Un modelo 3D In Vitro y una tubería computacional para cuantificar el potencial vasculogénico de los progenitores endoteliales derivados de iPSC

Resumen

Los progenitores endoteliales derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC-EP) tienen el potencial de revolucionar los tratamientos de enfermedades cardiovasculares y permitir la creación de modelos de enfermedades cardiovasculares más fieles. En este documento, se describe la encapsulación de iPSC-EPs en microambientes tridimensionales de colágeno (3D) y un análisis cuantitativo del potencial vasculogénico de estas células.

Resumen

Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) son una fuente celular proliferativa específica del paciente que puede diferenciarse en cualquier tipo de célula somática. Los progenitores endoteliales bipotentes (EP), que pueden diferenciarse en los tipos celulares necesarios para ensamblar la vasculatura funcional madura, se han derivado de células madre embrionarias e pluripotentes inducidas. Sin embargo, estas células no han sido rigurosamente evaluadas en entornos tridimensionales, y una medida cuantitativa de su potencial vasculogénico sigue siendo esquiva. Aquí, la generación y el aislamiento de iPSC-EPs a través de la clasificación de células activadas por fluorescentes se describen primero, seguido de una descripción de la encapsulación y el cultivo de iPSC-EPs en hidrogeles de colágeno. Este microambiente de imitación de matriz extracelular (ECM) fomenta una respuesta vasculogénica robusta; redes vasculares se forman después de una semana de cultivo. Se delinea la creación de una canalización computacional que utiliza software de código abierto para cuantificar esta respuesta vasculogénica. Esta canalización está diseñada específicamente para preservar la arquitectura 3D del plexo capilar para identificar de forma robusta el número de ramas, los puntos de bifurcación y la longitud total de la red con una mínima entrada del usuario.

Introducción

Las células endoteliales de las venas umbilicales humanas (HUVEC) y otros tipos de células endoteliales primarias se han utilizado durante dos décadas para modelar la brotación de vasos sanguíneos y el desarrollo in vitro¹. Estas plataformas vasculares prometen iluminar los mecanismos moleculares y a nivel tisular de las enfermedades cardiovasculares y pueden presentar información fisiológica sobre el desarrollo de las redes vasculares primitivas^2,3. Aunque el campo del modelado vascular ha sido testigo de avances significativos, un ensayo de "estándar de oro" que puede modelar cuantitativamente y evaluar el desarrollo vascular fisiológico sigue siendo esquiva. La mayoría de los protocolos publicados no recapitulan adecuadamente el nicho vascular para fomentar la formación de vasos sanguíneos maduros y funcionales o no tienen un método para comparar cuantitativamente el potencial vasculogénico de los tipos de células evaluados en tres dimensiones ( 3D).

Muchos modelos vasculares actuales están limitados en su capacidad para imitar el nicho vascular fisiológico. Una de las plataformas in vitro más comúnmente empleadas es el ensayo de formación de tubos a base de mezcla de proteínage. Brevemente, los HUVEC se sembran como células individuales en una capa delgada de gel que consiste en proteínas cosechadas a partir de la matriz extracelular de sarcoma murino (ECM); dentro de uno o dos días, los HUVECse autoensamblan en tubos primitivos 4. Sin embargo, este proceso se produce en dos dimensiones (2D) y las células endoteliales (CE) utilizadas en este ensayo no forman lúmenes huecos cerrados, limitando así la importancia fisiológica de estos estudios. Más recientemente, las CE y las células de apoyo (por ejemplo, células madre mesenquimales (MSC) y pericitas) han sido cocultivadas en microambientes 3D quesimulan la arquitectura fibrosa del ECM nativo, como el colágeno o los hidrogeles de fibrina 5. Para modelar el desarrollo vascular en este microambiente, las perlas poliméricas recubiertas con CE se emplean típicamente⁶. La adición de factores de crecimiento exógenos y/o factores de crecimiento secretados por otras células interstitialmente incrustadas en el hidrogel puede inducir a los CE, cubriendo las cuentas poliméricas, a brotar y formar un solo lumen; el número y el diámetro de los brotes y recipientes se pueden calcular. Sin embargo, estos brotes son singulares y no forman una red cerrada y conectada como se ve en condiciones fisiológicas y, por lo tanto, recuerda más a un modelo de vasculatura tumoral. También se han utilizado dispositivos microfluídicos para imitar el nicho vascular y promover la formación de vasculatura en hidrogeles cargados por LA CE^7,8. Típicamente, un factor de crecimiento angiogénico-gradiente se aplica al medio de cultivo celular circulante para inducir la migración EC y la brotación. Las CE que constituyen el lumen de los vasos desarrollados son sensibles a la tensión de cizallamiento inducida por la aplicación del flujo de fluidos a través del dispositivo microfluídico; por lo tanto, estos dispositivos microfluídicos capturan parámetros fisiológicos clave que no son accesibles en los modelos estáticos. Sin embargo, estos dispositivos requieren costosas capacidades de microfabricación.

