Ex Vivo expansión de células madre hematopoyéticas de cordón Umbilical humano derivadas de sangre CD34+ las células usando el ácido valproico

Resumen

Aquí, describimos la ex vivo expansión de células madre hematopoyéticas de CD34⁺ en células de sangre de cordón umbilical trataron con una combinación de un cytokine cóctel y VPA. Este método conduce a un grado significativo de ex vivo expansión de HSCs primitivo ya sea clínica o aplicaciones de laboratorio.

Resumen

Unidades de cordón umbilical sangre (UCB) proporcionan una fuente alternativa de humanos las células madre hematopoyéticas (HSCs) para pacientes que requieren trasplante de médula ósea alogénica. Mientras que la UCB tiene varias ventajas únicas, un número limitado de HSCs dentro de cada unidad UCB limita su uso en medicina regenerativa y el trasplante de HSC en adultos. Expansión eficiente de HSCs humanas funcionales puede lograrse ex vivo cultivo de CD34⁺ de las células aisladas de UCBs y tratados con un inhibidor de la deacetilasa, ácido valproico (VPA). El protocolo detallado aquí describe la metodología para aislar rápidamente a CD34 y condiciones de cultivo⁺ células y ampliar a un alto grado un grupo de primitivos HSCs. Las HSCs ampliadas son capaces de establecer engraftment tanto a corto como a largo plazo y son capaces de dar lugar a todos los tipos de células hematopoyéticas diferenciadas. Este método también tiene potencial para el uso clínico en terapia del gene de autólogo HSC y ofrece un enfoque atractivo para superar la pérdida de HSCs funcionales asociados con la edición de genes.

Introducción

Ex vivo expansión de células madre hematopoyéticas (HSCs) de sangre de cordón umbilical unidades (UCB) es muy prometedor para aplicaciones de HSC en medicina regenerativa y terapia de trasplante. Trasplante con unidades de la UCB tiene varias ventajas únicas como colección easy, alta disponibilidad, mínimo riesgo de infección, bajo riesgo de recaída de la enfermedad y la baja frecuencia de injerto contra enfermedad del anfitrión (GVHD). Sin embargo, las principales desventajas de su uso en contextos clínicos son el limitado número de HSCs presentes dentro de cada unidad UCB¹. El número insuficiente de HSCs resultados en retardada injerto y recuperación hematopoyética, riesgo de rechazo al injerto y reconstitución inmune aberrante.

En la actualidad, ha desarrollado diversos métodos y estrategias ex vivo ampliar el limitado número de HSCs de UCBs. Combinaciones de citoquinas diferentes cócteles con pequeñas moléculas o compuestos en ex vivo culturas dan como resultado diferentes grados de expansión en HSC números^{2,3,4,5,6, 7,8}. Lo importante es ex vivo cultura condiciones inducen estrés, llevando a la proliferación celular rápida, aumento de la actividad metabólico y pérdida de las características primitivas que definen HSCs primarias. Por lo tanto, están necesario desarrollar protocolos que conducen a la expansión de un gran número de HSCs funcionales con características que asemejan HSCs primitivo primarias.

Cultivos libres de suero de CD34⁺ las células aisladas de UCBs y tratamiento con valproico ácido (VPA) dan como resultado la expansión de un gran número de primitivos HSCs^4,9,10. La expansión de HSC no es únicamente debido a la proliferación de las HSCs existentes derivados de UCBs. En cambio, esta expansión es debido a la adquisición de un fenotipo primitivo combinado con un número limitado de divisiones celulares y proliferación⁹. Dentro de la inicial 24-48 h de incubación con una combinación de citocinas y VPA, CD34⁺ células adquieren un perfil fenotípico que caracterizan a las HSCs a largo plazo y transcriptómicos. El aumento significativo en el porcentaje de HSCs es acompañado por un aumento rápido del número de HSCs (63 veces aumento dentro de las 24 h de tratamiento de VPA)⁹. En particular, la estrategia de expansión de VPA-ex vivo expande HSCs con baja actividad metabólica, que resalta aún más sus características primitivas.

