Uso de fluorescencia de infrarrojo cercano y escaneo de alta resolución para medir la expresión de proteína en el cerebro de roedores

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo que utiliza colorantes de infrarrojo cercano junto con inmunohistoquímica y escaneo de alta resolución para analizar las proteínas en las regiones cerebrales.

Resumen

La neurociencia es el estudio de cómo las células en el cerebro median diversas funciones. La medición de la expresión proteica en las neuronas y la glia es fundamental para el estudio de la neurociencia, ya que la función celular está determinada por la composición y la actividad de las proteínas celulares. En este artículo, describimos cómo la inmunocitoquímica se puede combinar con el escaneo de alta resolución de infrarrojo cercano para proporcionar una medida semi-cuantitativa de la expresión proteica en regiones cerebrales distintas. Esta técnica se puede utilizar para expresión de proteína simple o doble en la misma región del cerebro. La medición de proteínas de esta manera se puede utilizar para obtener un cambio relativo en la expresión de proteínas con una manipulación experimental, la firma molecular del aprendizaje y la memoria, la actividad en vías moleculares y la actividad neuronal en múltiples regiones cerebrales. Utilizando las proteínas correctas y el análisis estadístico, la conectividad funcional entre las regiones cerebrales también se puede determinar. Dada la facilidad de implementación de la inmunocitoquímica en un laboratorio, el uso de inmunocitoquímica con escaneo de alta resolución de infrarrojo cercano puede expandir la capacidad del neurocientífico para examinar los procesos neurobiológicos a nivel de sistemas.

Introducción

El estudio de la neurociencia se refiere a una investigación de cómo las células en el cerebro median funciones específicas¹. Estos pueden ser de naturaleza celular como cómo las células de la glia confieren inmunidad en el sistema nervioso central o pueden implicar experimentos que tienen como objetivo explicar cómo la actividad de las neuronas en el hipocampo dorsal conduce a la navegación espacial. En un sentido amplio, la función celular está determinada por las proteínas que se expresan en una célula y la actividad de estas proteínas². Como resultado, medir la expresión y/o actividad de las proteínas en las células cerebrales es fundamental para el estudio de la neurociencia.

Hay una serie de técnicas disponibles para medir la expresión de proteínas en el cerebro. Estos incluyen métodos in vivo como la topografía de emisión de positrones para densidades de receptores³ y micro-diálisis para péptidos pequeños⁴. Más comúnmente, los métodos ex vivo se utilizan para examinar la función y expresión de las proteínas. Estos incluyen las técnicas de espectrometría de masas⁵, Western Blot y el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)⁶e inmunocitoquímica⁷. La inmunocitoquímica es ampliamente utilizada en el campo de la neurociencia. Esta técnica implica el uso de un anticuerpo primario para detectar una proteína (o antígeno) de interés (p. ej., c-Fos) y un anticuerpo secundario conjugada para detectar el complejo proteico-primario de anticuerpos (figura 1). Para permitir la detección del complejo de anticuerpos secundario-anticuerpo primario-proteico, los anticuerpo secundarios tienen agentes oxidantes como la peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugados con ellos. Esto permite la formación de precipitados en las células que se pueden detectar mediante microscopía ligera⁷. Los anticuerpos secundarios también pueden tener compuestos químicos fluorescencia conjugados a ellos (es decir, fluoróforos). Cuando se estimulan estos productos químicos emiten luz, que se puede utilizar para detectar proteína-anticuerpo primario-complejos de anticuerpos secundarios⁷. Por último, a veces los anticuerpos primarios tienen agentes reductores y sustancias químicas de fluorescencia que se unen a ellos negando directamente la necesidad de anticuerpos secundarios⁷ (figura 1).

Curiosamente, muchos métodos de inmunocitoquímica permiten la visualización de proteínas en las células cerebrales, pero no la capacidad de cuantificar la cantidad de proteína en una región específica de la célula o el cerebro. El uso de microscopía de luz para detectar precipitados de las reacciones de reducción permite la visualización de las neuronas y la glia, pero este método no se puede utilizar para cuantificar la expresión proteica en las células o en una región cerebral específica. En teoría, la microscopía de fluorescencia se puede utilizar para esto, porque la luz emitida por el anticuerpo secundario fluorescente es una medida del complejo de anticuerpos secundario-anticuerpo primario-proteico. Sin embargo, la autofluorescencia en el tejido cerebral puede dificultar el uso de la microscopía de fluorescencia para cuantificar la expresión proteica en el tejido cerebral⁸. Como resultado, la luz emitida por imágenes fluorescentes de tejido cerebral raramente se utiliza para cuantificar la expresión proteica en el cerebro.

Muchos de estos problemas se pueden abordar utilizando inmunocitoquímica de infrarrojo cercano junto con el escaneo de alta resolución^9,10. En este artículo, describimos cómo la inmunocitoquímica junto con los fluoróforos en los espectros de emisión de infrarrojo cercano se pueden combinar con el escaneo de alta resolución (por ejemplo, 10 – 21 μm) para obtener imágenes nítidas que permiten la semicuantificación de proteínas en distintas regiones cerebrales.

Protocolo

El siguiente protocolo fue aprobado por el Comité institucional de cuidado y uso de animales (IACUC) de la Universidad de Delaware. Las ratas macho de Sprague Dawley, de aproximadamente 55 a 75 días de edad, se utilizaron para este protocolo.

