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Resumen

Integrina tensión juega un papel importante en diversas funciones celulares. Con un sensor de tensión integradora, integrina tensión es calibrada con sensibilidad picoNewton (pN) y reflejada en la resolución del submicron.

Resumen

La tensión molecular transmitida por bonos de integrina ligando es la señal mecánica fundamental en la vía de la integrina que juega un papel importante en muchas funciones celulares y los comportamientos. Para calibrar y tensión de integrina de la imagen con fuerza alta sensibilidad y resolución espacial, se desarrolló un sensor de tensión integradora (ITS), un sensor de tensión fluorescente basado en el ADN. El su se activa para emitir fluorescencia si mantener una tensión molecular, así conversión de fuerza a la señal fluorescente a nivel molecular. El umbral de tensión para su activación es ajustable en el rango de pN 10 – 60 que cubre bien el rango dinámico de tensión de integrinas en las células. Sobre un sustrato injertado con una ITS, la tensión de integrinas de las células adherentes es visualizada por fluorescencia y reflejada en la resolución del submicron. El ITS también es compatible con la proyección de imagen estructural de célula en células fijas y células vivas. El ITS se ha aplicado con éxito al estudio de la migración celular y la contracción de la plaqueta. Este documento detalla el procedimiento para la síntesis y aplicación de lo ITS en el estudio de la fuerza celular integrina-transmitida.

Introducción

Las células dependen de las integrinas cumplir y ejercer fuerzas celulares a la matriz extracelular. Transmisión de fuerza y adhesión celular mediada por integrinas son cruciales para la célula de difusión de1,2, migración3,4y supervivencia5,6,7. En el largo plazo, integrina biomecánica señalización también influye célula proliferación8,9,10 y diferenciación11,12. Los investigadores han desarrollado varios métodos para medir y celular integrina transmitida mapa las fuerzas en la interfase célula-matriz. Estos métodos se basan en sustrato elástico13, matriz de micropost14, o atómica microscopía (AFM)15,16de la fuerza. Métodos elásticos de sustrato y micropost dependen de la deformación de sustratos a informe el estrés celular y tienen limitaciones en términos de resolución espacial y sensibilidad de la fuerza. AFM tiene fuerza de alta sensibilidad, pero no puede detectar la fuerza en puntos múltiples simultáneamente, haciendo difícil mapa celular fuerza transmitida por las integrinas.

En los últimos años, se desarrollaron varias técnicas para estudiar la fuerza celular a nivel molecular. Una colección de sensores de tensión molecular basados en glicol de polietileno17,18, péptido de seda de araña19y ADN20,21,22,23 fueron desarrolladas para visualizar y monitorizar la tensión transmitida por las proteínas moleculares. Entre estas técnicas, DNA primero fue adoptado como el material de síntesis en la tensión de la correa (TGT), un enlazador rupturable que modula el límite de las tensiones de la integrina en células vivas22,24. Más tarde, técnica de transferencia de ADN y fluorescencia resonancia se combinan para crear horquilla sensores basados en ADN fluorescente tensión primero por Chen grupo23 y grupo20 de Salaita. El sensor de tensión basado en el ADN de horquilla informes integrina tensión en tiempo real y ha sido aplicado con éxito al estudio de una serie de funciones celulares21. Después, laboratorio de Wang había combinado un TGT con el par fluoróforo-extintor a tensión de integrina de informe. Este sensor lleva un su25,26. El ITS se basa en ADN de doble cadena (dsDNA) y tiene un rango dinámico más amplio (pN 10-60) para la calibración de la tensión de la integrina. En contraste con sensores basados en el ADN de la horquilla, el su informe no fuerza celular en tiempo real pero registra todos los acontecimientos histórico integrinas como la huella de la fuerza celular; Este proceso de acumulación de señal mejora la sensibilidad para la fuerza celular imágenes, lo que es factible a fuerza celular imagen incluso con un microscopio de fluorescencia bajo. La síntesis de ITS es relativamente más conveniente que se constituya por cruzamiento por hibridación dos ADN monocatenario (ssDNA).

