Perfilado e identificación de nitropéptidos ilustrados por Angiotensin A II

Resumen

El perfilado proteómico de las proteínas nitratodeadas por tirosina ha sido una técnica desafiante debido a la baja abundancia de la modificación de 3-nitrotirosina. Aquí describimos un enfoque novedoso para el enriquecimiento y perfilado de nitropéptidos mediante el uso de Angiotensin II como modelo. Este método se puede extender para otros sistemas in vitro o in vivo.

Resumen

La nitración proteica es una de las modificaciones post-traduccionales más importantes (PTM) en residuos de tirosina y puede ser inducida por acciones químicas de especies reactivas de oxígeno (ROS) y especies reactivas de nitrógeno (RNS) en células eucariotas. La identificación precisa de los sitios de nitración en las proteínas es crucial para comprender los procesos fisiológicos y patológicos relacionados con la nitración de proteínas, como la inflamación, el envejecimiento y el cáncer. Dado que las proteínas nitradas son de baja abundancia en células incluso en condiciones inducidas, no se han desarrollado métodos universales y eficientes para la elaboración de perfiles e identificación de sitios de nitración proteica. Aquí describimos un protocolo para el enriquecimiento de nitropéptidos mediante el uso de una reacción de reducción química y etiquetado de biotina, seguido de espectrometría de masas de alta resolución. En nuestro método, los derivados de nitropéptidos se pueden identificar con alta precisión. Nuestro método exhibe dos ventajas en comparación con los métodos reportados anteriormente. En primer lugar, el etiquetado de dimetil se utiliza para bloquear la amina primaria en nitropéptidos, que se puede utilizar para generar resultados cuantitativos. En segundo lugar, se utiliza un enlace de disulfuro que contiene reactivo de biotina NHS para el enriquecimiento, que se puede reducir y alquilar aún más para mejorar la señal de detección en un espectrómetro de masas. Este protocolo se ha aplicado con éxito al péptido modelo Angiotensin II en el documento actual.

Introducción

La nitración de residuos de tirosina en proteínas para formar 3-nitrotirosina regula muchos procesos biológicos. Debido a las diferentes propiedades químicas entre tirosina y 3-nitrotirosina, una proteína nitrada puede haber perturbado la actividad de señalización^1,2. Por lo tanto, es importante desarrollar métodos que puedan enriquecer e identificar los sitios de nitración en las proteínas de manera eficiente. Como la 3-nitrotirosina es una modificación de baja abundancia en las proteínas en comparación con otras formas de PTM, como la fosforilación y la acetilación, es difícil identificar los sitios de nitración endógenas directamente a partir de líneas celulares o muestras de tejido. Sin embargo, se ha desarrollado la metodología de uso de espectrometría de masas (Em) para caracterizar el patrón de fragmentación del nitrotpéptido (por ejemplo, Zhan & Desiderio³), que sienta las bases para nuevos métodos de nitroproteómica.

Actualmente, un paso de enriquecimiento seguido por la EMes la estrategia más poderosa para el perfilado de nitropéptidos 4,^5. Los métodos de enriquecimiento se pueden clasificar en dos clases. Una clase se basa en anticuerpos que pueden reconocer 3-nitrotirosina específicamente, mientras que la otra clase se basa en la derivación química que reduce un grupo de nitro a un grupo de aminas^4,5. Para el método basado en anticuerpos, la columna de afinidad de nitrotyrosina se utiliza para el enriquecimiento, a partir del cual el material eludado se resuelve y analiza más adelante por la alta resolución MS^6,7. Para el método basado en derivación química, los grupos de amina en el N-terminus del péptido o lisina deben ser bloqueados en el primer paso ya sea por acetilación, etiquetas isobáricas para la cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ), o reactivos de etiquetas de masa en tándem (TMT). A continuación, se utiliza un reductor para reducir la nitrotirosina a la aminotyrosina seguido de la modificación del grupo de aminas recién formado, que incluye ligadura de biotina, conversión de péptido sulfícula u otros tipos de sistemas de etiquetado^{8,9, 10,11}. La mayoría de los protocolos establecidos hasta ahora se basan en proteínas con sobrenitrato in vitro, en lugar de proteínas nitratos endógenas.

En el presente estudio, se desarrolla un procedimiento modificado de derivación química de nitrotirosina para el enriquecimiento e identificación de nitropéptidos, que muestra una mayor sensibilidad durante la detección de LA MS y es adecuado para fines de cuantificación. Nuestro estudio reciente que emplea este método en sistemas biológicos identificó que la nitración de la tetirosina quinasa de proteína específica de linfocitos (LCK) en Tyr394 por RNS producido a partir de células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) juega un papel importante en el inmunosupresión del microambiente tumoral¹². Por lo tanto, nuestro método de identificación de nitropéptidos también se puede aplicar a muestras biológicas complejas. Aquí, describimos nuestro protocolo utilizando el péptido modelo Angiotensin II, del cual el patrón de fragmentación es conocido y ampliamente utilizado en estudios nitroproteómicos^8,9,10,11, como ejemplo.