Lo más importante es que los tres modelos vasculares (2D, 3D, microfluídicos) utilizan abrumadoramente los CE primarios, así como los tipos de células de soporte primarias. Las células primarias no se pueden desarrollar en una terapia cardiovascular eficaz porque las células generarían una respuesta inmune tras la implantación; además, los HUVEC y tipos de células primarias similares no son específicos del paciente y no capturan anomalías vasculares que se producen en pacientes con una disposición genética o condiciones de salud preexistentes, por ejemplo, diabetes mellitus. Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) han surgido en la última década como una fuente celular proliferativa específica para el paciente que se puede diferenciar en todas las células somáticas del cuerpo humano^9. En particular, se han publicado protocolos que describen la generación y el aislamiento de progenitores endoteliales derivados de la IPSC (iPSC-EP)^10,11; los iPSC-EP son bipotentes y, por lo tanto, pueden diferenciarse aún más en células endoteliales y células musculares lisas/pericitas, los bloques de construcción de la vasculatura funcional madura. Sólo un estudio ha detallado convincentemente el desarrollo de un plexo capilar primario a partir de iPSC-EPs en un microambiente 3D^12; aunque este estudio es fundamental para la comprensión del montaje y la diferenciación de iPSC-EP en hidrogeles naturales y sintéticos, no comparó cuantitativamente las topologías de red de la vasculatura resultante. Otro estudio reciente ha utilizado el modelo de cordón polimérico para comparar la brotación de HUVECs y ECs derivados de iPSC⁵. Por lo tanto, existe una clara necesidad de dilucidar aún más los mecanismos de señalización física y química que regulan la vasculogénesis iPSC-EP en microambientes 3D y determinar si estas células son adecuadas para la terapia isquémica y las enfermedades cardiovasculares Modelado.

En la última década, se han desarrollado diferentes canalizaciones computacionales de código abierto y algoritmos de esqueletización para cuantificar y comparar la longitud de la red vascular y la conectividad. Por ejemplo, Charwat y otros desarrollaron una canalización basada en Photoshop para extraer una imagen filtrada y binariza de redes vasculares derivadas de un cocultivo de células madre derivadas de adiposos y EF de crecimiento en una matriz de fibrina^13,14. Tal vez la herramienta de comparación de topología más utilizada es AngioTool, un programa publicado en línea por el Instituto Nacional del Cáncer¹⁵; a pesar de la adopción generalizada del programa y la fidelidad bien documentada, el programa se limita a analizar estructuras similares a buques en dos dimensiones y otros programas, incluyendo AngioSys y Wimasis, comparten la misma limitación de dimensionalidad¹⁶. Se han desarrollado potentes conjuntos de software como Imaris, Lucis y Metamorph para analizar la topología de red de la microvasculatura de ingeniería; sin embargo, estas suites son prohibitivas para la mayoría de los laboratorios académicos y limitan el acceso al código fuente, lo que puede dificultar la capacidad del usuario final para personalizar el algoritmo a su aplicación específica. 3D Slicer, un paquete de resonancia magnética/tomografía computarizada de código abierto, contiene un kit de herramientas de modelado vascular que puede analizar eficazmente la topología de las redes vasculares 3D¹⁷; sin embargo, el análisis depende de que el usuario coloque manualmente los puntos finales de la red, lo que puede llegar a ser tedioso al analizar un dataset grande y puede verse influenciado por los sesgos subconscientes del usuario. En este manuscrito, se describe en detalle una canalización computacional que puede cuantificar redes vasculares 3D. Para superar las limitaciones anteriores, esta canalización computacional de código abierto utiliza ImageJ para preprocesar imágenes confocales adquiridas para cargar el volumen 3D en un analizador de esqueletos. El analizador de esqueletos utiliza un algoritmo de adelgazamiento del eje medial paralelo, y fue desarrollado originalmente por Kerschnitzki et al. para analizar la longitud y conectividad de las redes de osteocitos¹⁸; este algoritmo se puede aplicar eficazmente para caracterizar la longitud y la conectividad de la microvasculatura de ingeniería.

En conjunto, este protocolo describe la creación de redes microvasculares en microambientes 3D y proporciona una canalización computacional libre de código abierto y sesgo de usuario para comparar fácilmente el potencial vasculogénico de iPSC-EPs.