El ITS es un dsDNA 18-base-emparejado conjugado con biotina, un fluoróforo, un extintor (Black Hole Quencher 2 [BHQ2])27y un arginylglycylaspartic cíclico ácido (RGD) péptido28 como un ligando de péptido de integrina (figura 1). El hilo inferior se conjuga con el fluoróforo (Cy3 se utiliza en este manuscrito, mientras que otros tintes, tales como serie del Cy5 o Alexa, también se han demostrado viables en nuestro laboratorio) y la etiqueta de biotina, con el que el su es inmovilizado sobre un sustrato por enlace biotina-avidina. El hilo superior se conjuga con el péptido RGD y el Quencher del agujero negro, que sacia Cy3 con aproximadamente 98% amortiguamiento eficiencia26,27. Con el protocolo presentado en este trabajo, la densidad de la capa de su substrato es alrededor de 1.100/μm2. Esto es la densidad que previamente calibrados para 18 bp biotinilado dsDNA cubierto sobre el sustrato funcionalizados neutrAvidin siguiendo el mismo protocolo29de la capa. Cuando las células se adhieren al substrato cubierto con el su, integrina une el ITS a través de RGD y transmite la tensión a la su. El su tiene una tolerancia de tensión específico (Ttol) que se define como el umbral de tensión que separa mecánicamente el dsDNA de ITS dentro de 2 s22. SU ruptura por tensión de integrina conduce a la separación del extintor de la tintura que posteriormente emite fluorescencia. Como resultado, la tensión de la integrina invisible se convierte en una señal de fluorescencia y la fuerza celular puede asignarse por proyección de imagen de fluorescencia.

Para demostrar la aplicación de lo ITS, utilizamos peces keratocyte aquí, un modelo de celular utilizado para celular migración estudio30,31,32, células CHO-K1, utilizado células inmóviles y fibroblastos 3T3 de NIH. Coimaging de las estructuras de tensión y celular integrina también se lleva a cabo.

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC, 8-16-8333-I) de la Universidad Estatal de Iowa.

