadas para un volumen final de 1 ml. Cuente las células y diluya con 0.9% de solución salina tamponada de fosfato a una concentración de 1 x107/ml y colóquelas en hielo en un tubo estéril.
      NOTA: Los bloqueos tumorales se obtuvieron de un colaborador de laboratorio de la propagación previa de tumores VX2 en músculos del cuádriceps de conejo.

3. Establecimiento de Modelos Quirúrgicos

  1. Establecimiento de anestesia quirúrgica y preparación preoperatoria
    1. Premedicar conejos blancos de Nueva Zelanda (2,5-3,5 kg) 1 h antes del procedimiento quirúrgico planificado mediante inyecciones de acepromaz (1 mg/kg IM) y meloxicam (0,2 mg/kg SQ). Anestesiar a una hembra de conejo blanco de Nueva Zelanda (peso 2,5-3,5 kg) con isoflurano inhalado al 2-5%, retirar el pelaje que cubre el lugar de inyección y limpiar el lugar de inyección con solución de povidona-yodo.
    2. Intubate conejos anestesiados usando una máscara laríngea en las vías respiratorias (LMA) y aseguran en su lugar con cinta adhesiva, manteniendo la anestesia profunda mediante la valoración de la dosis de isoflurano inhalada entre 2-5%. Supervise la anestesia quirúrgica regularmente durante todo el procedimiento mediante la comprobación de signos vitales (frecuencia respiratoria, recarga capilar, saturación de oxígeno si está disponible) y monitoreo de signos que sugieran dolor (movimiento, abstinencia de estímulos, ruidos) o luz anestesia (movimiento, masticar en el tubo LMA).
      NOTA: Esto debe ser hecho por alguien con experiencia en el monitoreo de la anestesia quirúrgica.
    3. Coloque un catéter de vena de oído del calibre 22 en la vena dorsal marginal. Administrar cefazolina (20 mg/kg) por vía intravenosa 10 minutos antes de la incisión quirúrgica de la piel.
    4. Recorta el cabello sobre la pelvis y el abdomen antes de colocar el conejo sobre la mesa de operación, luego coloca los conejos en una posición dorsal sobre la mesa de operación. Limpie el campo quirúrgico con una preparación quirúrgica de la piel de 3 pasos (jabón de betadina, solución de clorhexidina, solución de betadina). Cubrir el campo quirúrgico con cortinas de laparotomía después de marcar la parte superior del hueso púbico, dejando expuesta un área de 5 cm x 5 cm del abdomen inferior.
  2. Creación de la incisión de la laparotomía y la identificación de los cuernos uterinos
    1. Ponte una gorra quirúrgica y una mascarilla facial. Frote las manos con la solución de exfoliación quirúrgica de clorhexidina o betadina. Usando una técnica estéril, ponte una bata estéril y guantes quirúrgicos estériles.
    2. Usando un bisturí de 11 hojas, haz una incisión de 2,5 cm de largo cranial a la sínfisis pubis a través de la piel y el tejido subcutáneo del abdomen del conejo. Incise el recto fascia y disecciona los músculos del recto lateralmente para exponer el peritoneo subyacente. Entrar en el peritoneo bruscamente después de asegurarse de que la superficie inferior está libre de intestino u otros órganos abdominales.
    3. Localice los cuernos uterinos que identifican la vejiga urinaria y barre un dedo enguantado de manera superior, posterior y lateral sobre el ápice de la vejiga.
      NOTA: Si es necesario, la vejiga llena se puede vaciar con presión digital. Una vez localizados, lleve los cuernos uterinos a través de la incisión abdominal para descansar en la pared abdominal.
    4. Usando una sutura absorbible trenzada 3-0, realice una sola ligadura de sutura de cada cuerno uterino aproximadamente 1.5-2.0 cm distal a los cervices. Coloque la sutura sólo medial a las arterias uterinas, que corren a lo largo del aspecto lateral de cada cuerno. Ate las suturas cómodamente para ocluir los cuernos uterinos distales (Figura 1).
  3. Inoculación miometrial VX2