Protocolo

1. Preparación de medios de cultivo y soluciones de recubrimiento

1. Para preparar la solución de recubrimiento vitronectina, diluir vitronectina 1:100 en la solución salina tamponada de fosfato (DPBS) de Dulbecco.
   ADVERTENCIA: Una vez diluido, no se recomienda almacenar esta solución para su uso futuro.
2. Al recibir la mezcla de proteína gelatinosa reducida en el factor de crecimiento (ver Tabla de Materiales)del fabricante, descondece sobre hielo a 4oC hasta que la mezcla sea transparente y fluida. Manteniendo la mezcla sobre hielo en una campana de flujo laminar, pipeta 75 s de la mezcla en un tubo de microcentrífuga de 1,8 ml y congela inmediatamente a -20 oC. Estas alícuotas se pueden almacenar hasta por un año.
   ADVERTENCIA: Esta mezcla de proteína gelatinosa se vuelve muy viscosa cuando se mantiene a temperatura ambiente y se solidificará a temperaturas más altas. Mantenga esta solución helada.
3. Para preparar esta mezcla para el recubrimiento, descongelar una alícuota de 75 ol sobre hielo y diluir con 6 ml de medio de águila modificado de Dulbecco en frío en hielo: Mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F12). Este volumen preparado es suficiente para recubrir una placa de 12 pocillos.
4. Preparar una solución de 100 mg/ml de magnesio-2-fosfato ácido ascórbico (un polvo liofilizado blanco) en agua ultrapura añadiendo 500 mg de polvo a 5 ml de agua en un vial de centelleo de vidrio de 10 ml. Agitar con una barra de agitación hasta que la solución esté completamente transparente (esto puede tardar hasta una hora). Esta solución se puede almacenar a -20 oC durante un año.
5. Cree un stock de 10 mM de CHIR99021 (CHIR) disolviendo 10 mg de polvo liofilizado en 1.9928 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) en un tubo centrífugo cónico de 15 ml y caliente en un baño de perlas (o agua) de 37 oC hasta que la solución sea transparente. Aliquot en tubos de microcentrífuga de 1,8 ml y almacenar a -20 oC durante un año.
6. Crear un stock de 10 mM de Y-27632, un inhibidor de ROCK (ROCKi), disolviendo 10 mg de polvo liofilizado en 3.1225 ml de dimetil sulfóxido (DMSO) en un tubo centrífugo cónico de 15 ml y calentar en un baño de perlas (o agua) de 37 oC hasta que la solución sea transparente. Aliquot en tubos de microcentrífuga de 1,8 ml y almacenar a -20 oC durante un año.
7. Para preparar el medio Esencial 8 (E8), descongelar suplementos congelados, añadir a la botella de 500 ml de medio basal, y filtrar esterilizar. Esta solución se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de dos semanas.
   ADVERTENCIA: Es muy importante no calentar este medio a 37oC, ya que las proteínas de la formulación media pueden degradarse con un uso prolongado. En su lugar, mantenga este medio a temperatura ambiente durante 15 a 30 minutos antes de su uso.
8. Para preparar el tampón de clasificación, agregue 1,33 ml de albúmina sérica bovina (BSA) al 7,5% en DPBS y 200 ml de ácido etilendiaminetetraacético (EDTA) de 0,5 mM a 48,5 ml de DPBS para crear una solución final de 0,5% de BSA y 2 mM de EDTA.
9. Para preparar LaSR Basal, añadir 300 ml de 100 mg/ml de magnesio ascórbico-2-fosfato y 5 ml de GlutaMAX a 500 ml de DMEM avanzado/F12. Esta solución se puede almacenar a 4 oC durante un mes.
10. Para preparar el crecimiento celular endotelial Medio-2 (EGM-2), suplementos de descongelación y añadir a 500 ml botella de medio basal. Esta solución se puede almacenar a 4 oC durante un mes.
11. Para preparar el tampón de bloqueo, agregue 500 mg de albúmina sérica bovina liofilizada (BSA) y 50 l de un reactivo emulsionante (ver Tabla de Materiales)a 48 ml de DPBS. Incubar a 37 oC durante al menos 15 minutos para asegurarse de que la BSA no se agrupe y, posteriormente, se separe de la solución.