1. síntesis del sensor tensión integradora

  1. Personalizar y ordenar ssDNAs (véase la Tabla de materiales).
    Nota: Las secuencias de ssDNA son como sigue. El filamento superior es /5ThioMC6-D/GGG AGG ACG CAG CGG CCG/3BHQ_2 /. Los filamentos más bajos son los siguientes.
    12 pN ITS: / 5Cy3/CGG CCG CTG CGT CCT CCC /3Bio/
    23 pN ITS: / 5Cy3//iBiodT/ CGG CCG CTG CGT CC CCC
    33 pN ITS: / 5Cy3/CG/iBiodT CGG CCG CTG/CCT CCC
    43 pN ITS: / 5Cy3/CGG CCG C/iBiodT/G CGT CCT CCC
    54 pN ITS: /5Biosg / / iCy3/CGG CCG CTG CGT CCT CCC
    Aquí, /5ThioMC6-D representa una modificación de tiol C6 S-S (disulfuro) en el extremo 5'. /3BHQ_2/ representa un agujero negro extintor 2 en el extremo 3'. 3Bio / / 5Biosg y /iBiodT/ son Biotinilación en el extremo 3', 5' el extremo y la timina del ADN interno, respectivamente. /iCy3/ representa un Cy3 insertada en la espina dorsal interna de ssDNA. Estos códigos son utilizados por el proveedor comercial específico utilizado aquí y pueden ser diferentes en otras empresas de ADN.
  2. Conjugar el péptido RGD a SH-ssDNA-quencher.
    Nota: Los reactivos usados son el tampón fosfato salino (PBS), sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC), péptido RGD y tris - clorhidrato de fosfina (2-carboxietil), también conocido como TCEP-HCl.
    1. Desprotejera el modificador de tiol en la DNA del filamento superior usando TCEP solución.
      Nota: Modificación de tiol DNAs de una fuente comercial son enviados en forma oxidada, con los átomos de azufre, protegidos por un enlace disulfuro que necesita reducirse antes verbal de RGD-DNA. TCEP es un reactivo de reducción inodoro utilizado para la desprotección de grupos tiol.
      1. Se disuelven 14,3 mg de HCl TCEP en 300 μL de agua. Ajustar el pH de la solución TCEP ~7.2–7.4 con solución de NaOH de 1 M (150 μL), utilizando papeles de prueba de pH. Añadir agua pura para un volumen final de 0.5 mL. La concentración final de TCEP es 100 m m.
        Nota: Se recomienda hacer TCEP solución fresca cada vez para desprotección de tiol de ADN. Evitar siembra solución TCEP durante mucho tiempo.
      2. Añadir 100 μl de solución de 0,5 M etilendiaminotetracético de ácido (EDTA) y 400 μL de agua a la solución TCEP.
      3. Añada 10 μl de la solución de EDTA + TCEP a 20 μl de tiol-ADN-BHQ2 de 1 mM en PBS. Deje que la solución reaccionar durante 30 min a temperatura ambiente.
        Nota: El enlace disulfuro de 5' modificación de tiol verbal C6 S-S en este ssDNA se va partido por TCEP, dejando el grupo tiol listo para la reacción con maleimida en los siguientes pasos. El TCEP no interfiera con la siguiente reacción tiol-maleimida; por lo tanto, no es necesario apaciguar TCEP después de este paso.
    2. RGD-NH2 con sulfo-SMCC del conjugado.
      1. Disolver 5 mg de RGD-NH2 en 100 μl de PBS para obtener 11 mM RGD-NH2.
      2. Añadir 200 μL de agua pura al tubo con 2 mg de sulfo-SMCC (premedido por el proveedor). Romper el sólido sulfo-SMCC con una punta de pipeta y pipeta vigorosamente al mismo tiempo para facilitar la disolución de la SMCC en el agua. La concentración de sulfo-SMCC será 23 mM.
        Nota: Porque el éster de NHS en sulfo-SMCC está sujeto a hidrólisis y tiene una vida de unos pocos minutos, este paso de disolución debe ser completada dentro de 1 min para evitar la pérdida excesiva de los ésteres de NHS debido a la hidrólisis. Use agua pura para disolver sulfo-SMCC, ya que su solubilidad en PBS o en otros búferes es pobre.
      3. Agregar 40 μl de solución sulfo-SMCC a la solución de 100 μl RGD-NH2 e incubar durante 20 min.
        Nota: El éster del NHS en sulfo-SMCC reacciona con el grupo amina en RGD-NH2, formando un enlace amida que une RGD y sulfo-SMCC.
    3. RGD-SMCC del conjugado con el SH-ssDNA-quencher.
      1. Mezclar las soluciones preparadas en pasos 1.2.1 y 1.2.2 e incubar la mezcla por 1 h a temperatura ambiente. Hacia la solución de un sistema de refrigerador a 4 ° C y se deja reaccionar más lejos durante la noche. El tiol conjugado en la DNA del filamento superior reaccionarán con maleimida en sulfo-SMCC, formando un grupo de thioether que une RGD con la DNA del filamento superior.
    4. Realizar la precipitación del etanol para purificar a RGD-ssDNA-extintor sulfo-SMCC, RGD y TCEP.
      1. Enfriar 10 mL de etanol al 100% en un tubo cónico de 15 mL en un congelador de-20 ° C durante al menos 30 minutos.
      2. Mezcle una solución de NaCl de 3 M, una solución de ADN y refrigerado etanol en una proporción de volumen de 1:10:25. Mantenga el líquido mezclado en un congelador de-20 ° C por 30 minutos o hasta que se precipita el ADN.
      3. Centrifugar el líquido a 10.000 x g durante 30 min descartar el sobrenadante.
      4. Añadir PBS a la pelotilla de la DNA. Medir la concentración de ADN usando un espectrómetro.
    5. (Opcional) Realizar electroforesis de ADN para obtener una mayor pureza de RGD-ssDNA.
      Nota: Con el protocolo anterior, el 70% – 90% de la ssDNA se ser conjugados con RGD. Si se desea mayor pureza, electroforesis de ADN pueden realizarse también para separar DNA conjugada del ADN no conjugada.
      1. Montar un sistema de electroforesis vertical.
      2. Preparar una solución de gel de poliacrilamida al 10% mezclando 50 mL de agua pura, 20 mL de gel de acrilamida del 40%, 8 mL de 10 x buffer de borato-tris-EDTA (TBE) y 800 μl de 10% persulfato de amonio (APS).
      3. Añadir 80 μl de tetramethylethylenediamine (TEMED) a la solución de gel. Verter la solución en la cámara de cristal del sistema de electroforesis. Inserte un peine bien simple para crear un pozo en la parte superior del gel. Espere 10 minutos hasta que el gel es reticulado.
      4. Mezcle la solución de ADN con 100% de glicerol en una proporción de volumen de 1:1. Retire el peine y cargar bien la solución de ADN en el gel.
      5. Correr el gel a una tensión de 200 V. observar dos bandas de ADN en el que el revestimiento de uno es el ADN conjugado.
      6. Corte la banda de gel con ADN conjugada y cortar en trozos pequeños.
      7. Recoger el gel en cubitos en dos tubos de centrífuga de 1.5 mL con filtros. Añadir 500 μl de PBS a cada tubo.
      8. Poner el gel empapado de PBS en un lugar oscuro a temperatura ambiente por 1 día. ADN se difunden fuera de las piezas de gel en el PBS.
      9. Recoger la solución del DNA por centrifugación los tubos a 1.000 x g durante 2 minutos.
      10. Realizar otra ronda de precipitación del etanol (paso 1.2.4) para recoger el ADN.
  3. Sintetizar el su por cruzamiento por hibridación RGD-ssDNA-extintor y tinte-ssDNA-biotina.
    1. Mezclar las soluciones de la cadena superior y la inferior strand DNAs en una proporción molar de 1.1:1. Mantener la mezcla a 4 ° C durante la noche para producir el su por hibridación de ADN.
      Nota: Un cociente molar de 1.1:1 para hibridación de ADN se utiliza en lugar de 1:1. Excesiva RGD-ssDNA-extintor se utiliza para asegurar que todo tinte-ssDNA-biotina se hibridan con RGD-ssDNA-quencher. RGD-ssDNA-extintor sin hibridación será lavada durante la capa superficial, que no afectará a la calidad de su capa superficial.
    2. Alícuota y guarde la solución de su a-20 ° C para almacenamiento a largo plazo.
      Nota: El buffer de almacenamiento es PBS y la concentración de almacenamiento generalmente debe estar por encima de 10 μm. Para uso regular, su solución puede almacenarse a 4 ° C durante unas semanas sin deterioro de la calidad notable.

2. preparación de las superficies por inmovilización del ITS en los platos de Petri con fondo de cristal

Nota: Los reactivos usados son biotinilado de seroalbúmina bovina (BSA-biotina), la proteína avidina y ITS. Enfriar todos los reactivos y tampón PBS a alrededor de 0 ° C en hielo con un cubo de hielo.

  1. Carga de 200 μL de 0,1 mg/mL BSA-biotina en PBS en el pozo de un plato de Petri con fondo de cristal (29 mm de diámetro, con un pozo de 14 mm). Incubar durante 30 min a 4 ° C en un refrigerador. BSA-biotina es físicamente adsorbida sobre la superficie.
  2. Aspirar la solución desde el pocillo con una pipeta y añadir 200 μL de PBS hacia el pozo para lavar la superficie. Repita este 3 x para completar el lavado.
  3. Incubar 200 μL de proteína de avidina de 50 μg/mL en el pozo durante 30 min a 4 ° C. Lavar 3 veces con PBS. Después de este paso, la proteína avidina se une a la biotina de BSA y queda inmovilizada en la superficie de vidrio.
  4. Incubar 200 μL de 0,1 μm de ITS en el pozo durante 30 min a 4 ° C. Lavar el plato con 3 veces con PBS. Salir de PBS en el pozo hasta la chapa de la célula. Después de este paso, el su con la etiqueta de la biotina se une a la proteína avidina y queda inmovilizado en la superficie.
    Nota: Una precaución esencial para su calidad de la capa y la homogeneidad durante la inmovilización de su debe nunca permita que la superficie de la placa de Petri se secan. Teniendo todos los reactivos y PBS a 4 ° C o alrededor de 0 ° C en hielo con un cubo de hielo ayuda a reducir la tasa de evaporación de agua durante el lavado, cuando PBS se extrae del pozo.

3. célula chapado en sus superficies

  1. Cultura pescado queratocitos.
    Nota: Aquí, pez rojo (Carassius auratus) se utiliza como un ejemplo, pero otras especies también pueden funcionar.
    1. Arrancar un pedazo de escala de peces de un pez con una pinza de punta plana. Presione suavemente la escala en el pozo de un plato de Petri con fondo de cristal, con la cara interna de la escala de ponerse en contacto con el vidrio. Esperar 30 s para la escala de peces para adherirse bien a la superficie del plato.
    2. Añadir 1 mL de Iscove modificado medio (IMDM) completado medio de Dulbecco para cubrir completamente la escala de peces. Mantenga la placa de Petri en un cuadro oscuro y húmedo de 6 a 48 h a temperatura ambiente.
      Nota: El medio IMDM completo contiene 79% IMDM + 20% suero bovino fetal (FBS) + 1% de penicilina. No se necesita ningún suministro adicional de oxígeno o el CO2 . Unos rollos de papel de seda empapadas con agua se pueden dejar en la caja para mantener alta humedad en la caja. Pescado keratocytes emigrará de la escala de peces como una hoja de células después de unas horas. Esto puede observarse con un microscopio de cultivo de tejidos. Las células son generalmente viables a las 48 h.
  2. Se desprenden y las células de queratocitos en sus superficies de la placa.
    1. Retire el medio de la caja Petri en la que la escala de peces fueron cultivada. Lavar bien 1 x con solución de extracción de la célula y desprendimiento solución para cubrir la escala de peces e incubar durante 3 minutos.
      Nota: La receta para que la célula separar la solución de EDTA es la siguiente: 100 mL de 10 x Hanks equilibrada solución de sal (HBSS) + 10 mL de 1 M HEPES (pH 7.6) + 10 mL de bicarbonato de sodio 7.5% + 2,4 mL de EDTA 500 mM + 1 L de H2O. Se ajustó el pH a 7.4.
    2. Aspirar toda célula extraer la solución y añadir medio completo IMDM. Dispersar los keratocytes mediante pipeteo suave. Ajustar la densidad de la solución de la célula hasta el nivel deseado (1 x 104– 1 x 105/ml). La placa de las células en la superficie de su (preparado según la sección 2). Incube las células a temperatura ambiente durante 30 min antes de la proyección de imagen.
      Nota: Conteo celular puede hacerse con un hemocitómetro después de extraer las células con solución de extracción. La célula de revestimiento densidad es relativamente baja para que los queratocitos tienen mucha superficie para migrar.
  3. Placa las células CHO-K1 y sus superficies de las células 3T3 NIH.
    Nota: El medio para las células CHO-K1 es de 89% Ham F12 10% FBS + 1% de penicilina. El medio para las células 3T3 NIH es medio modificado Eagle de 89% Dulbecco (DMEM) + 10% suero bovino (CBS) + 1% de penicilina. Las condiciones de cultivo son 37 ° C y 5% CO2.
    1. Las células CHO-K1 de la cultura o las células 3T3 NIH 80% – 100% de confluencia en una placa de Petri (o frasco de cultura).
    2. Calentar la célula extraer la solución y el medio de cultivo a 37 ° C.
    3. Quite todos los medio de cultivo en la placa de Petri con una pipeta. Lavar las células 1 x con solución de extracción de la célula. Cubrir las células con solución de extracción e incubar a 37 ° C durante 10 minutos.
    4. Dispersar las células mediante pipeteo. Recoger la solución celular y centrifugar a 300 x g durante 3 minutos.
    5. Aspirar hacia fuera el sobrenadante y agregar medio completo o medio libre de suero.
    6. Ajustar la densidad de la solución de la célula hasta el nivel deseado (1 x 105 – 1 x 106/ml). La placa de las células en las superficies ITS (preparadas según la sección 2). Incube las células a 37 ° C por 1 – 2 h antes de la proyección de imagen, o 30 min antes de la grabación de vídeo.

