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  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este método proporciona un marco para el estudio de la incorporación de ácidos grasos exógenos de fuentes huésped complejas en membranas bacterianas, particularmente Staphylococcus aureus. Para lograrlo, se describen los protocolos para el enriquecimiento de partículas de lipoproteínas a partir de la yema de huevo de pollo y el posterior perfilado de ácidos grasos de fosfolípidos bacterianos utilizando espectrometría de masas.

Resumen

Staphylococcus aureus y otros patógenos Gram-positivos incorporan ácidos grasos del medio ambiente en fosfolípidos de membrana. Durante la infección, la mayoría de los ácidos grasos exógenos están presentes dentro de las partículas de lipoproteínas del huésped. Sigue habiendo incertidumbre en cuanto a los reservorios de ácidos grasos huésped y los mecanismos por los cuales las bacterias extraen ácidos grasos de las partículas de lipoproteínas. En este trabajo, describimos protocolos para el enriquecimiento de partículas de lipoproteínas de baja densidad (LDL) a partir de yema de huevo de pollo y determinando si los LDL sirven como reservorios de ácidos grasos para S. aureus. Este método explota el análisis lipidémico imparcial y los LDL de pollo, un modelo eficaz y económico para la exploración de interacciones entre LDL y bacterias. El análisis de la integración de S. aureus de ácidos grasos exógenos de lDL se realiza utilizando espectrometría de masas de alta resolución/precisa y espectrometría de masas en tándem, permitiendo la caracterización de la composición de ácidos grasos de la bacteria identificación imparcial de nuevas combinaciones de ácidos grasos que surgen en los lípidos de la membrana bacteriana al exponerse a los LDL. Estas técnicas avanzadas de espectrometría de masas ofrecen una perspectiva sin igual de la incorporación de ácidos grasos al revelar los ácidos grasos exógenos específicos incorporados en los fosfolípidos. Los métodos descritos aquí son adaptables al estudio de otros patógenos bacterianos y fuentes alternativas de ácidos grasos complejos.

Introducción

S. aureus resistente a la meticilina (MRSA) es la principal causa de infección asociada a la atención sanitaria y la resistencia a los antibióticos asociada es un desafío clínico considerable1,2,3. Por lo tanto, el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas es una alta prioridad. Una estrategia de tratamiento prometedora para patógenos Gram-positivos está inhibiendo la síntesis de ácidos grasos, un requisito para la producción de fosfolípidos de membrana que, en S. aureus, incluye fosfatidilglicerol (PG), lisil-PG, y cardiolipina4. En bacterias, la producción de ácidos grasos se produce a través de la vía de síntesis de ácidos grasos II (FASII)5, que es considerablemente diferente de la contraparte eucariota, haciendo de FASII un objetivo atractivo para el desarrollo de antibióticos5,6 . Los inhibidores de FASII se dirigen principalmente a FabI, una enzima necesaria para el alargamiento de la cadena de carbono de ácidos grasos7. El inhibidor FabI triclosán se utiliza ampliamente en bienes de consumo y médicos8,9. Inhibidores Adicionales FabI están siendo desarrollados por varias compañías farmacéuticas para el tratamiento de la infección por S. aureus 10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26. Sin embargo, muchos patógenos Gram-positivos, incluyendo S. aureus, son capaces de barrer ácidos grasos exógenos para la síntesis de fosfolípidos, eludiendo la inhibición FASII27,28,29. Así, el potencial clínico de los inhibidores FASII se debate debido a considerables lagunas en nuestro conocimiento de las fuentes de ácidos grasos del huésped y los mecanismos por los cuales los patógenos extraen ácidos grasos del huésped27,28. Para abordar estas lagunas, desarrollamos un método de análisis lipidomico imparcial para monitorear la incorporación de ácidogra exógeno a partir de partículas de lipoproteínas en fosfolípidos de membrana de S. aureus.

Durante la sepsis, las partículas de lipoproteínas huésped representan una fuente potencial de ácidos grasos derivados del huésped dentro de la vasculatura, ya que la mayoría de los ácidos grasos del huésped están asociados con las partículas30. Las lipoproteínas consisten en una cáscara hidrófila compuesta de fosfolípidos y proteínas que encierran un núcleo hidrófobo de triglicéridos y ésteres de colesterol31. El huésped produce cuatro clases principales de lipoproteínas (quilomicron, lipoproteína de muy baja densidad, lipoproteína de alta densidad y lipoproteína de baja densidad (LDL)) y funcionan como vehículos de transporte de lípidos, suministrando ácidos grasos y colesterol hacia y desde células anfitrionas a través de la vasculatura. Los LDL son abundantes en ácidos grasos esterificados incluyendo triglicéridos y ésteres de colesterol31. Hemos demostrado previamente que los LDL humanos altamente purificados son una fuente viable de ácidos grasos exógenos para la síntesis de PG, proporcionando así un mecanismo para el bypass inhibidor de FASII32. La purificación de los LDL humanos puede ser técnicamente difícil y llevar mucho tiempo, mientras que las fuentes comerciales de LDL humanos purificados son prohibitivamente costosas de usar de forma rutinaria o para realizar pantallas bacterianas a gran escala. Para hacer frente a estas limitaciones, hemos modificado un procedimiento para el enriquecimiento de LDL a partir de la yema de huevo de pollo, una rica fuente de partículas de lipoproteínas33. Hemos utilizado con éxito espectrometría de masas no objetivo, de alta resolución/precisa y espectrometría de masas en tándem para monitorear la incorporación de ácidos grasos derivados de LDL humanos en la membrana de S. aureus32. A diferencia de los métodos reportados anteriormente, este enfoque puede cuantificar isómeros de ácidos grasos individuales para cada uno de los tres tipos principales de fosfolípidos estafilocócicos. El ácido oleico (18:1) es un ácido graso insaturado presente en todas las partículas de lipoproteínas del huésped que se incorpora fácilmente en S. aureus phospholipids29,30,32. S. aureus no es capaz de síntesis de ácido oleico29; por lo tanto, la cantidad de ácido oleico incorporado en fosfolípidos establece la presencia de ácidos grasos derivados de lipoproteínas huésped dentro de la membrana estafilocócica29. Estas especies de fosfolípidos pueden ser identificadas por el método de espectrometría de masas de última generación descrito aquí, ofreciendo una resolución sin precedentes de la composición de la membrana de S. aureus cultivada en presencia de una fuente de ácidos grasos que probablemente durante la infección.

Protocolo

NOTA: El siguiente protocolo para el enriquecimiento de partículas LDL de yema de huevo de pollo se deriva de Moussa et al. 200233.

1. Preparación de yema de huevo de pollo para el enriquecimiento de partículas LDL

  1. Desinfecte dos huevos de pollo grandes lavando las cáscaras con una solución de etanol al 70% y deje secar al aire.
  2. Desinfecte el separador de huevos con una solución de etanol al 70% y deje secar al aire. Coloque el separador de huevos en el labio de un vaso de precipitados de tamaño mediano.
  3. Rompe cada huevo individualmente en el separador de huevos y deja que el albúmina fluya hacia el vaso de precipitados. La yema de huevo intacta será retenida por el separador.
  4. Lave la yema de huevo dos veces con 30 ml de solución salina estéril con fosfato (PBS) para eliminar el albúmina residual.
  5. Coloque suavemente la yema de huevo en el papel de filtro.
  6. Perforar la membrana vitelina con una punta de pipeta estéril y drenar el contenido de la membrana en un tubo de centrífuga cónico estéril de 50 ml. Deseche la membrana y el papel de filtro.

2. Fraccionamiento del plasma que contiene LDL a partir de yema de huevo de pollo

  1. Añadir aproximadamente dos volúmenes de 0,17 M NaCl a pH 7,0 a la yema de huevo y mezclar vigorosamente. A continuación, mezcle esta solución a 4 oC durante 60 min.
  2. Centrifugar la dilución de la yema de huevo a 10oC a 10.000 x g durante 45 min. Retire la fracción plasmática (sobrenadante) de la fracción granular (pellet) en un tubo cónico estéril de 50 ml.
  3. Repita el paso 2.2.

3. Aislamiento de partículas LDL del plasma

  1. Mezclar la fracción plasmática con 40% de sulfato de amonio (p/v) a 4 oC durante 60 min.
  2. Ajuste el pH de la fracción de plasma con una solución NaOH de 420 mM a 8,7.
  3. Centrifugar la dilución de la yema de huevo a 4 oC a 10.000 x g durante una duración de 45 min. Retire la fracción amarilla semisólida superior en tubos de diálisis de tamaño de poro de 7 kDa. Proporcione espacio en el tubo para permitir que se hinche.
  4. Dializar durante la noche a 4 oC en 3 L de agua ultrapura para eliminar el sulfato de amonio. Agitar suavemente el agua con una barra de agitación.
  5. Transfiera la solución dializada a un tubo centrífugo cónico estéril de 50 ml.
  6. Centrifugar la solución a 4oC a 10.000 x g durante una duración de 45 min. Retire cuidadosamente la fracción amarilla semisólida superior a un tubo estéril y guárdela a 4oC.

4. Evaluación de los LDL de pollo como fuente de ácidos grasos

  1. Subcultivo S. aureus células en 5 mL de caldo de triptona libre de ácidos grasos e incubar durante la noche a 37 oC con agitación (225 rpm). Para los auxotrofitos de ácidos grasos, suplemento cultivos con una fuente de ácidos grasos.
  2. Diluir los cultivos nocturnos a una densidad óptica (OD) a 600 nm (OD600) de 0,1 en 1% de caldo de triptona. Pipetear 50 l de la suspensión celular en cada pocal de una placa de 96 pocillos de fondo redondo.
    NOTA: Cuando trabaje con auxotrofotos ácidos grasos, lave los cultivos nocturnos en dos volúmenes de caldo de triptona y resuspenda en 5 ml de caldo de triptona para limitar el arrastre de ácidos grasos antes de determinar la DO del cultivo.
  3. Para los pozos que contienen controles no tratados, agregue 50 s de caldo de triptona al 1% por poca.
  4. A los pozos que contienen las suspensiones celulares experimentales, añadir 50 l de caldo de triptona al 1% complementado con 10% de LDL derivado de la yema de huevo, 2 éM de triclosán, o una mezcla de 10% de yema de huevo derivado de LDL y 2 M de triclosán.
    NOTA: En este punto, cada pozo contendrá 100 l y la concentración final de LDL y triclosán derivados de la yema de huevo por pozo será de 5% y 1 M, respectivamente.
  5. Mida OD600 con el tiempo, utilizando un lector de microplacas ajustado a 37 oC con agitación continua y lineal para monitorear el crecimiento.

5. Incubación de S. aureus con LDL para el análisis de lípidos de membrana.

  1. Cultivar una colonia aislada en 5 ml de caldo de triptona libre de ácidos grasos e incubar durante la noche a 37 oC con temblor (225 rpm).
  2. Diluir los cultivos nocturnos 1:100 en un matraz desconcertado estéril de 250 ml que contiene 50 ml de caldo de triptona al 1%. Incubar a la fase de registro medio (aproximadamente 4 h) a 37 oC con agitación.
  3. Transfiera 25 ml de cultivo a un tubo de centrífuga estéril de 50 ml y peletizar las células. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulos celulares en 750 s de caldo de triptona al 1%.
  4. Combine las células resuspendidas y la alícuota de 300 ml de la suspensión celular en un tubo de centrífuga estéril de 1,5 ml.
  5. Añadir los LDL a la concentración final deseada e incubar a 37oC con agitación (225 rpm) durante 4 h.
  6. Centrifugar los cultivos a 4 oC a 16.000 x g durante una duración de 2 min y lavar los gránulos celulares en dos volúmenes de PBS estéril y luego repetir.
  7. Registre el peso de cada pellet de célula sin húmeda. Congele los gránulos celulares en hielo seco o en nitrógeno líquido y guárdelos a -80 oC o proceda directamente a la sección 6.

6. Extracción de lípidos de membrana De S. aureus

  1. Coloque los gránulos congelados de la célula de S. aureus sobre hielo seco. Añadir cuentas de óxido de circonio de 0,5 mm en la parte superior de cada pellet celular, utilizando un volumen de cuentas aproximadamente igual al volumen del pellet celular.
    NOTA: Como alternativa a este método de extracción de lípidos, los investigadores pueden utilizar los métodos bien establecidos Bligh y Dyer o Folch para exigir lípidos de células bacterianas34.
  2. Añadir 740 l de metanol 75% (grado HPLC) refrigerado a -80 oC directamente a los pellets celulares.
  3. Añadir 2 ml de 50 m de dimyristoil fosfatidilcolina (preparado en metanol) por 1 mg de células como estándar interno. Cierre el tubo de ensayo y coloque los tubos centrífugos de 1,5 ml que contienen cada muestra en un puerto disponible en un homogeneizador de tejido Bullet Blender. Homogeneizar las muestras a baja velocidad, ajustando 2-3, durante 3 min.
  4. Inspeccione visualmente la homogeneidad de las muestras. Si los grupos de celdas son visibles, continúe la homogeneización en la mezcladora de balas en incrementos de 2 minutos.
  5. Retire las muestras de Bullet Blender y transfiera a una campana de humo químico.
  6. Añadir 270 l de cloroformo a cada tubo de muestra. Vortex las muestras vigorosamente durante 30 min.
    ADVERTENCIA: El cloroformo es un posible carcinógeno.
  7. Centrifugar las muestras en una centrífuga de sobremesa durante un máximo de 30 min a un mínimo de 2.000 x g. Se pueden utilizar velocidades más rápidas con tubos centrífugos compatibles y la duración de la centrifugación puede acortarse a 10 min.
  8. En una campana de humo químico, recoger el sobrenadante monofásico y transferir a un nuevo tubo de ensayo, evitando cuidadosamente el pellet de proteína en la parte inferior del tubo de extracción.
  9. Añadir 740 l de metanol 75% (grado HPLC) y 270 l de cloroformo a la proteína pellet, y volver a extraer cada muestra como se describe en los pasos 6.6-6.8 anteriores. Combine el sobrenadante de la segunda extracción con el sobrenadante previamente recolectado para cada muestra.
  10. Evaporar los disolventes de extracción bajo una corriente de gas inerte como nitrógeno o argón, o bajo vacío utilizando un concentrador de centrífuga (Tablade materiales).
  11. Lavar los extractos de lípidos secos tres veces con 1,0 ml de solución acuosa de bicarbonato de amonio de 10 mM y volver a secar las muestras como en el paso 6.10.
  12. Resuspender los extractos de lípidos secos en un disolvente no polar adecuado como el isopropanol. Resuspenda las muestras utilizando 20 ml por 1 mg de peso celular fresco determinado en el paso 5.7 Alternativamente, si se desconoce el peso de los gránulos celulares, resuspenda las muestras en 200 ml de isopropanol y proceda a la Sección 7.

7. Análisis de perfiles de lípidos de S. aureus utilizando espectrometría de masas de alta resolución/precisa

  1. Antes de realizar un análisis completo de lípidos, seleccione muestras de prueba representativas del grupo o grupos experimentales y analícelas en una serie de factores de dilución de muestras para determinar los rangos de dilución de muestras en los que las concentraciones totales de lípidos se encuentran dentro de lo lineal rango de respuesta del detector para el espectrómetro de masas, como se describió anteriormente35.
  2. Evaporar las alícuotas de cada extracto de lípidos de muestra que se someterá a análisis de lípidos, secando las alícuotas bajo gas inerte o bajo vacío en un concentrador de centrífuga (Tablade materiales).
  3. Resuspenda cada extracto de lípidoseco seco en cromatografía líquida– espectrometría de masas (LC-MS) grado isopropanol:metanol (2:1, v:v) que contenga formato de amonio de 20 mM, utilizando volúmenes equivalentes a un factor de dilución de muestra óptimo según se determina en el paso 7.1.
  4. Para un análisis de lípidos no dirigido, las muestras pueden introducirse directamente en la plataforma de espectrometría de masas de alta resolución/precisa sin el uso de cromatografía por inyección de flujo o infusión directa de extractos35,36. Transfiera los extractos de lípidos diluidos preparados en el paso 7.3 a un vial de automuestrador adecuado o placa de 96 pocillos.
  5. Para el análisis basado en inyección de flujo, coloque los viales del muestreador automático en un automuestreador controlado por temperatura (15 oC) de un sistema HPLC capaz de aplicaciones capilares/de bajo caudal, como un HPLC (Tablade Materiales)equipado con un flujo electrónico sistema de monitoreo de flujo.
  6. Llene los depósitos de disolvente HPLC con isopropanol de grado LC-MS:metanol (2:1, v:v) que contiene formatede de amonio de 20 mM.
  7. Usando el software Agilent Chemstation, programe el muestreador automático HPLC para realizar inyecciones de muestra de 5 l. En el menú Instrumento, seleccione Configurar inyectory escriba 5.0 en el campo Volumen de inyección. Las unidades se dan como microlitros. Asegúrese de que el HPLC esté configurado en flujo isocrático a 1 l por minuto de 2:1 (v:v) isopropanol:metanol que contenga un formate de amonio de 20 mM.
  8. En el menú Instrumento de Chemstation, seleccione Configurar bomba... y, a continuación, seleccione el interruptor de alternancia Modo de microflujo.
  9. En los campos Calendario, especifique: Tiempo 0,00, 100% B, Flujo 1,0. Pulse Intro y cree una segunda fila en el Calendario introduciendo Tiempo 10,0, 100% B, Flujo 1.0. Seleccione el botón Aceptar en la parte inferior del menú Configurar bomba. Estos ajustes permitirán 10 corridas analíticas a un caudal de 1,0 ml por minuto.
  10. Introducir eluado de la línea de transferencia HPLC al espectrómetro de masas utilizando una fuente de ionización de electrospray equipada con una aguja de metal de bajo flujo (34 G).
  11. Con el software de control de instrumentos Thermo Tune Plus, seleccione el menú Configuración y seleccione Fuente ESI calentada. Establezca la tensión de ionización en 4000 V y el gas de vaina en 5 (unidades arbitrarias) escribiendo estos valores en los campos correspondientes del cuadro de diálogo. Del mismo modo, ajuste la Temperatura Capilar a 150 oC y la lente S en 50%.
    NOTA: Estos valores deben optimizarse para cada plataforma de espectrometría de masas.
  12. Para el análisis de lípidos no dirigidos, utilice una plataforma mS de alta resolución/masa precisa (Tablade materiales)como detector.
  13. Con el software Thermo Tune Plus, haga clic en el botón Definir análisis y, en el menú Analizador, seleccione FTMS. Establezca el campo Rango de masaen en Normal y, en el campo Resolución, seleccione 100.000. Asegúrese de que Tipo de análisis esté establecido en Completo. En el menú Rangos de escaneado, escriba 200 en el campo Primera masa (m/z) e introduzca 2000 en el campo Ultima masa (m/z).
  14. Asegúrese de que se utiliza la polaridad negativa para detectar los lípidos de S. aureus más abundantes.
  15. Repita el análisis de la muestra utilizando la fragmentación de la espectrometría de masas en tándem (MS/MS) de todos los iones lipídicos dentro de una región espectral de interés para confirmar las estructuras lipídicas y los componentes de ácidos grasos. Alternativamente, los iones de lípidos seleccionados de interés pueden ser sometidos a análisis de MS/MS después de que se hayan asignado identificaciones iniciales de lípidos en la Sección 8.

8. Búsqueda de bases de datos para identificar los lípidos endógenos derivados de S. aureus y LDL exógenos

  1. Utilice el software Thermo Xcalibur para refinar aún más la precisión de masa observada. En Xcalibur, en el menú Herramientas, seleccione Recalibrar sin conexión. Después de que se abra la ventana Recalibrar sin conexión, cargue el archivo de espectro de masa que se va a recalibrar seleccionando el menú Archivo y seleccionando la opción Abrir.
  2. Abra el archivo de interés, cambie el botón Insertar fila en la parte superior de la ventana de vista para ver el cromatograma iónico total para la ejecución de MS. Promedio de las señales de LA MS adquiridas haciendo clic izquierdo en el ratón del ordenador en un borde del pico de señal observado en el cromatograma de iones total y arrastrando el ratón a través de la parte más ancha del pico.
  3. En el menú Filtro de escaneado, seleccione el filtro correspondiente a los datos de MS de escaneado completo. Cargue un archivo de referencia que contenga las masas monoisotópicas teóricas de al menos tres lípidos endógenos de S. aureus conocidos seleccionando el botón Load Ref... y seleccionando el archivo de referencia. Marque la casilla Usar junto a cada masa monoisotópica de lípidos.
  4. Haga clic en el botón Buscar en la parte inferior de la ventana de visualización. Vuelva a promediar la señal MS a través del pico de la señal en el cromatograma de iones total como se hizo anteriormente.
  5. Haga clic en el botón Convertir situado cerca de la parte inferior de la ventana de visualización. Cuando se abra el cuadro de diálogo Convertir, haga clic en Aceptar. Omita este paso si se recopilaron datos en plataformas de espectrometría de masas de proveedores distintos de Thermo Scientific.
  6. Con el software Xcalibur, exporte las listas de picos de masa precisas recalibradas para cada muestra no tratada o tratada con LDL a hojas de trabajo separadas de un archivo de Excel. Seleccione el icono Qual Browser. Abra el archivo recalibrado de interés seleccionando el menú Archivo y seleccionando la opción Abrir...
  7. Promedio de la señal a través del pico amplio en el cromatograma de iones total como se describe en el paso 8.2.
  8. Haga clic con el botón derecho del botón derecho en el icono de la huella digital en la ventana de visualización del espectro de masas y seleccione Ver . Lista de espectro. En el mismo menú, seleccione Opciones de visualización y, a continuación, cuadro de alternancia Todos los picos en el menú Visualización. Haga clic en el botón Aceptar para cerrar la ventana de visualización.
  9. Haga clic con el botón derecho del botón derecho en el icono de la huella digital en la ventana de visualización del espectro de masas de nuevo y seleccione la opción Exportar . Portapapeles (masa exacta). Pegue la celda de datos exportada A1 de la primera hoja de cálculo en una nueva hoja de cálculo de Excel.
  10. Elimine las primeras 8 filas de texto del archivo de datos exportado, de modo que la celda A1 de la hoja de cálculo de Excel contenga el primer punto de datos masivos del espectro de masas. Repita la exportación de cada archivo MS recalibrado, utilizando una nueva hoja de cálculo en el archivo de Excel para cada lista de picos exportados.
  11. Usando el software lipid Mass Spectral Analysis (LIMSA)37 Add-In for Excel, construya una base de datos que contenga fórmulas moleculares de especies de lípidos conocidas de S. aureus como se describe por Hewelt-Belka et al. 2014 38 , así como 201438, así como fórmulas que representan especies lipídicas que hipotéticamente podrían estar presentes en LDL.
    NOTA: Además, se debe tener cuidado de incluir posibles fórmulas moleculares en la base de datos de lípidos bacterianos hipotéticos que han incorporado importantes ácidos grasos LDL, como los ácidos grasos oleico (18:1) y linoleico (18:2)32.
  12. Para construir la base de datos, abra una hoja de cálculo de Excel en blanco. En la celda A1 de la primera hoja de trabajo, escriba la masa monoisotópica teórica/calculada de las especies lipídicas que se añadirán a la base de datos, correspondiente a la masa de la especie lipídica en el estado iónico observado en el espectrómetro de masas. En la celda B1, ingrese un nombre para las especies de lípidos, como PG(34:0).
  13. En la celda C1, ingrese la fórmula molecular para las especies de lípidos, correspondiente al estado iónico del lípido observado en el espectrómetro de masas. En la celda D1, ingrese la carga de la especie de lípidos como se observa en el espectrómetro de masas. Pase a la celda A2 para comenzar una nueva entrada para las próximas especies de lípidos que se introducirán en la base de datos de búsqueda.
  14. Repita los pasos 8.12 y 8.13 hasta que todas las especies de lípidos deseadas hayan sido introducidas en la base de datos. Guarde el archivo de base de datos y déjelo abierto en Excel.
  15. En Excel, seleccione el menú Complementos. Seleccione LIMSA para iniciar el software LIMSA. En el menú principal, haga clic en el botón Biblioteca compuesta... En la nueva ventana que aparece, haga clic en Importar compuestos. Esto cargará la base de datos compuesta para su uso por el software LIMSA.
  16. Realice identificaciones de lípidos basadas en masa precisa en todos los espectros de EM utilizando el complemento de software LIMSA para Excel de acuerdo con las instrucciones del proveedor35. En el menú principal de LIMSA, seleccione Lista de picos en el menú Tipo de espectro. Seleccione Modo positivo o Modo negativo para que se corresponda con la polaridad en la que se adquirieron los datos de LAM.
  17. En la ventana Peak fwhm (m/z), introduzca la ventana de búsqueda en masa deseada para el hallazgo máximo. Se recomienda una ventana de búsqueda de tolerancia de masa de 0.003-0.005 m/z para datos de MS de alta resolución/masa precisa.
  18. En la ventana Sensibilidad, introduzca el límite de línea base deseado (por ejemplo, 0,01% de abundancia relativa). En el menú Corrección de isótopos, seleccione Ajuste lineal o Restar algoritmos, cualquiera de los cuales se puede utilizar con datos de lista de picos.
  19. Resalte los compuestos lipídicos que se incluirán en la búsqueda de la base de datos haciendo clic en las especies de lípidos deseadas dentro de la ventana Compuestos disponibles. Haga clic en el botón Agregar para agregar especies de lípidos resaltados al grupo de búsqueda.
  20. Defina las normas internas haciendo clic en los compuestos añadidos y, a continuación, cambiando la ventana Concentración a la concentración correspondiente del estándar interno seleccionado.
  21. Asegúrese de que el estándar interno y las especies de lípidos seleccionadas que se van a cuantificar pertenezcan al mismo nombre de clase seleccionando cada especie de lípidos añadida y estándar interna y escribiendo un nombre de clase (como PG o Lípido) en el campo Clase.
  22. Para guardar el grupo de compuestos lipídicos que se pueden buscar para su uso futuro, haga clic en el botón Guardar situado junto al menú Grupos.
  23. Asegúrese de que el archivo de Excel que contiene todas las listas de picos de MS exportadas está abierto a la hoja correspondiente a la primera ejecución de S. aureus MS y, a continuación, haga clic en el botón Buscar del menú principal de LIMSA.
    NOTA: La salida de la búsqueda de la base de datos LIMSA incluirá una lista de características espectrales de masa coincidentes con los lípidos presentes en la base de datos construida en los pasos 8.12-8.13, así como las concentraciones para cada entidad coincidente después de la normalización a una o más seleccionadas normas internas.
  24. Utilice el software Xcalibur para examinar los espectros precisos de masa MS/MS para m/z correspondientes a iones lipídis de interés con el fin de confirmar los componentes de ácidos grasos presentes en cada especie molecular de lípidos identificada. Seleccione el icono Qual Browser. Abra el archivo MS/MS de interés seleccionando el menú desplegable Archivo y seleccionando la opción Abrir...
  25. Seleccione el filtro de escaneo correspondiente al análisis MS/MS de un lípido m/z de interés haciendo clic con el botón derecho del ratón en el icono de thumbtack en la ventana de visualización del espectro de masas y seleccione Rangos en el menú. En la nueva ventana que aparece, seleccione el menú Filtro para seleccionar el análisis.
  26. Promedio de la señal a través del cromatograma de iones total como se describe en el paso 8.2. Utilice el software MetaboAnalyst (www.metaboanalyst.ca) para realizar las pruebas estadísticas adecuadas. Evalúe la diferencia estadísticamente significativa en la composición de lípidos de S. aureus comparando las abundancias de lípidos normalizadas en condiciones no tratadas y tratadas con LDL.

Resultados

El protocolo para el enriquecimiento de LDL a partir de la yema de huevo de pollo se ilustra en la Figura1. Este proceso comienza diluyendo la yema de huevo entera con salina y separando los sólidos de yemade huevo conocidos como gránulos de la fracción soluble o plasmática que contiene los LDL (Figura 1)33. El contenido de LDL de la fracción plasmática se enriquece aún más con la

Discusión

S. aureus incorpora ácidos grasos exógenos en su membrana fosfolípidos27,32,43. La síntesis de fosfolípidos utilizando ácidos grasos exógenos evita la inhibición de faSII, pero también altera las propiedades biofísicas de la membrana27,32,44. Si bien la incorporación de ácidos grasos exógenos en fosfolípidos de pa...

Divulgaciones

Los autores no tienen revelaciones.

Agradecimientos

Agradecemos a los miembros del laboratorio Hammer por su evaluación crítica del manuscrito y el apoyo de este trabajo. El Dr. Alex Horswill de la Escuela de Medicina de la Universidad de Colorado amablemente proporcionó AH1263. El laboratorio del Dr. Chris Waters de la Universidad Estatal de Michigan proporcionó reactivos. Este trabajo fue apoyado por la concesión 16SDG30170026 de la Asociación Americana del Corazón y los fondos de puesta en marcha de la Universidad Estatal de Michigan.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Ammonium sulfateFisherBP212R-1≥99.5% pure
Cell culture incubatorThermoMaxQ 6000
CentrafugeThermo75-217-420Sorvall Legen XTR, rotor F14-6x250 LE
Costar assay plateCorning378896 well
Filter paperSchleicher & Schuell597
Large chicken eggN/AN/ACommon store bought egg
Microplate spectrophotometerBioTekEpoch 2
NaClSigmaS9625
S. aureus strain AH1263N/AN/AProvided by Alex Horswill of the University of Colorado
Dialysis tubingPierce687007,000 MWCO
TryptoneBecton, Dickison and Company211705
0.5 mm zirconium oxide beadsNext AdvanceZROB05
Bullet BlenderNext AdvanceBBX24B
Methanol (LC-MS grade)FisherA4561
Chloroform (reagent grade)FisherMCX10559
Isopropanol (LC-MS grade)FisherA4611
Dimyristoyl phosphatidylcholineAvanti Polar Lipids850345C-25mg
Ammonium bicarbonateSigma9830≥99.5% pure
Ammonium formateSigma70221-25G-F
Xcalibur softwareThermo ScientificOPTON-30801
LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometerThermo Scientifichigh resolution/accurate mass MS
Agilent 1260 capillary HPLCAgilent
SpeedVac Vacuum ConcentratorsThermo Scientific

Referencias

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