2. Descongelación, mantenimiento y passaging de iPSCs

1. Antes de descongelar un vial crioconservado iPSC, cubra un solo pozo de una placa de 6 pocillos con 1 ml de solución de vitronectina (preparado como se describe en el paso 1.1). Incubar durante una h a temperatura ambiente. No deje que este recubrimiento se seque al aire antes de añadir el medio E8 a la placa.
2. Para descongelar los ISPS, recupere un vial crioconservado de isPSC de su contenedor de almacenamiento de nitrógeno líquido y descondece a 37 oC hasta que quede un pequeño cristal de hielo. Transfiera cuidadosamente (en sentido a la gota) el contenido del vial descondescongelado a un tubo centrífugo cónico de 15 ml que contenga 8 ml de DMEM/F12 helado. Lave el vial descongelado con una adición de 1 ml de DMEM/F12 helado para minimizar la pérdida celular. Centrífuga durante 5 min a 300 x g.
3. Mientras espera la centrífuga, aspirar la solución vitronectina y añadir 1 ml de medio E8 (preparado como se describe en el paso 1.6) al pozo. A continuación, retire el sobrenadante DMEM/F12 del tubo cónico centrifugado y vuelva a suspender el pellet en 1 ml de medio E8. Transfiera las células a la placa recién recubierta, asegurándose de agitar la suspensión para evitar que las colonias se agrupen al sembrar.
4. Por lo general, hay una muerte celular sustancial después de la descongelación. A la mañana siguiente, retire el medio y sustitúyalo por un medio E8 fresco.
   NOTA: Incluso en condiciones óptimas, los iPSC tienden a recuperarse mal de la criopreservación. Se recomienda criopreservar un pozo de 6 ofluentes cercano para futuras semillas en un solo 6 pozos. La presencia de desechos celulares es normal durante los primeros 2-3 días durante la recuperación celular.
5. Reemplace el medio E8 diariamente hasta que las células estén listas para el paso (70%–80% de confluencia).
6. Para el paso, primero prepare los pozos recubiertos con vitrocción (como se describe en el paso 2.1).
   1. Una vez que los pozos recubiertos con vitrocintina estén listos (aproximadamente 1 h), aspirar el medio E8 de pozo a pasar y lavar dos veces con 1 mL de DPBS. Incubar con 1 mL de 0,5 mM EDTA durante 5-7 min a 37oC. Durante la incubación, retire la solución vitronectina del pozo recién recubierto y sustitúyala por 1-2 ml de medio E8.
   2. Retire la solución EDTA de los pozos a pasar y separe las colonias lavándose suavemente una o dos veces con 1 ml de E8. Transfiera 75-200 l de suspensión celular a los pozos recién recubiertos de E8, agite la placa para asegurar una cobertura uniforme y colóquela en la incubadora inmediatamente.
      ADVERTENCIA: El tiempo de incubación para el desprendimiento de iPSC depende de la línea celular; se recomienda que el usuario de este protocolo pruebe un rango de veces al ampliar suficientemente una línea iPSC recibida/generada. 75 l de suspensión celular generalmente resulta en 4 días entre pasajes; 150 o más conducen a 2-3 días entre pasajes.

3. Generación de progenitores endoteliales derivados de iPSC (Figura 1).

1. Al mantener iPSCs, asegúrese de que las colonias están bien compactadas y que hay un bajo número de células diferenciadas en el cultivo. Si las colonias comienzan a ponerse en contacto entre sí, lo más probable es que las células sean demasiado confluentes y necesiten ser pasajes inmediatamente.
2. Cuando los iPSC sis 70%–80% confluentes, cubra una placa de 24 pocillos con la mezcla de proteína gelatinosa (preparada como se describe en 1.2/1.3). Pipetear 250 l de esta mezcla en cada poca y mantener durante 1 h a temperatura ambiente.
3. Durante la incubación de 1 h anterior, retire el medio E8 y el Y-27632 del refrigerador y el congelador, respectivamente. Una vez que el medio E8 y la Y-27632 alcancen la temperatura ambiente, prepare El E8 + ROCKi añadiendo 13 éL de 10 M Y-27632 a 13 mL de E8 en un tubo centrífugo cónico de 15 ml.
4. Retire el medio E8 de los pozos iPSC, lave dos veces con 1 ml de DPBS y luego incubar con EDTA de 0,5 mM durante 5-7 min a 37 oC. Después del período de incubación, retire el EDTA y corte rápidamente las células en una suspensión de una sola célula con una punta de pipeta P1000 con 1 ml de medio E8 + ROCKi.
5. Cuente las células con un hemocaquímetro. Para una suspensión que puede contener millones de iPSCs, agregue 20 s de suspensión celular a 180 s de trippan azul. Determine el número total de celdas en la suspensión de una sola célula.
6. Transfiera 0.432 x 10⁶ a 1.296 x 10⁶ celdas (10⁴ a 3 x 10⁴ células/cm²) al medio E8 + ROCKi restante. Retire el recubrimiento de mezcla gelatinosa de la placa de 12 pocillos recién recubierta y agregue 500 l de suspensión celular a cada poca, asegurándose de que las células estén bien distribuidas y no formen pequeños grumos.
   NOTA: Este rango de densidades es óptimo para la diferenciación de células positivas CD34; sin embargo, estas densidades de sembrado dependen de la línea celular y pueden necesitar ser optimizadas por el usuario de este protocolo.
7. Después de 24 h de cultivo, sustituya el medio por 500 ml de medio Fresco E8. Incubar durante 24 h adicionales en las mismas condiciones.
8. Retire el medio E8 y sustitúyalo por LaSR Basal complementado con 6-12 m de CHIR99021. Este punto de tiempo se define como D0 de diferenciación. Después de 24 h de cultivo, reemplace con el mismo medio de cultivo celular.
   NOTA: Como se describió anteriormente, la cantidad de CHIR99021 agregada a este medio dependerá de la línea iPSC utilizada. Pruebe un rango de concentraciones de CHIR99021 para garantizar resultados óptimos.
9. Después de 48 h de incubación con CHIR99021, reemplazar con 1 mL de LaSR Basal.
10. Reemplace el medio diario por 2 ml de LaSR Basal durante 2-3 días adicionales. En este momento (D5 de diferenciación), una proporción significativa de estas células expresará CD34 y se puede caracterizar como progenitores endoteliales. Un esquema de este protocolo se describe con resultados representativos en la Figura 1 y descrito en su totalidad por los investigadores que publicaron por primera vez este método ^11,19.
    NOTA: Estos progenitores endoteliales se pueden diferenciar aún más a lo largo de un linaje endotelial (35%–99%) o un linaje muscular liso (1%–65%). Las eficiencias de diferenciación varían según el tipo de recubrimiento ECM y el medio de cultivo celular utilizado durante la diferenciación ^20.