    1. Con una aguja de calibre 27, inyectar 0,5 ml de la suspensión de células VX2 previamente preparada desde cualquiera de los pasos 2.3.2 (para el modelo VX2 cultivado) o 2.4 (para el modelo VX2 in vivo propagado) en el miometrio de cada cuerno uterino proximal al sitio de la sutura (entre el sitio de la sutura) en el miometrio de cada cuerno uterino proximal al sitio de la sutura (entre el sitio de la sutura) en el miometrio de cada cuerno uterino proximal al sitio de la sutura (entre el sitio de la sutura) en el miometrio de cada cuerno uterino proximal al sitio de la sutura (entre el sitio de la sutura) en el miometrio de cada cuerno uterino proximal al sitio de la sutura (entre el sitio de la sutura) y el cuello uterino). Inyecte más de 1 minuto y asegúrese de que las células no se están inyectando en la cavidad uterina subyacente. Anestetizar animales usando isoflurano inhalado (2-5%) y una máquina anestésica con un circuito Bain.
    2. Aplique presión en el lugar de inyección miometrial durante 30 s después de la inyección para minimizar la fuga de células. Inspeccione los sitios de inyección y sutura en busca de hemostasis y coloque los cuernos uterinos de nuevo en el abdomen.
  4. Cierre de la incisión quirúrgica
    1. Cierre profundo de la pared abdominal: Identificar el ápice de la incisión peritoneal y agarrar el peritoneo, el músculo rectus y la fascia con fórceps tisulares.
      1. Para ello, ancle la sutura en un ápice de la incisión suturando superficial a profundo en un lado de la incisión y profundo a superficial en el otro. Ata un nudo. Usando la sutura adjunta, haga puntos de correr perpendiculares a la incisión a través de las capas de la pared abdominal trabajando paso a paso a lo largo de la incisión de lado a lado. Ata la sutura y corta.
    2. Cierre superficial de la pared abdominal: Identificar el ápice de la incisión de la piel y suturar la piel abdominal utilizando sutura de polifilamento absorbible 3-0 enterrada. Aplique pegamento quirúrgico a la incisión cerrada para oponerse a los bordes de la piel.
      1. Para ello, ancle la sutura en un ápice de la incisión, suturando profunda mente a superficial en un lado de la incisión y superficial a profunda en el otro. Ata un nudo. Usando las suturas unidas, haga que los puntos de carrera en la capa dérmica sean paralelos a la incisión trabajando paso a paso a lo largo de la incisión de lado a lado. Ata la sutura y corta.
  5. Atención postoperatoria
    1. Despertar de la anestesia: Apague el isoflurano una vez que la incisión esté cerrada y deje que el conejo respire oxígeno con máscara mientras monitorea si hay signos de despertar (por ejemplo, movimientos espontáneos, apertura de ojos y movimientos de masticación en las vías respiratorias de la máscara laríngea). Extubar el conejo una vez que se observan estos signos y proporcionar oxígeno por máscara y una manta caliente hasta que los conejos estén alerta y capaces de sentarse de forma independiente.
    2. Monitoreo postoperatorio: Monitoree a los conejos dos veces al día durante 4 días y diariamente durante 10 días adicionales después de la operación. Monitorear, evaluar su condición general, su ingesta de alimentos y agua, la producción de orina y fecal, la evaluación del dolor, el peso, los signos vitales (frecuencia cardíaca, frecuencia de respiración) y su sitio quirúrgico en busca de hinchazón, eritema, secreción o dehiscencia.
    3. Control del dolor postoperatorio: Administrar Meloxicam diariamente (0,2 mg/kg SQ) durante 48 h postoperatorio y luego según sea necesario en función de la evaluación del dolor. Administrar buprenorfina inmediatamente después de la operación y cada 12 h (0,01-0,05 mg/kg SQ) durante 24 h y luego según sea necesario en función de la evaluación del dolor
    4. Los antibióticos (enrofloxacina 5mg/kg IM) se pueden administrar diariamente durante siete días después de la operación para prevenir la infección de la herida según lo recomendado por su veterinario. Administrar líquidos subcutáneos (15 ml de SQ) dos veces al día según sea necesario para la deshidratación y alimentos blandos u otros suplementos dietéticos se proporcionan diariamente según sea necesario para bajar de peso.

