Genotipado de anémona sin mar durante el desarrollo temprano

Resumen

El objetivo de este protocolo es genotipo la anémona de mar Nematostella vectensis durante la gastrulación sin sacrificar el embrión.

Resumen

Aquí se describe un protocolo basado en PCR para genotipo el embrión de la etapa de gastrula del anthozoiano cnidario Nematostella vectensis sin sacrificar la vida del animal. Después de la fertilización in vitro y la desgelatina, se permite que los cigotos se desarrollen durante 24 horas a temperatura ambiente para llegar a la etapa de gastrula temprana a media. Los embriones de gastrula se colocan en un lecho de gel de agarosa en un plato de Petri que contiene agua de mar. Bajo el microscopio de disección, se utiliza una aguja de tungsteno para separar quirúrgicamente un fragmento de tejido abortivo de cada embrión. Los embriones post-cirugía se les permite sanar y continuar el desarrollo. El ADN genómico se extrae del fragmento de tejido aislado y se utiliza como plantilla para PCR específico del locus. El genotipo se puede determinar en función del tamaño de los productos PCR o de la presencia/ausencia de productos PCR específicos de alelos. Los embriones post-cirugía se clasifican según el genotipo. La duración de todo el proceso de genotipado depende del número de embriones a examinar, pero requiere mínimamente 4-5 h. Este método se puede utilizar para identificar mutantes noqueantes de una población genéticamente heterogénea de embriones y permite analizar fenotipos durante el desarrollo.

Introducción

Los cnidarios representan un grupo diverso de animales que incluyen medusas, corales y anémonas de mar. Son diploblasts, compuestos de ectodermo y endoderm que están separados por una matriz extracelular (mesoglea). Cnidaria es un grupo hermano de la especia bilateria, al que pertenecen1. modelos animales tradicionales como Drosophila y Mus. Además, se cree que la divergencia Cnidaria-Bilateria ocurrió en el período pre-Cambriano^2. Como tal, los estudios comparativos de cnidarios y bilaterianes son esenciales para obtener información sobre la biología de su ancestro común más reciente. Recientemente, la genómica comparativa ha revelado que los cnidarios y bilaterianes comparten muchos genes del kit de herramientas del desarrollo como la muesca y la bHLH, lo que implica que su ancestro común ya tenía estos genes^3. Sin embargo, el papel de estos genes del conjunto de herramientas de desarrollo en el último ancestro común de Cnidaria y Bilateria es comparativamente menos bien entendido. Para abordar este problema, es fundamental estudiar cómo funcionan estos genes profundamente conservados en los cnidarios.

Uno de los modelos genéticos cnidarios emergentes es el antozoiano Nematostella vectensis. Su genoma hasido secuenciado 3, y una variedad de herramientas genéticas, incluyendo el derribo genético mediado por morpholino, la transgénesis mediada por meganucleasas y los knockins y knockouts de genes mediados por CRISPR-Cas9, ahora están disponibles para su uso en este animal. Además, el desarrollo de Nematostella es relativamente bien entendido. Durante la embriogénesis, la gastrulation se produce por invaginación^4,y el embrión se convierte en una larva de planula de natación libre. La planula posteriormente se transforma en un pólipo sésil con boca y tentáculos circunportales. El pólipo entonces crece y alcanza la madurez sexual.

La mutagénesis dirigida mediada por CRISPR-Cas9 se utiliza ahora de forma rutinaria para estudiar la función génica en Nematostella vectensis^5,6,7,8,9. Para generar mutantes noqueadores en Nematostella, un cóctel que contiene ARN de una sola guía específicos de locus y la proteína endonuclease Cas9 se inyecta primero en huevos no fertilizados o fertilizados para producir animales fundadores de F0 que normalmente muestran Mosaicism. Los animales F0 son posteriormente elevados a la madurez sexual y cruzados entre sí paraproducir una población de F1, un subconjunto de los cuales pueden ser mutantes nocaut 6. Alternativamente, los animales F0 sexualmente maduros se pueden cruzar con animales de tipo salvaje para generar animales heterocigotos F1, y los heterocigotos F1 que llevan un alelo knockout en el locus de interés se pueden cruzar entre sí para producir descendencia F2, una cuarta parte de los cuales se espera que sean mutantes nocaut⁵. Ambos enfoques requieren un método para identificar mutantes noqueantes de una población genéticamente heterogénea. Los tentáculos de pólipos se pueden utilizar para extraer ADN genómico para el genotipado^6,7. Sin embargo, en los casos en que se está investigando la función de desarrollo del gen de interés y los embriones mutantes no alcanzan la etapa de pólipos (es decir, debido a la letalidad larvaria asociada con la mutación), los mutantes noqueantes deben ser identificados al principio de la ontogenia. Aquí se describe un protocolo basado en PCR para genotipo de animales individuales en la etapa de gastrula sin sacrificar al animal, que permite la identificación de mutantes noqueadores de una población genéticamente heterogénea de embriones. La duración de todo el proceso de genotipado depende del número de embriones a ser examinados, pero requiere mínimamente 4-5 h.