El método aquí descrito ofrece condiciones y tratamientos que conducen a un grado significativo de ex vivo expansión de HSCs primitivo ya sea clínica o aplicaciones de laboratorio. Este ex vivo estrategia de expansión utiliza un cóctel de cytokine combinado con el tratamiento de VPA. VPA es un fármaco aprobado por la FDA para el tratamiento de trastornos bipolares y otras enfermedades neurológicas. La expansión de HSC con VPA es rápida y ocurre dentro de 7 días, minimizando el tiempo de manipulación y el riesgo de contaminación. Lo importante, este protocolo permite la adquisición de los marcadores fenotípicos a largo plazo de HSC como CD90 y CD49f dentro de las 24-48 h después del tratamiento con VPA⁹. Injertos HSC ampliados con este protocolo tienen la capacidad de regenerar el sistema hematopoyético, puesto que pueden diferenciarse en todos los linajes de células hematopoyéticas y establecer a largo plazo injerto tras trasplante en los ratones del grupo de myeloablated modelos⁴. Por otra parte, este protocolo es altamente reproducible y permite un aislamiento eficiente y rápido de CD34 viable⁺ células de UCBs, que es fundamental para la industrialización de este procedimiento.

La APV ex vivo protocolo de expansión también tiene el potencial para superar la pérdida significativa de HSCs que ocurre durante la edición¹¹del gene. Gen de edición requiere exposición a citoquinas, que son necesarios para ciclismo las células y la activación de mecanismos de reparación del ADN. Debido a la rápida de tratamiento de VPA, este método podría ser beneficioso para la generación de un mayor número de células genéticamente modificadas en un período de tiempo que es relevante para la actualidad utiliza protocolos de modificación génica.

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Protocolo

El HSC ex vivo protocolo de expansión sigue las pautas del Comité de ética de investigación en el Mount Sinai School of Medicine.

1. tampón y preparación de los medios de comunicación

1. Preparar el tampón de separación 24 h antes de la aislamiento de CD34⁺ células de UBCs añadir 2 mL de ácido 0,5 M etileno diamina Tetra-acético (EDTA) y 33 mL de 7,5% albúmina de suero bovino (BSA) con solución salina 465 mL tamponada (1 x PBS). Mezclar suavemente y mantener el buffer durante la noche a 4 ° C.
2. Medios calientes a temperatura ambiente en el día de la purificación.

2. aislamiento de células mononucleares (empresas multinacionales) de la UCB unidad

1. Dispensar la unidad entera de UCB en un matraz de² 75 cm. Diluir y mezclar suavemente la UCB con un volumen igual de PBS a temperatura ambiente.
2. Determinar el número de tubos necesarios para el procesamiento de la unidad entera de UCB (un tubo cónico de 50 mL se puede utilizar para procesar 35 mL de UCB diluido). Añadir 15 mL de medio de gradiente de densidad (véase Tabla de materiales) a cada tubo y dispensar la UCB diluida en la parte superior de los medios de gradiente de densidad creando dos capas.
   Nota: Dosificar la UCB diluido muy despacio mientras sostiene el tubo en un ángulo de 45° para evitar la mezcla de la capa de media de gradiente de densidad con la UCB.
3. Centrifugar a 400 x g durante 30 min a una tasa baja de aceleración y desaceleración. Después de la centrifugación, multinacionales localizan en la capa blanca (buffy coat) entre la capa de gradiente media densidad y plasma.
4. Aspirar lentamente 2/3 del plasma sin alterar la capa de la capa anteada. Cuidadosamente transfiera la capa de la capa anteada en un nuevo tubo de 50 mL. Recoge todas las multinacionales de la misma unidad UCB en un tubo de 50 mL hasta 25 mL. Utilizar un tubo nuevo si el volumen de recogida multinacionales supera los 25 mL.
5. Añadir 25 mL de PBS frío al tubo que contiene 25 mL de corporaciones multinacionales y mezclar bien. Centrifugar a 400 x g durante 10 min a 4 ° C.
   Nota: PBS frío es importante para evitar el tapado de los anticuerpos en la superficie celular y reducir no específicos de etiquetado.
6. Cuidadosamente aspirar el sobrenadante y Resuspenda suavemente el sedimento celular en 50 mL de PBS frío.
7. Quitar 20 μL de la suspensión celular para el recuento. Contar el número de células teñido con acridina naranja/propidio tinción utilizando un contador de células automatizado. Calcular el número total de las empresas multinacionales.
   Nota: El conteo de células se puede realizar también por el método de exclusión azul de tripano usando un hemocitómetro.
8. Centrifugar a 400 x g durante 15 min a 4 ° C.
   Nota: Si no es necesario inmediatamente, se pueden congelar las empresas multinacionales en esta etapa.