4. Monitoreo del crecimiento tumoral

  1. Monitorización clínica: Monitoree a los conejos cada 2 días en busca de signos clínicos de crecimiento tumoral a partir del día 14 postoperatorio. Los signos clínicos del crecimiento tumoral pueden incluir disminución de la ingesta oral, letargo, sensibilidad abdominal, masa abdominal palpable y pérdida de cetrofia.
  2. Imágenes y monitoreo invasivo
    1. Tomografía computarizada: En el día 21-28 postoperatorio, premedica, anestesia e intubar conejos como se describió anteriormente en 3.1.1-3.1.2. Coloque los conejos en posición dorsal en un escáner de TC preclínico y obtenga imágenes de la pelvis y el abdomen después de administrar 10 ml de agente de contraste de iohexol intravenoso.
    2. Monitoreo quirúrgico: Transfiera conejos al quirófano después de la toma de imágenes mientras aún están bajo anestesia general. Coloque, prepare y cubra conejos como se describió anteriormente en el paso 3.1.4 y realice una incisión de laparotomía repetida de aproximadamente 1,5 cm de longitud a través de la incisión anterior. Identifique los cuernos uterinos y los uterinos y examine cuidadosamente si hay tumor. Cierre la incisión y proporcione atención postoperatoria como se describió anteriormente en el paso 3.5.2-3.5.4.
    3. Uso del modelo de conejo: Si se detecta que los conejos tienen tumores en el momento de la monitorización quirúrgica, utilice modelos de cáncer de endometrio de conejo para experimentos planificados. Utilice conejos creados a partir de células in vivo propagadas para experimentos adicionales a las 4 semanas de postinoculación y utilice modelos de conejo creados a partir de células VX2 cultivadas a aproximadamente 5-6 semanas después de la inoculación para tener en cuenta un crecimiento tumoral más lento. Eutanasia de los conejos después de que los tumores alcancen 1-1,5 cm de diámetro (medido externamente con pinzas) utilizando un método aprobado por un veterinario. Confirme la eutanasia comprobando los signos vitales, incluida la frecuencia cardíaca y la frecuencia respiratoria. Consube el tumor con instrumentos estériles después de limpiar el área con solución de betadina.

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Resultados

Veintiocho conejos fueron utilizados para la creación del modelo de cáncer de endometrio. Los conejos tenían un peso promedio de 2,83 kg (2,71-3,58 kg) en el momento del experimento. Los tumores uterinos crecieron con éxito en 21 conejos para una tasa general de éxito del modelo del 75%. Antes de la inclusión de la sutura uterina en el protocolo, la tasa de éxito fue del 57% en comparación con el 81% después de que se añadiera la sutura uterina. Sutura uterina se añadió al pro...

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Discusión

En este documento, hemos informado de un método quirúrgico estandarizado para el establecimiento de un modelo de cáncer de endometrio VX2 y reportado sobre el primer uso de células VX2 cultivadas para crear este modelo. La tasa de toma de tumores del 75% es inferior a la tasa del 100% reportada anteriormente en la literatura35,37,53,56; sin embargo, la tasa del 90% de metástasis de ganglio...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este estudio fue financiado por el Terry Fox Research Institute (PPG-1075), el Instituto Canadiense de Investigación Sanitaria (Foundation Grant #154326), el Canadian Cancer Society Research Institute (704718), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, Fundación para la Innovación y Fundación Princesa Margaret contra el Cáncer.

Me gustaría dar las gracias a la Dra. Marguerite Akens por proporcionar las células VX2 iniciales para el establecimiento del modelo VX2 inicial y los bloques tumorales VX2 congelados. Me gustaría agradecer a Marco DiGrappa por ayudar a realizar experimentos iniciales de cultivo celular VX2 y Lili Ding por ayudar con el cultivo celular VX2.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
11-blade scalpel, Sterile, DisposibleAspen Surgical (VWR)80094-086
22-gague ear vein catheterCDMV14332
3-0 absorbable poly-filament suture (Polysorb)Covidien356718
3-0 braided absorbable suture (Polysorb)Covidien356718
70uM cell strainer, Individually wrapped, NylonFalcon352350
Acepromazine (Atravet)CDMV1047
Betadine soap (Poviodone iodine 7.5%)CDMV4363
Betadine solution (Poviodone iodine 10%)UHN Stores457955
BuprenorphineMcGill University
CefazolinUHN in-patient pharmacyNo Cat # Needed
Chlorhexidine solutionCDMV119872
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dishesCorning354450brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 24-well platesCorning354408brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well platesCorning354400brand not important
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mLCorning354234
DMEM/HAM F12 1:1Life Technologies11320brand not important
DMSOCaledon Lab Chem1/10/4100
Enrofloxacin (Baytril injectable)CDMV11242
Falcon TubeCorning Centri-Star430828
Fetal Bovine Serum, Qualified, Canadian Origin, 500mlLife Technologies12483020brand/source not important
IsofluraneUHN in-patient pharmacyNo Cat # Needed
Isohexol contrastGE Healthcare407141210
Meloxicam (Metacam 0.5%)CDMV104674
Normal SalineHouse Brand (UofT Medstore)1011
PBSMulticell or Sigma331-010-CL or D8537-500mL
Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin)Corning-CellgroCA45000-652
Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red)T.C.M.F (Dr Bristow)28-Jan-11
Surgical Glue (Tissue Adhesive)3M Vetbond14695B
Trypsin (0.25%), Proteomics GradeSigmaT-6567-5X20UG
Trypsin-EDTA, 0.05%, 100mlWisent Inc325-542-ELbrand not important

Referencias

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