4. FACS de progenitores endoteliales

1. Antes de disociar las células diferenciadas D5/D6, prepare el tampón de clasificación como se describe en el paso 1.8 y manténgalo en hielo.
2. Incubar las células diferenciadas con 250 ml de solución de desprendimiento de células por poca (ver Tabla de Materiales)durante 10 min a 37 oC.
3. Disociar las células con una punta de pipeta P1000 en una suspensión de una sola célula en solución de desprendimiento celular. Consolidar la mezcla de solución de desprendimiento de células celulares en un tubo de centrífuga cónica de 15 ml y centrífuga durante 5 min a 300 x g.
4. Retire el sobrenadante y resuspenda en 200 ml de tampón de clasificación helada (preparado como se describe en el paso 1.7. Añadir 5 l del anticuerpo cd34-PE concentrado a la suspensión tampón de clasificación celular e incubar durante 10 min a 4 oC.
5. Vuelva a suspender en 5 ml de tampón de clasificación en frío. Filtrar esta suspensión a través de un colador de células con una tapa de 40 m antes de colocar la clasificadora.
6. En el canal fluorescente adecuado, ordene 10.000 celdas que no hayan sido etiquetadas con un anticuerpo fluorescente. Atraviese una región con una intensidad fluorescente alta que no contenga ninguna de estas 10.000 celdas (Figura1D). Esto servirá como un control negativo.
7. Ejecute el ejemplo que contiene iPSC-EPs etiquetados con una solución fluorescente y comience la ordenación. CD34 está muy expresado en estos progenitores endoteliales y se separa fácilmente de la población principal. Después de la clasificación, transfiera la solución a un tubo de centrífuga cónica de 15 ml y centrífuga durante 5 min a 300 x g. Retire el sobrenadante.
   NOTA: Si la solución está en un tubo más grande que un tubo de microcentrífuga (por ejemplo, un tubo de poliestireno de 5 ml comúnmente empleado en muchos protocolos DE FAB), vuelva a suspender el pellet de célula clasificado en 1 ml de tampón de clasificación y transfiera esta solución a un tubo de microcentrífuga. Centrifugar a 300 x g durante 5 min y quitar el sobrenadante.
   1. Opcional: si se desea una mayor caracterización de iPSC-EP, añada otros anticuerpos primarios (por ejemplo, CD31-APC) simultáneamente con CD34-PE. Asegúrese de que la conversación cruzada entre diferentes canales fluorescentes se minimice.

