Un modelo in vitro para estudiar la agregación de Tau utilizando la transducción de neuronas humanas mediada por lentivirales

Resumen

Este protocolo detalla un procedimiento en el que las culturas neuronales humanas son transducidas con construcciones lentivirales codificando para tau humano mutante. Las culturas transducadas muestran agregados Tau y patologías asociadas.

Resumen

La agregación aberrante de la proteína tau está implicada patogénicamente en una serie de enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Alzheimer (AD). Aunque los modelos de tauopatía de ratón han proporcionado un recurso valioso para la investigación de los mecanismos neurotóxicos de la Tau agregada, es cada vez más evidente que, debido a las diferencias interespecies en Neurofisiología, el cerebro del ratón es inadecuado para modelar la condición humana. Los avances en los métodos de cultivo celular han hecho que las culturas neuronales humanas sean accesibles para uso experimental in vitro y han ayudado en el desarrollo de neuroterapias. Sin embargo, a pesar de la adaptación de las culturas celulares neuronales humanas, los modelos in vitro de la tauopatía humana aún no están ampliamente disponibles. Este protocolo describe un modelo celular de agregación de tau en el que las neuronas humanas son transducadas con vectores de origen lentiviral que codifica para tau mutado patógeno fusionado a un reportero de proteína fluorescente amarilla (YFP). Las culturas transducadas producen agregados tau que se mancha positivamente para la tioflavina y muestran marcadores de neurotoxicidad, como la longitud axonal disminuida y el aumento del volumen lisosomal. Este procedimiento puede ser un modelo útil y rentable para el estudio de las tauopatías humanas.

Introducción

La agregación patológica de la proteína tau asociada a un microtúbulo es una característica definitoria de muchas enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la AD, la demencia frontotemporal (FTD), la enfermedad de Pick y la parálisis la supranuclear progresiva (PSP)¹. En un estado no enfermo, Tau se une y estabiliza los filamentos de microtúbulo en axones neuronales². Sin embargo, la hiperfosforilación asociada a la enfermedad de Tau promueve la agregación de TAU, la disociación de los microtúbulos y la toxicidad neuronal³. Los efectos tóxicos de Tau agregada pueden implicar la activación aberrante de colinérgicos⁴ y los receptores glutamatérgicos⁵ resultando en la desregulación del calcio intracelular y, eventualmente, la muerte celular. En modelos animales, la reducción de Tau cerebral mejora la patología en ratones AD⁶ y en modelos de ratón de lesión cerebral traumática leve repetitiva⁷.

La evidencia de montaje demuestra que la estructura y la afinidad de unión de Tau derivado del ratón son distintas de Tau derivado del humano y que Tau de ratón es inadecuado para modelar Tauopatías humanas⁸. Sin embargo, los modelos de tauopatía celular humana no están ampliamente disponibles comercialmente. El objetivo general de este trabajo es describir un modelo in vitro de agregación tau en el que las neuronas humanas son transducidas con vectores de origen lentiviral que contienen construcciones tau humanas mutantes⁹. El agregado de tau que hace que las construcciones lentivirales se codifiquen para el dominio de repetición tau P301L y V337M mutaciones fusionadas con un reportero de YFP (tau-RDLM-YFP) mientras que el control construye el código para el dominio de repetición de Tau (WT) de tipo salvaje fusionado con un reportero de YFP (tau-WT-YFP). Los cultivos neuronales transducidas usando este método expresan aproximadamente nueve veces más tau que las culturas no transducadas. Aunque la cantidad de expresión de Tau expresada en exceso es aproximadamente igual entre las células de Tau-RdlM-YFP y tau-WT-YFP-transducidas, solo las neuronas transducidas con agregados de visualización tau-RdlM-YFP. Las culturas transladadas con tau-RDLM-YFP se mancha positivamente para tioflavina y muestran reducciones en la longitud axonal y la densidad sináptica. Por lo tanto, este modelo celular puede ser una herramienta útil para estudiar la agregación de Tau in vitro.

Protocolo

1. preparación de medios y reactivos

1. Descongelar el recubrimiento de matriz de membrana del sótano para placas de cultivo a 4 ° c (no permita que la matriz de membrana del sótano se caliente o se solidifique). Hacer alícuts de 1 mL y almacenarlos a-20 ° c o-70 ° c.
2. Reconstituir el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) en solución salina estéril amortiguada por fosfato (PBS) a 10 μg/mL y hacer alícuas de 10 μL. Guárdela a 4 ° c.
3. A una botella nueva, sin abrir, de 500 mL de DMEM/F12 con glutamina, añadir B27 (10 mL), N2 (5 mL) y penicilina-streptomicina (5 mL). Colocar 50 mL de este medio de la célula madre neural (NSC) en un tubo cónico y añadir 10 μL de 10 μg/μL (2 μg/mL final) bFGF. Almacene los medios NSC (+) bFGF a 4 ° c.
4. Para hacer (-) los medios bFGF, utilice la misma receta que se describe en el paso 1,3 pero no agregue bFGF. Estos medios se utilizarán para diferenciar los NSCs a las neuronas y para mantener las culturas neuronales después de la diferenciación.