4. proyección de imagen, grabación de vídeo y la asignación de la tensión de integrina en tiempo real

  1. Quasi-Real-Time proyección de imagen de la tensión de la integrina en células vivas
    1. Incubar los keratocytes en sus superficies (preparados según la sección 2) durante 30 min a temperatura ambiente, o incubar células CHO-K1 o NIH 3T3 durante 1 h en sus superficies en una incubadora a 37 ° C.
    2. Monte la placa de Petri en una etapa de microscopio de fluorescencia. Realizar proyección de imagen de fuerza celular con un tiempo de exposición de 1 s. El aumento es de 40 x o 100 x.
    3. Grabar un vídeo de sus imágenes con un intervalo de cuadro de 20 s de keratocytes o 1-2 min para células CHO-K1 o NIH 3T3.
    4. Utilice MATLAB u otra herramienta de análisis de imagen para restar un fotograma anterior del video su de un marco actual para calcular la señal de su recientemente producida en el último intervalo del marco. La señal de su recién producida representa la tensión de la integrina generada en el último intervalo de marco, informes de tal modo la fuerza celular de manera quasi-real-time.
  2. Coimaging de la tensión de la integrina y estructura celular en las células immunostained
    1. Después de paso 3.2.2 o paso 3.3.6, realizar immunostaining para marcar las proteínas estructurales del destino.
      Nota: Utilice colorantes diferentes para evitar la interferencia de fluorescencia entre la proyección de imagen de tensión integrina y la proyección de imagen estructural de la célula. En este manuscrito, fluoróforo Cy5 fue utilizada para phalloidin y Alexa 488 fue utilizado para la tinción de la vinculina. La concentración del anticuerpo primario y secundario es de 2.5 μg/mL. La concentración para phalloidin es 1.5 unidades/μl.
    2. Realizar la proyección de la imagen de canal multifluorescent para adquirir un mapa de la tensión de la integrina y la proyección de imagen estructural de la célula.

Resultados

Con el ITS, el mapa de la tensión de integrina de keratocytes pescado fue capturado. Muestra que un keratocyte migra y genera tensión integrina en dos pistas de fuerza (figura 2A). La resolución del mapa de fuerza fue calibrada para ser 0,4 μm (figura 2B). Integrina alta tensión se concentra en el margen posterior (Figura 3A). El ITS también demuestra diferentes patrones específicos de las dif...

Discusión

El ITS es muy accesible pero poderosa técnica para celulares asignación en términos de síntesis y aplicación de la fuerza. Con todos los materiales listos, el ITS pueden ser sintetizado dentro de 1 día. Durante los experimentos, se necesitan sólo tres pasos de la capa superficial antes de la galjanoplastia de la célula. Recientemente, lo más habían simplificado el procedimiento de recubrimiento para un paso vinculando directamente el su con albúmina de suero bovino, lo que permite la adsorción física directa...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el fondo de arranque proporcionado por la Universidad Estatal de Iowa y por el Instituto Nacional del General médica Ciencias (R35GM128747).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
BSA-biotinSigma-AldrichA8549
NeutravidinThermo Fisher Scientific31000
StreptavidinThermo Fisher Scientific434301
upper strand DNAIntegrated DNA TechnologiesN/ACustomer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section
lower strand DNAIntegrated DNA TechnologiesN/ACustomer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section.
sulfo-SMCCThermo Fisher ScientificA39268
Cyclic peptide RGD with an amine groupPeptides InternationalPCI-3696-PI
IMDMATCC‎62996227
FBSATCC302020
Penicillingibco15140122
TCEPSigma-AldrichC4706
200 uL petri dishCellvisD29-14-1.5-N
NanoDrop 2000Thermo ScientificN/Aspectrometer
SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis UnitHoeferSE410-15-1.5Device for electroporesis
CHO-K1 cell lineATCCCCL-61
NIH/3T3 cell lineATCCCRL-1658
Anti-Vinculin AntibodyEMD Millipore90227Primary antibody for vinculin immunostaining
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488InvitrogenA28175Secondary antibody for vinculin immunostaining
Alexa Fluor 647 PhalloidinInvitrogenA22287
Eclipse TiNikonN/Amicroscope

Referencias

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