5. Encapsulación y cultivo a largo plazo de hidrogeles de colágeno cargados de iPSC-EP

1. Preparar el medio de sembrado añadiendo 40 sl de 10x medio 199 a 400 l de medio de crecimiento endotelial (EGM-2) complementado con 10 M Y-27632 en una microcentrífuga de 1,8 ml y colocar el tubo en el hielo.
   NOTA: Si bien se desaconseja el uso de antibióticos para el cultivo de células madre y el mantenimiento de células diferenciadas, se recomienda la dosificación con Pluma/Strep después de la clasificación porque es difícil garantizar la esterilidad en el entorno de clasificación (esto es más imperativo si el clasificador se comparte entre muchos laboratorios).
2. Retire todo el sobrenadante de la suspensión celular y agregue 200 éL de EGM-2 complementado con 10 M Y-27632. Transfiera la suspensión celular al medio de sembrado y mezcle vigorosamente.
3. Añadir 350 ml de colágeno a la solución preparada en el paso 5.2 y mezclar bien. La solución se volverá de color amarillo pálido.
   NOTA: La concentración final de colágeno puede tener un impacto significativo en la formación del plexo capilar. Este protocolo supone que el colágeno se ha suministrado a 10 mg/ml y que los hidrogeles tienen una concentración final de 3,5 mg/ml. Ajustar estos volúmenes para lograr su concentración final de colágeno; se recomienda restringir la concentración final de colágeno de 2 mg/ml a 4 mg/ml.
4. Añadir 5 l de NaOH de 1M a la solución preparada en 5.3 y mezclar bien, evitando la introducción de burbujas de aire. La solución se convertirá en rosa brillante.
5. Pipeta de 56 ml de solución de células de colágeno neutralizadas preparada en 5.4 en pozos individuales de una placa de cultivo de células En U de conexión ultrabaja de 96 pocillos. Incubar a 37oC durante 30 min. Antes de agregar medios, compruebe que las células se han distribuido uniformemente examinando las muestras con un microscopio de campo brillante.
6. Preparar 1 ml de medio de cultivo compuesto por EGM-2 complementado con 10 M Y-27632 y 50 ng/ml de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) añadiendo 1 l de cada solución en stock a un tubo de microcentrífuga. Después de mezclar bien, pipeta 100 l de este medio de cultivo celular en los hidrogeles cargados de células. Transfiera la placa a 37 oC para un cultivo a largo plazo.
7. Reemplazar el medio de cultivo diariamente, añadiendo factores de crecimiento angiogénicos adicionales o inhibidores de moléculas pequeñas según lo dictado por el objetivo del estudio. Para extraer el soporte de forma óptima, incline la placa y utilice una punta P100 para aspirar suavemente el medio sin perturbar el hidrogel.

6. Fijación, inmunomancha y visualización de redes vasculares basadas en EP

1. Después de una semana de cultivo, agregue 250 ml de solución de paraformaldehído (PFA) al 48% a una placa de 48 pocillos. Llenar tantos pozos como hidrogeles. Retire el medio de los hidrogeles (PFA) y utilice pinzas de punta fina para transferir los hidrogeles a los pozos que contienen PFA. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente y eliminar el PFA lavando rápidamente con PBS.
2. Permeabilizar añadiendo 250 ml de 0,5% de un tensioactivo no iónico (ver Tabla de Materiales)durante 5 min a temperatura ambiente. Lavar dos veces con 250 sL de PBS suplementado con 300 mM de glicina. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min para cada paso de lavado para asegurar la eliminación del exceso de detergente. Bloquear sumergiendo los hidrogeles en 250 ml de tampón de bloqueo durante 30 min.
3. Incubar con los anticuerpos primarios deseados diluidos en el tampón de bloqueo durante la noche a 4oC. Por ejemplo, si la inmunomancha con faloideicina y VE-cadherina, diluya 1:40 y 1:200, respectivamente, en el tampón de bloqueo.
4. Al día siguiente, retire la solución primaria de anticuerpos y lave dos veces con un reactivo emulsionante del 0,5% en DPBS. Cubra con papel de aluminio e incubar con un anticuerpo secundario específico de la especie (por ejemplo, 1:200 Alexa Fluor 488 en PBS) durante 2 horas a temperatura ambiente.
5. Retire la solución secundaria de anticuerpos y lávela dos veces con un reactivo emulsionante del 0,5% en DPBS. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min para cada paso de lavado para asegurar la eliminación de fluoróforos libres.
6. Para visualizar los núcleos celulares, diluir 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 1:10000 en PBS y añadir a la muestra(s).
   1. Incubar durante 2 min a temperatura ambiente y lavar dos veces con PBS. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min para cada paso de lavado para asegurar la eliminación de fluoróforos libres.
7. Transfiera las muestras a una angiogénesis o a un plato de petri con fondo de vidrio utilizando pinzas de punta fina. Asegúrese de que no haya burbujas de aire atrapadas debajo del hidrogel.
8. Imagen en un microscopio confocal mediante la adquisición de pilas z que se extienden desde la parte inferior hasta la parte superior de la muestra. Asegúrese de que el detector no esté saturado y de que el aumento más bajo disponible esté en uso (es deseable un campo de visión grande).
   NOTA: Para el procesamiento futuro, asegúrese de que las pilas z se guardan con una compresión mínima (por ejemplo, .czi).