2. construcciones lentivirales

Nota: Antes de comenzar a trabajar con construcciones lentivirales, asegúrese de que el laboratorio ha sido aprobado para usar agentes de bioseguridad nivel 2 (BSL-2). Además, se deben utilizar campanas de cultivo BSL-2, equipo de protección personal (EPP) y métodos de eliminación cuando se trabaja con vectores lentivirales.

1. Obtenga construcciones tau empaquetadas en lentivirus de una fuente preferida (véase Sanders et al.¹⁰ para construir información).

3. cultivo de células madre neuronales humanas

Nota: Los NSCs son típicamente sembrados en 100000 – 150000 células/cm² y la mayoría de los NSCs disponibles comercialmente se venden como 1 x 10⁶ células/vial. Este protocolo se ha optimizado para los platos de cultivo de células de 10 cm (aunque se pueden utilizar otros tamaños de platos); por lo tanto, si se están utilizando los NSCs disponibles comercialmente, los NSCs pueden necesitar ser ampliados por primera vez cultivados en platos de seis-pozo con el fin de dar lugar a suficientes células para sembrar 10 cm de platos. Este protocolo puede ser adaptado alternativamente para una variedad de tamaños de plato de cultivo celular (pero no contiene instrucciones para el paso de los NSCs ya que estos protocolos están disponibles en otros lugares^11,12).

1. Para la preparación de placas de cultivo celular, retire una alícuota de recubrimiento de matriz de membrana de sótano congelado para placas de cultivo celular y permita que se descongele a 4 ° c (las alícuotas se pueden colocar a 4 ° c durante la noche del día antes de que las células se sembren). Añadir 385 μL de recubrimiento de matriz de membrana sótano a 5 mL de medios DMEM/F12 + penicilina-streptomicina.
   Nota: 5 ml de medios DMEM/F12 + penicilina-estreptomicina es suficiente para recubrir un solo plato de 10 cm (1 ml de esta solución de recubrimiento de matriz de membrana sótano es suficiente para recubrir un pozo de un plato de seis pozo). Alternativamente, si las células deben ser fijas e inmunostinadas, o teñidas para tioflavina, las células de cultivo en cubreobjetos de vidrio en los platos de cultivo de 24-well.
   1. Mantenga fríos los medios y el recubrimiento de la matriz antes y agregándolos a los platos de cultivo. Añadir el recubrimiento de matriz de membrana sótano a los platos de cultivo y colocar los platos en una incubadora (a 37 ° c) para 1 h. Para un recubrimiento óptimo, no Incube la matriz de membrana del sótano durante más de 1 h o menos. Después de 1 h, aspiran el recubrimiento de matriz de membrana del sótano de los platos de cultivos celulares. Asegúrese de que esto coincida con los NSCs que están listos para ser chapados.
      Nota: Si las celdas no se descongelan de las existencias congeladas, omita el paso 3,2 y continúe con el paso 3,3.
2. Si las células se descongelan de las existencias de NSC congeladas, tome un vial de células congeladas y caliente en un baño de agua calentado a 37 ° c moviendo el vial hacia atrás y hacia adelante en el agua. Una vez descongelada, pulverice el vial con etanol al 70% y colóquelo en una campana de cultivo celular. Transfiera las células a ~ 10 mL de medios DMEM/F12 + penicilina-estreptomicina y centrifugue el tubo a temperatura ambiente a 1.000 x g durante 5 min. Aspire los medios y resuspender las células en los medios NSC.
3. Diluir las células en medios NSC para obtener la densidad de siembra apropiada para el recipiente de cultivo celular que se está utilizando.
   Nota: Por ejemplo, si los NSCs están siendo chapados en una placa de seis pozo — uno bien en un plato de seis cultivos tiene una superficie de 9 cm²— 900.000 a 1.350.000 las células se requieren para la semilla. Por lo tanto, un vial que contiene 1 millón células se puede precipitado resuspendido en 2 ml de medios y se añade a un solo pozo de un plato de seis podos.
4. Agregue suficientes células suspendidas en los medios de la NSC para sembrar los platos de cultivo recubiertos con matriz de membrana basal (100.000 células/cm²) y cambie los medios cada dos días (si usa un caldo congelado, cambie los medios el día después del chapado y cada dos días después). Cultivar las células hasta que sean 75% – 80% confluentes.
   Nota: Las células probablemente alcancen 75% – 80% confluencia poco después de chapado, pero esto puede tomar más tiempo si se utilizan las existencias congeladas.
5. Una vez que los NSCs son del 75% – 80% confluentes, comienzan la diferenciación neuronal quitando los medios de bFGF de la NSC (+) y reemplazándolos con los medios NSC (-) bFGF. Cultivo de las células en este medio (reemplazando los medios cada otro día) durante al menos 4 semanas.
   Nota: Las células continuarán dividiéndose durante unos días después de la retirada de bFGF; por lo tanto, las células pueden alcanzar 90 – 100% confluencia. Después de cultivar durante 4 semanas, las células tendrán un destino neuronal y estarán listas para el tratamiento del lentivirus.