Protocolo

1. Nitration of Angiotensin II

1. Para generar solución primaria de péptido nitrado, diluir 10 ml de solución padre de angiotensina II (DRVYIHPF) (2 mM en agua) en una solución de PBS de 390 ml (10 mM NaH₂PO_4,150 mM naCl, pH 7.4) a la concentración final de 50 oM.
2. Añadir 10 l de peroxinitrita (200 mM en 4,7% NaOH) a la solución de Angiotensina II para realizar la concentración final de peroxinitrita de 5 mM.
   NOTA: La peroxinitrita es inestable y fácil de resolver cuando está en forma ácida, por lo que la solución padre de peroxinitrita se mantiene en solución básica y se almacena en -80 oC.
3. Ajuste el valor de pH de la solución a 7-8 por 1 M HCl. Para iniciar la reacción de la nitración, agitar el tubo a 400 rpm durante 5 minutos.
4. Utilice una columna SPE de fase inversa disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales)para la desalación.
   1. Preparar 2 soluciones para la desalación, 5% de metanol en agua para el lavado y 80% de metanol en agua para la elución.
   2. Añadir 500 l de metanol, seguido de 500 l de agua para pre-acondicionar la columna, poner 1 mL pipeteador con la punta en la parte superior de la columna, presione el pipeteador para acelerar el flujo.
   3. Cargue 410 l de la muestra en el paso 1.3 de la columna, deseche el flujo.
   4. Después de lavar con 500 s de metanol al 5%, utilice 300 ml de metanol al 80% para eluir el nitropéptido, que luego se seca completamente por la velocidad-vac en el ajuste predeterminado a temperatura ambiente.
      NOTA: La desalación es muy importante para las reacciones, ya que el disolvente dejado en el paso anterior puede tener un efecto negativo en los siguientes pasos.

2. Alquilación de aminas primarias por etiquetado de dimetil

1. Reconstituir la solución de nitro-angiotensina II en polvo en 100 ml de trietilammonio de 100 mM (TEAB).
   NOTA: El valor de pH de la solución debe estar entre 7 y 9, y asegúrese de que no se añade ninguna amina primaria en la solución.
2. Añadir 4 sL de 4% de formaldehído a la solución, mezclar brevemente.
   ADVERTENCIA: Los vapores de formaldehido son tóxicos; realizar los experimentos en una campana de humo.
3. Añadir 4 l de 0,6 M NaBH₃CN a la solución, agitar el tubo a 400 rpm durante 1 h a temperatura ambiente.
4. Atemple la reacción de etiquetado añadiendo 16 sl de solución de amoníaco al 1%, incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
5. Añadir 8 l de ácido fórmico para acidificar la solución y realizar la desalación utilizando la columna SPE de fase inversa como se describe en el paso 1.4.

3. Reducción de la nitrotirosina a la aminotirosina

1. Reconstituir el dimetil etiquetado nitro-angiotensina II en 500 oL de PBS (10 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, pH 7.4).
2. Añadir 10 ml de ditiónantia de sodio de 1 M a la solución e incubar a temperatura ambiente durante 1 h. Después de la reacción de reducción, el color amarillo de la solución se vuelve claro.
   NOTA: Pesar 174,1 mg de ditión de sodio y disolverlo en agua para hacer que el volumen final sea de 1 ml. Esta solución se puede almacenar a -20 oC no más de una semana.
3. Utilice la columna SPE de fase inversa para la desalación como se describe en el paso 1.4.

4. Biotinylación, enriquecimiento y detección

1. Reconstituir el dimetil etiquetado amino angiotensina II en 500 l de PBS (10 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, pH 7.4).
2. Añadir 5 l de 40 nM NHS-S-S-biotina, disuelto en DMSO, a la solución, después de 2 h de incubación a temperatura ambiente, utilizar 1 l de hidroxilamina al 5% para saciar la reacción.
3. Mientras tanto, equilibra las perlas de agarosa de estreptavidina añadiendo 500 éL de PBS (10 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, pH 7.4), centrifugando a 580 x g durante 5 min a temperatura ambiente y descartando el sobrenadante. Realice el equilibrio 3 veces.
4. Añadir 100 l de estreptavidina de agarosa al sistema de reacción, incubar 1 h en una coctelera rotativa a temperatura ambiente. Lavar 4 veces con PBS (10 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, pH 7.4). Para cada paso de lavado, añadir 500 sl de PBS a las perlas, mezclar bien, luego centrifugar a 580 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente y deseche el sobrenadante.
5. Utilice 400 éL de ditiothreitol de 10 mM (TDT) para incubar con perlas de agarosa a 50 oC durante 45 min, girar a 580 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente y desechar las perlas, añadir 20 ml de 0,5 M idotamiacede (IAM) al supernadante durante 20 minutos de oscuridad.
   NOTA: La TDT se utiliza para romper el vínculo de disulfuro entre el enlace de la biotina y el péptido, este último se libera de las cuentas y se alquila aún más por IAM.
6. Utilice la columna SPE de fase inversa para la desalación que se muestra en el paso 1.4.
7. Después de resolver los péptidos secos en 20 ml de ácido fórmico (FA) al 0,1%, someta el producto de cada sección a cromatografía líquida con análisis de espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS).
   1. Separe los péptidos Ang II modificados por una elución de gradiente de 60 minutos (0-8 min, 2% B; 8-10 min, 5% B; 10-35 min, 18% B; 35-50 min, 28% B; 50-52 min, 80% B; 52-58 min, 80% B; 58-59 min, 2% B; 59-60 min, 2% B) a un caudal 0.300 l/min con sistema nano-HPLC que se interconecta directamente con el espectrómetro de masas de alta resolución.
      NOTA: La columna analítica está en ID de 75 mm, 150 mm de longitud, embalado con resina C-18. La fase móvil A consistía en 0,1% de ácido fórmico, y la fase móvil B consistía en 100% acetonitrilo y 0,1% ácido fórmico.
   2. Operar el espectrómetro de masas en el modo de adquisición dependiente de datos, establecer un único espectro de masa de exploración completa (300-1800 m/z, resolución 60 000) seguido de 20 escaneos MS/MS dependientes de datos a 28% de energía de colisión normalizada.
   3. Los datos de espectros de masas abiertos e identificar los picos del producto en cada paso para confirmar que la reacción química se ha realizado con éxito.

5. Cuantificación del nitropéptido

1. Preparar 3 juegos de soluciones de nitro-Angiotensina II del paso 1.4, cada conjunto que contiene 2 concentraciones de nitro-angiotensina II: Set #1, 20 nmol en el tubo A y 20 nmol en el tubo B, cada uno en solución TEAB de 100 l; Fije #2, 10 nmol en el tubo C y 20 nmol en el tubo D, cada uno en solución TEAB de 100 l; Ajuste #3, 40 nmol en el tubo E y 10 nmol en el tubo F, cada uno en solución TEAB de 100 l.
   Nota: Las dos concentraciones de nitro-angiotensina II en cada conjunto se utilizan para el etiquetado de dimetil, para reaccionar con formaldehído (ligero) y formaldehído-D2 (pesado), respectivamente.
2. Para cada conjunto, agregue 4 sl de formaldehído y formaldehído-D2 a la muestra que se etiquetará como ligera y pesada, respectivamente. Siga los pasos 2.3 a 2.5 para terminar el etiquetado de dimetils.
3. Mezclar las muestras etiquetadas ligeras y pesadas.
4. Siga los pasos de 3.1 a 4.6 para la reducción, biotinylación, enriquecimiento y detección.

Resultados

El diagrama de flujo para la elaboración de perfiles de nitropéptidos en este manuscrito se muestra en la Figura1. Las figuras 2, 3, 4 y 5 muestran los espectros de masa de Angiotensina II, nitro-angiotensina II, dimetil etiquetado nitro-angiotensina II y dimetil etiquetado como amino angiotensina II, respectivamente. El peso molecular del compuesto puede reflejarse en los valores m/z del pico mono-isótopo en...

Discusión

El protocolo aquí describe el enriquecimiento y perfilado de nitropéptidos. Utilizando Angiotensin II como péptido modelo, ilustramos el procedimiento que se muestra en la Figura1. Después de obtener la nitro-angiotensina II, la amina primaria en el péptido debe bloquearse para evitar la conjugación de amina adicional, que es uno de los pasos más críticos dentro del protocolo. En el protocolo actual, el etiquetado de dimetil según se utiliza para bloquear las aminas primarias por do...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acclaim pepmap 100 C18 column	Thermo-Fisher	164534
1 M TEAB solution	Sigma-Aldrich	T7408
50% hydroxylamine	Thermo-Fisher	90115
Acetonitrile	Thermo-Fisher	A955	MS Grade
dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43819
formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Molecular Biology Grade
formaldehyde-D2	Toronto Research Chemicals	F691353
formic acid	Sigma-Aldrich	695076	ACS reagent
Fusion Lumos mass spectrometer	Thermo
isoacetamide	Sigma-Aldrich	I1149
Methanol	Thermo-Fisher	A456	MS Grade
NHS-S-S-bition	Thermo-Fisher	21441
Oasis HLB column (10 mg)	Waters	186000383
peroxynitrite	Merck-Millipore	516620
sodium cyanoborohydrite	Sigma-Aldrich	42077	PhamaGrade
sodium dithionate	Sigma-Aldrich	157953	Technical Grade
Streptavidin Sepharose	GE Healcare	GE17-5113-01
Ultimate 3000 nanoLC	Thermo