7. Uso de la canalización computacional para analizar y comparar topologías de redes vasculares

1. Inspeccione cada pila z para asegurarse de que los sectores solo contienen recipientes. Abra la pila z en ImageJ y mejore el contraste haciendo clic en Imagen > Ajustar > Brillo/Contraste. Las fronteras de los buques ahora están claramente demarcadas, y el nivel de fondo se minimiza. A menudo, las dimensiones z no coinciden con las dimensiones x/y. Para corregir esto, haga clic en Imagen > Ajustar > Tamaño y cambie el número de sectores z para que la distancia entre cada sector sea equivalente a un píxel en x/a. ImageJ se interpolará automáticamente. Si este paso no se realiza correctamente, los volúmenes 3D finales aparecerán comprimidos.
   ADVERTENCIA: Los CE migrarán hacia los bordes del gel y formarán pequeñas colonias de adoquines. Si bien estos son útiles para estimar los límites del hidrogel, interferirán con el análisis final de la imagen y deben eliminarse.
   NOTA: ImageJ es un software de análisis de imágenes de código abierto basado en Java desarrollado en conjunto por los Institutos Nacionales de Salud y el Laboratorio de Instrumentación Óptica y Computacional. Se recomienda descargar Fiji, que es simplemente ImageJ incluido con plugins útiles (https://fiji.sc/).
2. En ImageJ, desenfoque la imagen en 3 dimensiones haciendo clic en Proceso > Filtros > Desenfoque gaussiano 3D y, a continuación, estableciendo los valores sigma en las 3 dimensiones en 2.0 (este valor podría necesitar ser ajustado por el usuario final).
3. En ImageJ, haga clic en Proceso > Binario > Hacer binario y, a continuación, seleccione un algoritmo de umbral adecuado. El algoritmo de umbral de entropía cruzada desarrollado por Li et al. es eficaz en la separación de los vasos del fondo²¹. Calcule el umbral para cada imagen y establezca el fondo en "Predeterminado".
4. En ImageJ, elimine el ruido no esencial y rellene "agujeros" en lúmenes haciendo clic en Proceso > Ruido > Eliminar valores atípicos.
   NOTA: La eliminación de los valores atípicos "brillantes" rellenará pequeños agujeros en los recipientes conectados; eliminar los valores atípicos "oscuros" eliminará las células muertas. El tamaño del radio de extracción variará en función de la ampliación y el tamaño de los buques. Para las imágenes adquiridas con un objetivo de campo amplio de 512 x 512 píxeles, los radios normalmente oscilarán entre 4 y 6 píxeles.
5. Procesar todos los archivos sin procesar (por ejemplo, extensión czi) y convertir en archivos .tif antes de proceder al paso 7.6. Para ayudar en este procesamiento, se ha adjuntado a este manuscrito una escritura ImageJ, "Binarize and Filter.ijm".
6. Guarde los archivos .tif procesados en la misma carpeta que el archivo "BatchProcessSkeleton.m", disponible para su descarga en el manuscrito. Este guion, desarrollado por los autores, llama a las funciones publicadas por Phillip Kollmannsberger²² y lleva a cabo alguna sobra de manipulación de archivos adicional.
7. Descargue y descomprima todos los archivos asociados con las dos funciones principales "Skel2Graph3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43527-skel2graph-3d) y "Skeleton3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43400-skeleton3d). Guarde todas las funciones en la misma carpeta que la pila z procesada abierta.
8. Abra un entorno de computación numérica multiparadigma (consulte Tabla de materiales) y vaya a la carpeta donde se han guardado todos los archivos descritos anteriormente.
9. Ejecute "BatchProcessSkeleton.m" escribiendo BatchProcessSkeleton en la ventana de comandos o abriendo el script y pulsando el botón Ejecutar (flecha verde orientada a la derecha) en el Editor.
   NOTA: Para analizar un dataset grande con un solo comando, asegúrese de que la cadena dentro de la función dir en la línea 6 contenga un asterisco (por ejemplo, '*.tif'). De lo contrario, reemplace el asterisco por el nombre de archivo si desea el análisis de un único archivo.
10. El tiempo que este script tardará en ejecutarse variará sustancialmente en función de la potencia informática disponible. Se recomienda realizar este análisis en un equipo con al menos 8 GB de RAM para que el usuario pueda acceder a otros programas mientras se ejecuta el script.
    ADVERTENCIA: Aunque no es estrictamente necesario, graficar la adquisición confocal original (en gris) y superponerse con esta matriz de imagen con la matriz de esqueleto (en rojo) puede ayudar a evaluar el rendimiento del algoritmo de esqueletización. Además, el lector puede crear un gráfico nodal, tal como lo implementa Kollmannsberger et al., para evaluar la precisión del análisis de red. La creación de ambos gráficos, aunque útil, aumentará drásticamente el tiempo de ejecución del script y requerirá memoria adicional; si el usuario simplemente requiere un análisis de topología final y no desea visualizar el conjunto de datos, simplemente comente las líneas 44 a 61 (gráfico de esqueleto) y las líneas 104 a 143 (gráfico de topología).
11. Al finalizar, la matriz De datos, visible en el espacio de trabajo, ahora contiene los datos procesados. Haga doble clic en Datos y abra esta celda en el editor de variables.
    1. Tenga en cuenta que esta matriz contendrá, de izquierda a derecha: 1) el nombre del archivo, 2) el número de nodos (puntos de bifurcación + puntos finales), 3) puntos de bifurcación, 4) enlaces (es decir, buques), 5) longitud de red (incluidos los recipientes aislados) y 6) el número de sectores contenidos en la pila z. Guarde estos datos como un archivo .csv y exporte para su posterior análisis a cualquier software de su elección.