4. transducción y mantenimiento de cultivos neuronales

1. Para transducir neuronas con lentivirus, utilice un conteo de título de 3,4 x 10⁵ transducibles unidades/célula (un 100% de 10 cm de confluido de plato contendrá ~ 10 millones neuronas). Diluir las unidades transducibles a la concentración necesaria en los medios de cultivo celular y añadirlas a las células (utilizar el volumen normal de los medios para el plato de cultivo celular). Dos días después de añadir el lentivirus, lave las células 1X con medios frescos (-) bFGF (sin lentivirus) y continúe cultivando en (-) medios de bFGF como de costumbre.
2. Para el tratamiento post-lentiviral, alimente las neuronas transducadas cambiando el medio de cultivo celular ([-] medio de bFGF) cada otro día. Mantener las células durante ~ 8 semanas después de la transducción. Rutinariamente visualizar las células bajo un microscopio de luz para asegurar la viabilidad.
   Nota: La dispersión o las roturas dendríticas son signos de que las células ya no son viables.

5. imágenes de las células

1. Las imágenes de células vivas
   1. Después de la transducción (4 días después de la adición de lentivirus), observar las señales de YFP bajo un microscopio fluorescente capaz de imágenes de células vivas. Tome los platos de cultivo celular de la incubadora y asegúrese de que los pozos de cultivo permanecen estériles manteniendo la tapa en la parte superior de los platos de cultivo. Visualice las células usando un objetivo de 10x con una longitud de onda de excitación de ~ 514 nm y un filtro de emisión de ~ 527 nm.
      Nota: Los agregados son típicamente visibles en cultivos celulares transducados 6 – 8 días después de la aplicación del lentivirus.
2. Tinción de células fijas (etiquetado β-Tubulin III y tinción de tioflavina)
   1. Para fijar las células en paraformaldehído (PFA), retire los medios de cultivo de las neuronas transducidas cultivadas en cubreobjetos de vidrio. Lave las células 1X con PBS, extraiga el lavado y añada 300 – 500 μL (si utiliza placas de 24-Well) de 4% de PFA (diluido en PBS) a los cubreobjetos durante 20 minutos a temperatura ambiente. Retire la PFA y lave los cubreobjetos 2x con PBS.
   2. Preparar una solución de bloqueo que consiste en PBS, 3% albúmina sérica bovina (BSA), y 0,3% Triton X-100. Añadir 300 – 500 μL de la solución a los pozos e incubar los cubreobjetos durante 2 h a 4 ° c. Después de 2 h, diluir los anticuerpos primarios (a una concentración de anticuerpos de 1:500) en la solución de bloqueo y añadir 300 – 500 μL de solución de anticuerpos primarios a cada pozo. Coloque la placa en una plataforma oscilante o giratoria (a baja velocidad) durante la noche a 4 ° c.
   3. Al día siguiente, retire la solución de anticuerpos primarios y lave los cubreobjetos 3x durante 5 min cada uno con PBS. Diluir los anticuerpos secundarios en una solución tampón de bloqueo (con una concentración de 1:1000) y añadir una solución de anticuerpos secundaria a cada pozo. Seleccione el anticuerpo secundario apropiado utilizando una etiqueta fluorescente que no se superponga con la señal YFP (CY-3, por ejemplo). Incubar las células a temperatura ambiente durante 2 h en una plataforma oscilante o giratoria. Después de 2 h, retire la solución de anticuerpos secundarios y lave los cubreobjetos 3x durante 10 min cada uno con PBS.
   4. Lavar los cubreobjetos en agua desionizada doble (DDW) durante 10 min. extraer el DDW y añadir 300 μL/pozo de 0,015% de tioflavina-S diluido en etanol al 50% durante 10 min. Retire la solución de tioflavina y lave las cubiertas 2x por 4 min cada una con un 50% de etanol, seguida de 4 min lavar con etanol al 30% y dos lavados durante 5 min cada uno con un 30% de etanol. Lave los cubreobjetos 1X con DDW antes del montaje.
      Nota: La tinción de tioflavina descrita en el paso 5.2.4 es opcional.
   5. Para montar los cubreobjetos en diapositivas de vidrio, coloque una sola gota de soporte de montaje en el lado "+" de un portaobjetos de vidrio. Retire todo el líquido del pozo que contiene el recubrimiento de vidrio y, utilizando fórceps finos, retire con cuidado el recubrimiento de vidrio, manteniendo un registro de qué lado tiene las células cultivadas.
   6. Presione suavemente el borde de la cubreobjetos contra un Kimwipe para eliminar el exceso de humedad. Aún agarrando el cupado con fórceps finos, toque el borde (con el lado de la célula mirando hacia la gota de soporte de montaje) de la cubreobjetos a los medios de montaje, y luego, Coloque suavemente el cobertillo en el soporte de montaje (colocando las células cultivadas en el montaje medios de comunicación y intercalarlos entre el colador y el tobogán de cristal). Deje que el soporte de montaje se endurezca durante 30 minutos antes de la toma de imágenes. Las diapositivas se pueden almacenar a-20 ° c para su uso futuro.
   7. Imagen de las células utilizando un microscopio fluorescente y los espectros de excitación/emisión apropiados (YFP = ~ 514/527 nm, CY-3 = ~ 555/568 nm, y thioflavin S = ~ 390/426 nm).