Protocolo

1. Inducción de desove, fertilización in vitro y de-jellying

1. Mantener nematostella vectensis en el agua de mar con una salinidad de 12 partes por mil (ppt) en la oscuridad a 16 oC, alimentando Artemia diariamente.
2. El día antes de la inducción del desove, coloque a los animales en una incubadora controlada por temperatura y luz. Programar la incubadora para que los animales estén expuestos a 8 h de luz a 25oC. Opcional: Alimente una pequeña pieza (<1 mm³) de ostra a animales individuales antes de colocarlos en la incubadora para mejorar el desove.
3. Dejar a los animales en la incubadora durante 1 h a 16oC.
4. Retire los animales de la incubadora y déjelos en una mesa con luz a temperatura ambiente (RT) para permitir el desove. El desove generalmente ocurre dentro de la siguiente 1.5–2 h.
5. Si los machos y las hembras están en recipientes separados, coloque los paquetes de óvulos del recipiente femenino en un recipiente macho que contenga espermatozoides utilizando una pipeta de transferencia cuya punta se corta para agrandar la abertura de modo que los óvulos no se dañen por estrés mecánico durante Transferencia. Deje fertilizar los óvulos dejándolos en el recipiente masculino durante al menos 15 minutos.
6. Desgela los paquetes de huevos en agua de mar que contiene 3% de cisteína (pH 7.4) en un plato de Petri o en un tubo de 15 ml. Agitar suavemente en una coctelera durante 12 minutos.
7. Utilice una pipeta de plástico para romper los grumos y continúe agitando durante otros 2-3 minutos hasta que se desenjuicie por completo.
8. Elimine la cisteína reemplazando los medios por agua de mar fresca durante al menos 5 veces.
9. Mantener los huevos fertilizados en un plato de Petri de vidrio a 16 oC o RT.

2. Extirpación quirúrgica de un tejido aboral de un embrión de gastrula

1. Preparar un tampón de extracción de ADN que consista en 10 mM Tris-HCl (pH 8), 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,3% Tween20, 0,3% NP40, y 1 mg/ml de proteinasa K. Utilice 20 ml del tampón de extracción por embrión. Mezclar bien mediante el vórtice y alícuota el búfer en tubos PCR.
2. Disolver 1% de agarosa en agua de mar y verter la en un plato de Petri para cubrir el fondo. Enfríe en una mesa de trabajo para hacer una cama de gel. Vierta agua de mar fresca para cubrir el lecho de gel en el plato Petri.
3. Transfiera embriones de 24 h después de la fertilización (hpf) (etapa de gastrula temprana a media) a la placa Petri que contiene un lecho de gel de agarosa.
4. Inserte una aguja de tungsteno en un soporte de aguja y esterilice sumergiendo la punta de la aguja en alcohol (70% o más) y colocándola en llamas para quemar el alcohol.
5. Bajo un microscopio de disección (con aumento de 20x a 40x), utilice la aguja de tungsteno para hacer una depresión en el lecho de agarosa quitando un pedazo de agarosa superficial del tamaño de un embrión a manipular, y coloque el embrión en la depresión con su lateral cara hacia abajo con el fin de restringir el movimiento del embrión para la microcirugía.
6. Utilice la aguja de tungsteno para extirpar quirúrgicamente un pedazo de tejido abortivo situado frente a la abertura blastoporal oral. Por lo general, es suficiente un aboral de un tercio a una cuarta parte del tejido embrionario a lo largo del eje oral-aboral.
7. Utilice una pipeta P20 para transferir el tejido aboral aislado (en <2 ml) a un tubo PCR que contenga 20 ml de tampón de extracción de ADN.
8. Transfiera el embrión post-cirugía a un pozo que contenga al menos 500 ml de agua de mar fresca en una placa de 24 o 96 pocillos.
9. Repita los pasos 2.4–2.8 para el número de embriones según sea necesario.
10. Coloque la placa de pozo que contiene embriones post-cirugía en una incubadora a 16 oC o RT hasta que se complete el genotipado.

3. Extracción de ADN genómico y genotipado PCR

1. Gire brevemente los tubos de PCR que contienen el tampón de extracción de ADN y los tejidos embrionarios aislados utilizando una minicentrífuga (por ejemplo, a 2.680 x g durante 10 s).
2. Para extraer ADN genómico de embriones individuales, incubar los tubos de PCR a 55 oC durante 3 h. Vórtice durante 30 s cada 30 min para asegurar la ruptura de los grumos celulares y mejorar la lisis celular.
3. Incubar los tubos de PCR a 95 oC durante 5 min para inactivar la proteinasa K.
4. Mantener los extractos de ADNG a 4 oC o sobre hielo, y proceder inmediatamente a la PCR.
   NOTA: El protocolo se puede pausar aquí colocando extractos de ADNa en un congelador de -20 oC.
5. Configure una reacción de PCR utilizando gDNA extraído como plantilla para amplificar el locus genómico de interés.
   1. Si los diferentes alelos en el locus de interés difieren en tamaño para que la diferencia de tamaño se pueda detectar mediante electroforesis de gel de agarosa, diseñe un solo conjunto de imprimaciones para amplificar todo el locus.
   2. Alternativamente, utilice imprimaciones específicas de alelos que generen productos de PCR sólo en presencia del alelo específico; por ejemplo, diseñando la imprimación que se une a una región que contiene mutaciones de inserción/eliminación.
   3. Utilice una mezcla de reacción PCR típica de 20 ml de la siguiente manera: 5 ml de extractos de ADNa-G, 8 ml de agua libre de nucleasa, 4 ml de tampón PCR, 0,2 ml de dNTPs de 10 mM, 0,6 ml de DMSO, 1 ml de imprimación directa de 10 ml, 1 ml de imprimación inversa de 10 mM , y 0,2 ml de ADN polimerasa (ver Tabla de Materiales).
      NOTA: Se pueden utilizar varios imprimadores en una reacción de PCR. Por ejemplo, se puede combinar una imprimación delantera universal y dos imprimaciones inversas específicas de alelos, siempre y cuando las dos imprimaciones inversas estén diseñadas para generar productos de PCR de tamaños distintos, de modo que la presencia/ausencia de los dos alelos pueda ser inequívoca electroforesis de gel (ver sección de resultados representativos).
6. Ejecute la electroforesis de gel de agarosa para determinar el tamaño y la presencia/ausencia de los productos pcR. Ajuste el estado de la electroforesis del gel de agarosa (por ejemplo, porcentaje de gel de agarosa, V/cm y duración) dependiendo del tamaño esperado de los productos de PCR.
7. Utilice los resultados de la PCR con respecto al tamaño y la presencia/ausencia de productos de PCR para asignar un genotipo a cada embrión post-cirugía. Por ejemplo, si se espera que diferentes alelos generen productos de PCR de diferentes tamaños, utilice la información de tamaño para asignar el genotipo para cada embrión. Si se utilizan imprimaciones específicas de alelo, los datos sobre la presencia/ausencia de productos PCR deben utilizarse para asignar un genotipo a cada embrión.
8. Ordenar embriones según genotipo.

Resultados

El genoma de Nematostella tiene un único locus que codifica una proteína precursora para el neuropéptido GLWamida. Tres alelos mutantes noqueados en este locus (glw^-a, glw^-b, y glw^-c) se han reportado previamente⁵. Cuatro machos heterocigotos que llevaban un alelo de tipo salvaje (+) y un alelo de nocaut ^enel locus GLWamide (genotipo: +/glw^-c)fueron cruzados con u...

Discusión

Aquí se describe un protocolo basado en PCR para genotipo un solo embrión de anémonas de mar sin sacrificar al animal. Después del desove y la desgelatina, los huevos fertilizados se pueden convertir en gastrulas. La región aborta de cada embrión de gastrula se extrae quirúrgicamente, y el tejido aboral aislado se utiliza para la extracción genómica posterior de ADN, mientras que los embriones post-cirugía restantes sanan y continúan el desarrollo. Los extractos de ADNG se utilizan para un ensayo de PCR para d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila Peltier Refrigerated Incubator	Shellab	SRI6PF	Used for spawning induction
Instant ocean sea salt	Instant ocean	138510
Brine shrimp cysts	Aquatic Eco-Systems, Inc.	BS90
L-Cysteine Hydrochloride	Sigma Aldrich	C7352
Standard Orbital Shaker, Model 3500	VWR	89032-092
TRIS-HCl, 1M, pH8.0	QUALITY BIOLOGICAL	351-007-01
Potassium chloride	VWR	BDH9258
EDTA, 0.5M pH8	VWR	BDH7830-1
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
Nonidet-P40 Substitute	US Biological	N3500
Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade	ThermoFisher	25530049
Agarose	VWR	710
Micro Dissecting needle holder	Roboz	RS-6060
Tungsten dissecting needle	Roboz	RS-6063
PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers	Eppendorf	E6336000024
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	New England BioLabs	M0530L
dNTP mix	New England BioLabs	N0447L
GLWamide universal forward primer			5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’
Reverse primer specific to glw-a			5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’
Reverse primer specific to glw-c			5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’