Resultados

Despuésde la diferenciación (Figura 1), FACS y encapsulación de iPSC-EPs en hidrogeles de colágeno, las células normalmente permanecerán redondeadas durante 24 horas antes de comenzar a migrar y formar lúmenes iniciales. Después de unos 6 días de cultivo, un plexo capilar primitivo será visible en el hidrogel cuando se vea con microscopía de campo brillante (Figura2). Después de tomar imágenes de los hidrogeles fijos...

Discusión

Este protocolo implica el cultivo a largo plazo de células en tres tipos de medios de cultivo celular: E8, LaSR Basal y EGM-2. Por lo tanto, se debe tener mucho cuidado para esterilizar adecuadamente todos los materiales. Además, las batas de laboratorio y los guantes limpiados con etanol siempre deben usarse cuando se trabaja en la campana de flujo laminar del laboratorio. Se recomienda realizar pruebas frecuentes de contaminación por micoplasma; si se observa una gran cantidad de escombros durante el cultivo de iPSC...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Slide Angiogenesis	Ibidi	N/A	A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging
96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile	Corning	7007	Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish
Accutase	STEMCELL Technologies	7920	Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS
Advanced DMEM/F12	Thermo Scientific	12634010	The base media for iPSC-EP differentiation.
Barnstead GenPure xCAD Plus	Thermo Fisher Scientific	50136165	Water purification system; others can be readily substituted
Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture	Fisher Scientific	A8412	To preserve cell viability when FACs sorting
CD34-PE, human (clone: AC136)	Miltenyi Biotec	130-098-140	Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs
CHIR99021	LC Laboratories	C-6556	Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells
Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg	VWR	354249	Main component of the 3D microenvironment
Conical centrifuge tubes (15/50 mL)	Fisher Scientific	14-959-49D/A	Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher Scientific	D1306	To counterstain and visualize cell nuclei
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11320-082	For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	ThermoFisher	14190-250	To wash monolayer cultures
EDTA	Sigma-Aldrich	E8008	For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting
Endothelial Cell Growth Medium 2	PromoCell	C-22011	Promotes endothelial cell viability and proliferation
Essential 8 Medium	Thermo Fisher Scientific	A1517001	For maintenance of pluripotent stem cells
Glycine,BioUltra, for molecular biology, >=99.0% (NT)	Sigma-Aldrich	50046	Neutralizes remaining detergent
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,>=95%	Sigma-Aldrich	A8960	Component of iPSC-EP differentiation medium
MATLAB	MathWorks	1.8.0_152	Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions)
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture)	Fisher Scientific	356231	Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation
Medium-199 10X	Thermo Fisher Scientific	1825015	Used to balance final hydrogel osmolarity and pH
Microcentrifuge tubes (1.7 mL)	VWR	87003-294	Stores small volumes of reagents
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P3813	The main ingredient of the immunostaining solutions
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122	Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument
Recombinant Human VEGF 165 Protein	R&D Systems	293-VE	Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis
Rhodamine phalloidin	Themo Fisher Scientific	R415	To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks
Triton X-100 (nonionic surfactant)	Sigma-Aldrich	X-100	Detergent used to gently permeabilize cells
Tween-20 (emulsifying reagent)	Fisher Scientific	BP337	Increases the binding specificity of the added antibodies
VE-Cadherin (F-8)	Santa Cruz Biotechnology	sc-9989	To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels
Vitronectin	ThermoFisher	A14700	For maintenance of pluripotent stem cells
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded