Un modelo de ratón ortotópico inducido por hepatocitos oncogénicos que surge en el ajuste de la inflamación hepática y la fibrosis

Resumen

Aquí, describimos el desarrollo de un modelo murino clínicamente relevante de cáncer de hígado recapitulando las características inmunitarias típicas del cáncer hepatocelular (HCC).

Resumen

La ausencia de un modelo animal clínicamente relevante que aborde las características inmunitarias típicas del cáncer hepatocelular (HCC) ha impedido significativamente el esclarecimiento de los mecanismos subyacentes y el desarrollo de estrategias inmunoterapéuticas innovadoras. Para desarrollar un modelo animal ideal recapitulando HCC humano, los ratones machos inmunocompetentes C57BL/6J reciben primero una inyección de tetracloruro de carbono (CCl₄) para inducir fibrosis hepática, luego reciben hepatocitos oncogénicos histológicamente normales de machojoven joven Ratones transgénicos de antígeno SV40 T (TAg) (MTD2) por inoculación intraesplénica (ISPL). Los andrógenos generados en ratones machoreceptores en la pubertad inician la expresión de TAg bajo el control de un promotor específico del hígado. Como resultado, los hepatocitos transferidos se convierten en células cancerosas y forman masas tumorales en el entorno de la fibrosis/cirrosis hepática. Este novedoso modelo imita la iniciación y progresión humana de hCC en el contexto de la fibrosis/cirrosis hepática y refleja las características más típicas de la HCC humana, incluida la disfunción inmune.

Introducción

El cáncer hepatocelular (HCC) es el tipo de cáncer que aumenta más rápidamente en los Estados Unidos (EE.UU.)^1,2,3. Cada año, aproximadamente 850.000 nuevos casos se diagnostican^4,5 y 700.000 pacientes mueren a causa de esta enfermedad letal^6,7,8,9,10 , lo que la convierte en la segunda causa más alta de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo. El manejo de HCC incluye resección quirúrgica, trasplante, ablación, quimioembolización o terapias sistémicas, como sorafenib¹¹. El diagnóstico y el manejo tempranos con resección quirúrgica o trasplante tienen el mayor beneficio de supervivencia global⁴. Desafortunadamente, la mayoría de los pacientes se presentan en una etapa posterior y requieren tratamiento con ablación, quimioembolización o sorafenib^12. Sorafenib, un inhibidor receptor de tirosina quinasa (RTKI), fue aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos en 2008 como la única terapia de medicamentos sistémicos disponible para el tratamiento de HCC no resecable. Aunque el fármaco sólo proporciona un aumento modesto en la supervivencia global, de 7.9 a 10.7 meses¹³, proporcionó una nueva estrategia terapéutica que podría ser utilizado para manejar HCC.

Manipular el sistema inmunitario para eliminar los cánceres establecidos es un campo de rápido crecimiento en la investigación del cáncer¹⁴. Los estudios de punto de control inmune han avanzado considerablemente el desarrollo de fármacos inmunoterapéuticos en el tratamiento del cáncer^15,16. La FDA aprobó el uso de anticuerpos (Abs) contra el antígeno t-linfocitos T citotóxico 4 (CTLA-4), la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1), y su ligando PD-L1 para el tratamiento del melanoma, el cáncer de pulmón, el cáncer de cabeza y cuello, y el cáncer de vejiga^{17, 18 , 19 , 20}. Los ensayos clínicos de monoterapia o terapia combinada con uno o varios anticuerpos contra PD-1, PD-L1 o CTLA-4 para el tratamiento de la HCC avanzada están en curso^21,22,23,y algunos ensayos han mostrado resultados favorables. En 2017, la FDA otorgó la aprobación acelerada para el anticuerpo anti-PD-1 para tratar a los pacientes con HCC, que son resistentes a sorafenib, pero la tasa de respuesta general de esta terapia es de sólo 14.3%. Otras estrategias no se han traducido en la práctica clínica en este momento^24,25. Superar la tolerancia inmune profunda inducida por tumores para mejorar la terapia de punto de control inmune²⁶; predecir la eficacia de la terapia de punto de control inmune; prevenir eventos adversos relacionados con el sistema inmunitario; optimizar la ruta de administración, la dosis y la frecuencia; y encontrar combinaciones efectivas de terapias^27,28,29 siguen siendo tareas extremadamente desafiantes.

Hay varios enfoques convencionales utilizados para inducir HCC en modelos de ratón actualmente y se utilizan dependiendo de la pregunta de investigación particular del investigador³⁰. Los modelos de ratón HCC inducidos químicamente con compuestos genotóxicos imitan la neoplasia maligna inducida por lesiones. Los modelos de xenoinjerto a través de la implantación ectópica u ortotópica de líneas celulares HCC son adecuados para la detección de fármacos. Varios ratones modificados genéticamente han sido diseñados para investigar la fisiopatología del HCC. Los ratones transgénicos que expresan genes virales, oncogenes y/o factores de crecimiento permiten la identificación de las vías implicadas en la hepatocarcinogénesis. Debido a las limitaciones inherentes, estos modelos no recapitulan las características inmunitarias típicas que se ven en el HCC humano, lo que ha impedido significativamente el esclarecimiento de los mecanismos subyacentes y el desarrollo de estrategias inmunoterapéuticas innovadoras^{14 ,15}. Recientemente hemos creado un modelo murino clínicamente relevante. Este nuevo modelo no sólo imita la iniciación y progresión humana de HCC, sino que también refleja las características más típicas de la enfermedad humana, incluida la disfunción inmune. Hemos caracterizado sus características biológicas e inmunológicas. Aprovechando este novedoso modelo, hemos explorado diversas estrategias inmunoterapéuticas para tratar HCC^{31,32,33,34,35,36, 37}. Esta plataforma única nos permite estudiar mecanismos de inmunotolerancia inducida por tumores y desarrollar estrategias terapéuticas de prueba de concepto para HCC hacia la posterior traducción clínica.

Protocolo

NOTA: Todo el procedimiento, incluidos los sujetos de animales, ha sido aprobado por la IACUC de la Universidad de Missouri. Todos los ratones recibieron atención humana de acuerdo con los criterios descritos en la "Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio". El siguiente procedimiento para el aislamiento celular y la inoculación se debe realizar en una campana. Todos los artistas deben usar el equipo de protección personal estándar para el manejo de los ratones y tejidos.

1. Inducción de fibrosis hepática y cirrosis con inyección IP de tetracloruro de carbono (CCl₄)

NOTA: Vea la Figura 1. (CCl₄ es un reactivo altamente peligroso, debe manipularse con cuidado y con guantes resistentes a productos químicos)

1. Obtener ratones macho C57BL/6J de seis a ocho semanas de edad (ver Tabla de Materiales).
2. Preparar 10% CCl₄ (v/v) solución en aceite de maíz en un tubo centrífugo. Determinar el volumen total en función del número de ratones a inyectar (ver paso 1.6).
3. Utilice la técnica de manejo de ratones adecuada para seleccionar un ratón para inyección.
4. Retenga manualmente el ratón con su lado dorsal (abdomen) hacia arriba.
5. Limpie el lugar de inyección en la pared abdominal del ratón frotando con 70% de alcohol.
6. Inyectar ratones macho C57BL/6J con 160 ml de 10% CCl₄ solución por inyección intraperitoneal (IP) utilizando una aguja desechable de calibre 25.
7. Asegúrese de que la aguja penetre justo a través de la pared abdominal (aproximadamente 4-5 mm) con bisel hacia arriba y ligeramente inclinado a 15-20 grados.
8. Inyectar ratones dos veces por semana durante un total de cuatro semanas: cada ratón recibirá un total de ocho inyecciones.
   NOTA: Dos semanas después de la última inyección, los ratones tratados están listos para la inoculación ISPL de hepatocitos oncogénicos de ratones MTD2.

2. Aislar los hepatocitos transgénicos en etiquetas de ratones MTD2 de línea

NOTA: Consulte la Tabla 1 para ver las recetas de la solución.

10x Solución de sal equilibrada de Earle sin Ca o Mg (EBSS sin Ca o Mg)	4 g KCl 68 g NaCl 1.4 g NaH2PO4 H2o 10 g dextrosa Añadir agua a 1 litro, pH a 4.32 Pasar a través del filtro
Solución 1	20 mL 10x EBSS sin Ca o Mg 44 g NaHCO3 1.33 mL 1.5M Hepes 10 mL de 10 mL EGTA Añadir agua a 200 ml
Solución 2	100 mL 10x EBSS 2.2 g NaHCO3 6,67 ml 1,5 M Hepes Añadir agua a 1 litro
0.75% solución de colagenasa	15 mg de colagenasa tipo 1 20 ml de solución 2
Medio completo	2 RPMI 50 mL FBS 5 mL 100x Penicilina-Estreptomicina

Tabla 1: Recetas de solución.

1. Obtenga la línea MTD2 ratones³⁸ para servir como la fuente de hepatocitos oncogénicos.
2. Anestetizar ratones MTD2 de 5 semanas de edad usando 2.5% isoflurano.
   NOTA: La anestesia adecuada se comprobará mediante el método de pellizcar de los dedos del dedo del pecho. En resumen, con dos dedos, dar al dedo del ratón / pie un buen apretón. Si no hay reacción de abstinencia, el animal es juzgado lo suficientemente profundo como para comenzar la cirugía.
3. Cuando esté ndado adecuadamente, coloque los ratones en una posición supina y fije las extremidades con cinta adhesiva para proporcionar una exposición adecuada de la superficie abdominal.
4. Realizar una incisión de laparotomía de línea media utilizando tijeras a lo largo de la longitud de la línea alba lo suficientemente grande como para proporcionar una exposición adecuada del hígado.
5. Desplazar los intestinos hacia la izquierda para proporcionar una mejor exposición del hígado y la tríada del portal.
6. Diseccionar por encima del hígado para exponer la vena cava inferior (IVC).
7. Ligar el CIV por encima del hígado usando una abrazadera arterial.
8. Volviendo al borde inferior del hígado, utilice una aguja de mariposa (ver materiales) para obtener acceso IV a la vena porta. Fije el catéter a mano.
9. Perfundie sucesivamente el hígado del ratón utilizando una jeringa de inyección a 8,9 ml/min con 15 ml de solución 1, 15 ml de solución de colagenasa al 0,75% 2 y 15 ml de solución 2 a través del catéter.
10. Cosecha el hígado perfundido cortando y tomando la masa tumoral de ratones MTD2 en un tubo cónico de 50 ml con 10-15 ml de PBS.
11. Retire PBS y lave un tiempo adicional con PBS; no centrifugar en este paso.
12. Corta el hígado en trozos más pequeños usando tijeras y luego lávate de nuevo con PBS 2x para eliminar la sangre restante.
13. Añadir 5 ml de medio RPMI completo al tubo cónico y picar continuamente el hígado con tijeras a trozos pequeños (<3 mm)-tejido debe pasar suavemente a través de una pipeta de 5 ml.
14. Agregue RPMI completo a un volumen final de 30 ml y suspenda el hígado con una pipeta de 5 ml.
15. Filtrar la solución mixta con un colador de 70 m en un tubo cónico de 50 ml.
16. Lave el colador varias veces con RPMI completo y ajuste el volumen final a 50 ml añadiendo medio RPMI adicional.
17. Gire rápidamente la suspensión centrífuga hasta un máximo de 500 rpm; una vez que la velocidad se acelera a 50 x g, la centrífuga debe ser detenida.
18. Decantar los gránulos sobrenadant y suspender en 20 mL de PBS.
19. Cuente las celdas usando la exclusión azul de Trypan y un hemocitómetro, luego ajuste la concentración celular a 2.5 x 10⁶/mL para la siguiente inoculación celular.
    NOTA: El rendimiento esperado de 5 gramos de tejido tumoral es de 80 millones de hepatocitos con viabilidad >95%.

3. Inocular los hepatocitos de ratones MTD2 al hígado de ratones salvajes de tipo C57BL/6J por inyección de ISPL

1. La técnica aséptica debe utilizarse en todos los procedimientos
2. Anestetizar los ratones macho C57BL/6J tratados con CCl₄con 2,5% de isoflurano, los ratones deben ser tratados con lubricante para los ojos para evitar que los ojos se sequen.
3. Prepare jeringas con 200 ml de hepatocitos inyectables.
4. Cuando esté ndado adecuadamente, coloque los ratones con el lado izquierdo hacia arriba.
5. Afeitar todo el flanco izquierdo de los ratones, luego fregar el área, alternando entre 70% de alcohol y betadina tres veces.
6. Administrar 5 mg/kg de carprofeno subcutaneouly antes de la incisión quirúrgica.
7. Hacer una incisión de 1 cm en el flanco izquierdo paralelo a la^costilla 13 desde el extremo dorsal que comienza justo debajo del músculo de la columna vertebral.
8. Identifique el bazo y, a continuación, exteriorícelo con fórceps contundentes.
9. Sujete el bazo con dos clips de titanio de tamaño medio. Coloque ambos clips entre la arteria esplénica y la vena, deje espacio entre los clips para cortar más tarde después de la inoculación.
   NOTA: El objetivo es aislar el polo inferior del bazo para reducir el riesgo de sembración.
10. Inyectar 200 l (0,5 millones) de los hepatocitos preparados en el polo inferior del bazo utilizando una aguja de 27 G.
11. Sujete la rama inferior del pedicular (vasos de poste esplénico inferior) con un clip de tamaño medio.
12. Corte el bazo entre los dos clips colocados inicialmente.
13. Retire el polo inferior del bazo que se inyectó directamente con células tumorales.
14. Utilice 3-0 poliglactina 910 con sutura interrumpida para cerrar la capa muscular interna.
15. Utilice clips de acero esterilizado para cerrar la capa externa de la piel.
    NOTA: Los clips de acero se prefieren sobre las suturas para evitar que los animales mastiquen suturas, dejando una herida abierta.
16. Administrar 5 mg/kg de carprofeno por vía subcutánea después de la sutura.
17. Coloque todos los animales en recuperación en una almohadilla de calentamiento con temperatura controlada y monitoree de cerca hasta que se recuperen completamente de la anestesia.
18. Dé a los ratones acceso gratuito al agua después de la cirugía. Si el ratón se deshidrata durante la cirugía, administre líquidos subcutáneos (<1 ml).
19. Retire los clips de piel a los 7-10 días posteriores a la operación.

Resultados

Los hepatocitos oncogénicos aislados de ratones transgénicos tag(Figura 2) fueron sembrados en el hígado de ratones de tipo salvaje por inyección intraesplénica(Figura 3). Los hepatocitos trasplantados crecieron con éxito y de forma fiable tumores ortotópicos de HCC(Figura 4) con antígeno específico tumoral SV40 TAg (Figura 5) en el entorno de inflamación hepática y fibrosis (Figura 1).

Discusión

Con este protocolo, hemos establecido un modelo murino fiable y reproducible de HCC que imita la iniciación y progresión humana de HCC. Clínicamente, muchos factores de riesgo inducen sucesivamente lesiones hepáticas, fibrosis hepática, cirrosis y la etapa final del HCC. En nuestro protocolo, la inyección IP de CCl₄ se utiliza primero para producir fibrosis hepática en ratones de tipo salvaje, lo que permite que los posteriores hepatocitos oncogénicos formen los tumores en el entorno de la fibrosis hep...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia machine	VETEQUIP	IMPAC6	anesthesia machine for surgery
Butterfly needle	BD	8122963	Needle used for liver perfusion
C57BL/6 mice	Jackson Lab	000664	mice used in prototol
Carprofen	CRESCENT CHEMICAL	20402	carprofen for pain release
Cell Strainer	CORNING	REF 431751	Cell strainer, 70µm, for hepatocytes isolation
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-30R	centrifuge for cell isolation
Clips	Teleflex Medical	REF 523700	Titanium Clips for spleen
Microscope	Zeiss	Primovert	microscope for cell observation
Mtd2 mice	N/A		Gift from Dr. William A Held at roswell Park Cancer Institute in 2002, maintained in our lab
Needle	BD	REF 305109	BD precisionglide needle, 27G x 1/2 (0.4mm x 13mm)
Suture	ETHICON	J303H	coated VICRYL suture
SV40 T Ag antibody	Abcam	ab16879	anti-SV40 T-antigen antibody for IHC
Syringe	BD	REF 309626	1 mL TB syringe for cell injection
Trypan blue	SIGMA	T 8154	Trypan blue solution for cell viability test
Wound clips	Reflex	reflex9, Part. No. 201-1000	stainless steel wound clips for wound close