6. métodos opcionales

1. Cada 2 días, recoger los medios acondicionados de las culturas y almacenarlos a-20 ° c para futuros análisis de especies de Tau liberados por las culturas.

Resultados

Las neuronas de Tau-RdlM-YFP-transduced se etiquetaron con fluorescencia con YFP, y las culturas RdlM-transduced muestran agregados después de la transducción. Estas inclusiones manchadas positivas para tioflavina (figura 1). Como se muestra en la figura 1 , este protocolo produce cultivos neuronales que muestran agregados de Tau tioflavina positivos. Para los experimentos iniciales, se recomienda que la diferenciación neuronal se confirme mediante la inmunog...

Discusión

Este protocolo describe la generación de un modelo in vitro de tauopatía humana que exhibe agregados de plata-mancha positiva y ovillos neurofibrilares positivos de tioflavina (NFTs). Además, las células transducadas muestran patologías inducidas por TAU, como defectos morfológicos, reducción de la sinaptogénesis y un aumento del volumen lisosomal. La principal ventaja de este protocolo es que proporciona un modelo accesible y rentable de la tauopatía neuronal, que se puede utilizar para los estudios de detecci?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm culture dishes	Thermofisher	12556002
15 mL tubes	Biopioneer	CNT-15
16% paraformaldehyde	Thermofisher	50-980-487
24 well culture plates	Thermofisher	930186
50 mL tubes	Biopioneer	CNT-50
70% ethanol in spray bottle	Various sources	NA
B27 supplement	Thermofisher	17504044
Basement membrane matrix (Matrigel)	Corning	356231
Basic FGF	Biopioneer	HRP-0011
Bovine serum albumin	Sigma	A7906
Cell culture incubator	Various sources	NA
Centrifuge	Various sources	NA
DMEM-F12 culture media with glutamine	Thermofisher	10565042
Ethanol (50% concentration or higher)	Various sources	NA
Flourescently labeled secondary antibodies	Various Sources, experiment dependent	NA
Fluorescent microscope	Various sources	NA
Glass coverslips	Thermofisher	1254581
Glass slides	Thermofisher	12-550-15
Human neural stem cells	Various sources	NA
Lentiviral vectors	Various sources	custom order
Mounting media	Thermofisher	P36934
N2 supplement	Thermofisher	17502048
Penicillin-Streptomycin	Thermofisher	15140122
Phosphate buffered saline	Thermofisher	14190250
Primary antibodies	Various Sources, experiment dependent	NA
Rocking or rotating platform	Various sources	NA
Sterile cell culture hood	Various sources	NA
Thioflavin S	Sigma	T1892-25G
Triton X-100	Thermofisher	BP151-100
Water bath	Various sources	NA