3. aislamiento de CD34 de las células⁺ de UCBs

1. Preparar el CD34⁺ anticuerpos junto con solución de bolas magnéticas para aislamiento de CD34 de MNCs. Mix 300 μL de tampón de separación con 100 μl de humano FcR de IgG humana (reactivo de bloqueo) y 100 μl de granos magnéticos de CD34 para aislamiento de CD34 de las células^{+ +} las células de cada 10 empresas multinacionales de⁸ . Para el aislamiento de un mayor número de CD34 células⁺ de (> 10⁸) multinacionales, escalar de reactivos por consiguiente.
2. Cuidadosamente aspirar el sobrenadante del tubo que se centrifugó a paso 2.8. Resuspender el precipitado en la solución de granos magnéticos de CD34 preparada en el paso 3.1 (use 500 μl de la solución por 10⁸ células).
3. Mezclar suavemente e incubar a 4 ° C por 30 minutos.
   Nota: Prepare el dispositivo separador de células (véase Tabla de materiales) durante el período de incubación. Reemplazar la solución de almacenamiento con el buffer de trabajo como se indica en las instrucciones del fabricante y ejecutar un programa de lavado seguido de un programa de lavado.
4. Añadir separador celular frío funcionamiento tampón al tubo que contiene la mezcla de células hasta que el tubo se llena completamente. Centrifugar a 400 x g durante 15 min a 4 ° C.
5. Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en separador celular frío funcionamiento tampón (2 mL/10⁸ células). Transferir 2 mL de la mezcla de suspensión celular en tubos de 15 mL.
6. Carga 3 conjuntos de tubos de 15 mL en el rack de separador celular prechilled a 4 ° C. Un sistema de tubos contiene las empresas multinacionales, el segundo conjunto de tubos se utilizarán para recoger la fracción negativa y el tercer conjunto de tubos se utilizarán para recoger purificada CD34⁺ las células.
7. La parrilla de carga en el dispositivo de separador celular y ejecutar el programa preestablecido de posseld2 .
   Nota: Un método alternativo que utiliza el separador magnético manual puede utilizarse para reemplazar el celular de dispositivo separador¹² .
8. Tubos de centrífuga con la fracción positiva a 400 x g durante 15 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y resuspender purificada CD34⁺ de las células en 1 mL de medio sin suero.
9. Contar las células teñidas con acridina naranja/propidio usando un contador de células automatizado.
   Nota: Si no es necesario inmediatamente, purificada CD34⁺ las células pueden ser congeladas en este momento.

4. VPA Ex Vivo expansión de células purificadas de UCB-CD34⁺

1. Preparar un volumen suficiente de medios de comunicación a la placa de la purificada CD34 de las células⁺ en una densidad de 3.3 x 10⁴ células/mL. La composición de medios de cultivo es medio de cultivo libre de suero (véase Tabla de materiales) suplementado con 10 μl/mL pluma/strep, factor de células madre de 150 ng/mL (SCF), 100 ng/mL fms-like tyrosine receptor de la cinasa 3 (FLT3 ligando), 100 ng/mL trombopoyetina (TPO), y 50 ng/mL interleucina 3 (IL-3).
2. Placa purificada CD34⁺ de las células en una placa de 12 pozos (5 x 10⁴ CD34⁺ células / mL 1,5 de media / bien) y cultivo a 37 ° C en una incubadora humidificada 5% CO₂ .
3. Evaluar la pureza de CD34 aislado⁺ las células y la composición de la célula de análisis FACS como se describe a continuación en el paso 6.3.
4. Añadir VPA en una concentración final de 1 mM en las culturas de las células tratadas por 16 h con citocina cóctel.
5. Las células de la cultura por un adicional de 7 días a 37 ° C en una incubadora humidificada 5% CO₂ .
   Nota: Los medios permanece inalterado durante la duración de la ex vivo de expansión.

5. anticuerpos de tinción para análisis de citometría de flujo

1. Preparar solución de tinción de anticuerpo a manchar 2 x 10⁴– 6 x 10⁴ células y solución de isotipo para determinar FACS gating estrategia y determinar el nivel de fijación no específica. Diluir los anticuerpos (APC anti-CD34 de 1/100, 1/200 FITC anti-CD90) y los respectivos isotipos en 50 μl de buffer de separación (composición del buffer de separación se define en el paso 1.1).
   Nota: Realizar solo la coloración de células con cada anticuerpo de un FMO gating estrategia. Anticuerpo total compensación grano kit (véase Tabla de materiales), se puede utilizar para la configuración de la compensación.
2. Homogeneizar el cultivo celular mediante pipeteo varias veces. Contar las células y pipeta 5 x 10⁴ células en un tubo de 1,5 mL.
3. Añadir 1 mL de tampón de separación y centrifugar a 400 x g durante 15 min a temperatura ambiente.
4. Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 50 μl de la solución de tinción. Incube las células durante 30 min a temperatura ambiente.
5. Añadir 450 μl de tampón de separación y centrifugar a 400 x g durante 15 min a temperatura ambiente.
6. Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 100 μl de buffer de separación. Mantener las células en hielo durante al menos 5 minutos hasta realizar análisis FACS. Añadir 1 μl de 7-AAD para células viables de la puerta.
7. Carga la muestra de células teñidas en la máquina de FACS y adquirir las células en el caudal más bajo.
8. Para cada fluoróforo, analizar los controles de isotipo y las células manchadas para configurar compuerta para FITC (CD90), APC (CD34) y PerCP/Cy5.5 (7-AAD) tinción.
9. Puerta PerCP/Cy5.5 negativo fracción y parcela APC vs FITC para determinar el porcentaje de CD34 viable⁺, CD90⁺y CD34⁺CD90⁺ células que define la población de la HSPC/HSC en la cultura.

6. anticuerpos de tinción para citometría de flujo celular clasificación

1. Resuspender las células ampliadas mediante pipeteo varias veces. Contar el número de celular y transferir la cultura entera en un tubo de 15 mL o 50 mL.
2. Llenar el tubo con tampón de separación fría
3. Centrifugar a 400 x g durante 15 min a 4 ° C.
4. Preparar solución de tinción de anticuerpos a la mancha de 5 x 10⁵– 2 x 10⁶ células e isotipo solución para tinción de 1 x 10⁵ células y determinar FACS que bloquean. Diluir 1/10 (APC anti-CD34), 1/20 (FITC-CD90) los anticuerpos y los isotipos correspondientes en 500 μl de separación tampón por cada condición.
5. Preparar los controles de compensación de color solo usando un anticuerpo total compensación grano kit según las instrucciones del fabricante.
6. Transferir el sobrenadante del paso 5.2 a un tubo nuevo y mantenerla a 37 ° C. Se reutilizará este medio de cultivo para las células ordenadas de la cultura.
7. Resuspender el precipitado de células en tampón de separación fría para obtener una concentración de 5 x 10⁵ células / mL. Transferencia de 1 x 10⁵ células en tubos de 1,5 mL para la tinción de isotipo y las células restantes que se ordenarán en otros tubos de 1,5 mL.
8. Centrifugar los tubos a 400 x g durante 15 min a 4 ° C.
9. Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet de células en la coloración de la solución y el pellet de células que se ordenará en el solución de tinción del anticuerpo isotipo.
10. Incubar durante 30 min a 4 ° C.
11. Añadir 450 μl de tampón de separación y centrifugar a 400 x g durante 15 min a 4 ° C.
12. Resuspender el pellet con 2 mL de tampón de separación fría.
13. Para evitar que se bloquee, filtrar las muestras a través de 40 μm filtro de célula y lugar en el hielo hasta el FACS.
14. Clasificador de celular de instalación para la clasificación con los parámetros correctos.
15. Ejecutar ejemplos de isotipo para crear tensión y ganancia para el avance y la dispersión lateral e identificar poblaciones de fluorescencia negativa.
16. Controles de ejecución solo color para establecer coeficientes de compensación y aplicar compensación parámetro de protocolo de extracción.
17. Ejecute una pequeña alícuota de la muestra (Ab) (~ 50.000 eventos) para establecer la estrategia bloquea.
18. Establecer las decisiones de la clase para recoger la CD34⁺ CD90^– fracción de la célula.
19. Células de la especie en tubos con 2 mL de tampón de separación.
20. Después de su clasificación, recuento de las células y centrifugar a 400 x g durante 15 min a 4 ° C.
21. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado en los medios de comunicación recuperados en paso 5.5 para llegar a una concentración final de 3 x 10⁴ células/mL.
22. Placa de CD34⁺ CD90^– purificado de células en placas de pocillos 12 con 1,5 mL de medio/Pozo (5 x 10⁴ CD34⁺ CD90^– células/1.5 mL de medios de comunicación/pozo).
23. Evaluar la pureza análisis FACS con 50 μl de las células que contienen los medios de comunicación.
24. Tratar las culturas de CD34⁺CD90 células^– con VPA en concentración final de 1mM.
25. Incubar a 37 ° C en una incubadora humidificada 5% CO₂ .

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Resultados

El ex vivo protocolo descrito aquí aumenta el número de primitivas HSCs generados a partir de CD34⁺ células aisladas de UCBs (figura 1). Cebado de CD34⁺ células por 16 h con una citoquina coctel, seguida por el tratamiento con VPA para otros 7 días, conduce a un gran grado de expansión de HSC. Notablemente, el conjunto de células mayores es altamente enriquecido de HSCs, que fenotípicamente son definidas por CD34⁺CD90<...

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Discusión

Adjunto, presentamos un protocolo para ampliar rápidamente a un grado significativo el número de HSCs humanos funcionales de UCBs. Los estudios piloto y cinéticos utilizando este protocolo indican que el ex vivo ampliado las células rápidamente adquirir y conservar la expresión de varios marcadores fenotípicos de HSC como CD90 primitivo HSC características metabólicas⁹.

Ex vivo protocolo de expansión es relativamente simple y confiable. Purificación de CD34 c...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Expansion Media	Sigma-Aldrich	Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML
AO/PI (acridine orange/propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells.	Nexcelom	CS2-0106-25mL
APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581	BD BIOSCIENCE	555824
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Clone MOPC-21	BD BIOSCIENCE	555751
autoMACS Rinsing Solution	MACS Miltenyi Biotec	130-091-222
BD Falcon 15 mL Tube	BD Biosciences	352097
BD Falcon 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube	BD Biosciences	352063
BD Falcon 50 mL Tube	BD Biosciences	352098
Bovine serum albumine solution	Sigma-Aldrich	A8412
CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human	Miltenyi Biotec	130-046-703
Cell analyzer	BD Biosciences	FACS Canto II
Cell analyzer and sorter	BD Biosciences	FACS Aria II
Cell counter	Nexcelom	Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter
Cell separator device	autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec
Counting Chambers	Nexcelom	CHT4-PD100-002
Density gradient media	GE Healthcare Bio-Sciences AB	17-1440-03
Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E8008-100ML
FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10	BIOLEGEND	328108
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody	BIOLEGEND	400109
Inverted microscope
PBS	Corning cellgro	21-040-CV
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein	R&D Systems	308FKN
Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3)	R&D Systems	203-IL
Recombinant Human SCF Protein	R&D Systems	255-SC
Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO)	R&D Systems	288-TP
Total Antibody Compensation Bead Kit	thermofisher	A10497
Umbilical Cord-blood	Placental Blood Program at the New York Blood Center	http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/
Valproic acid sodium salt	Sigma-Aldrich	P4543