1. extracción del cerebro y preparación de tejido

1. Anestesiar rata con isoflurano en la cámara de inducción de anestesia hasta que la rata ya no exhibe una respuesta al pellizco del pie.
2. Sacrificar ratas a través de una rápida decapitación usando una guillotina.
3. Corte la piel en el cráneo posterior a la anterior y despejada de la parte superior del cráneo.
4. Usa los roedores para remover cuidadosamente la parte posterior del cráneo, y luego usando pequeñas tijeras diseccionantes cortadas hacia abajo de la línea media del cráneo, empujando hacia arriba contra la parte superior del cráneo en todo momento para evitar dañar el tejido cerebral.
5. Usa los roedores para quitar la mitad derecha e izquierda del cráneo para exponer el cerebro.
6. Utilice una pequeña espátula para recoger bajo el cerebro y cortar los nervios, elevar cuidadosamente el cerebro y congelar los cerebros en isopentano refrigerado en hielo seco (al menos-20 ° c). Después de esto, almacenar los cerebros en un congelador-80 ° c hasta rebanar.
7. Rebanar cerebros en regiones de interés a 30 – 50 μm en un criostato mantenido entre-9 ° c y-12 ° c. Monte directamente las rodajas sobre los portaobjetos de vidrio y guárdela en un congelador de-80 ° c hasta el momento del ensayo de inmunocitoquímica.
   Nota: En este protocolo, las regiones cerebrales de interés eran el hipocampo y la amígdala.

2. reacción inmunohistoquímica única

Nota: Para la reacción inmunohistoquímica doble, el protocolo es el mismo que la reacción inmunohistoquímica única, excepto que esta reacción tiene dos anticuerpos primarios de diferentes hospedadores (por ejemplo, conejo y ratón) y dos anticuerpos secundarios para el correspondiente primarias deben ser de un solo huésped (p. ej., anticonejo de cabra y antiratón de cabra). Los anticuerpos secundarios también tienen que ser de dos espectros diferentes que están disponibles en escáneres de alta resolución. Por ejemplo, un anticuerpo secundario con un pico del espectro de emisión a 680 nm y un anticuerpo secundario 800CW (pico del espectro de emisión a 780 nm).

1. Retire los portaobjetos de vidrio del congelador y deje que se equilibren a temperatura ambiente durante 30 minutos.
2. Bajo una campana de humo, fijar el tejido cerebral en 4% paraformaldehído en 0,1 M fosfato amortiguado salina (PBS) para 1 − 2 h a temperatura ambiente.
3. Enjuague las diapositivas en 0,1 M Tris con solución salina tamponada (TBS) tres veces durante 10 min cada una. Permeabilizar las membranas celulares incubando diapositivas en un detergente suave (por ejemplo, 0,01% detergente) durante 30 − 60 min.
4. Enjuague las diapositivas en TBS tres veces durante 15 min cada una.
5. Diluir el anticuerpo primario para la proteína de interés en PBS en la concentración correcta. Por ejemplo, para detectar el gen temprano inmediato c-Fos, preparar un anticuerpo primario anti c-Fos de conejo en una concentración de 1:500.
6. Pipetear la solución de anticuerpos primarios directamente sobre el tejido cerebral (aproximadamente 200 μL por diapositiva de 3 pulgadas x 1 pulgada).
7. Utilice cubreobjetos para incubar el tejido cerebral sobre láminas de vidrio en la dilución de anticuerpos primarios para 1 − 2 h a temperatura ambiente o durante la noche (~ 17 h) a 4 ° c.
8. Retire los cubreobjetos y lave las diapositivas en TBS que le hayan añadido una pequeña cantidad de detergente (p. ej., 0,01% de detergente, "TBS-T") cuatro veces durante 15 min cada una.
9. Utilice cubreobjetos para incubar las secciones cerebrales en un anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 2 h.
   Nota: El anticuerpo secundario debe ser a la dilución correcta y en un diluyente que contenga TBS, detergente y 1,5% del suero huésped. Por ejemplo, un anticuerpo secundario de cabra en una dilución de 1:2000 contendrá un 1,5% de suero de cabra y un 0,05% de detergente.
10. Enjuague las diapositivas en TBS-T cuatro veces durante 20 min cada una, y luego en TBS cuatro veces por 20 min cada una.
11. Seque los toboganes a temperatura ambiente en la oscuridad durante la noche. Cuando las diapositivas están secas, están listas para la toma de imágenes.

3. imágenes

1. Coloque las diapositivas sobre la interfaz de escaneo infrarrojo cercano con el tejido hacia abajo. Cualquiera de las imágenes una diapositiva de cristal o varias diapositivas a la vez utilizando una herramienta de selección.
2. Diapositivas de imagen utilizando el ajuste de la más alta calidad con un desplazamiento de 0 nm y una resolución de 21 μm. El escaneo típicamente tomará de 13 − 19 h dependiendo del equipo de escaneo utilizado.
3. Importar imágenes en el software de análisis de imagen (por ejemplo, ImageStudio) para ver y marcar para análisis de proteínas semi-cuantitativos.

4. Análisis de expresión proteica

1. Abra el software de análisis de imagen y seleccione el área de trabajo en la que se escaneó la imagen.
2. Abra la imagen escaneada en el software de análisis de imágenes para ver el escaneo, y ajuste las longitudes de onda visualizadas, así como el contraste, brillo y magnificación mostrados sin alterar la imagen cruda o la emisión total cuantificada.
3. Identifique las regiones clave para la cuantificación y seleccione la pestaña análisis a lo largo de la parte superior de la página, luego seleccione dibujar rectángulo (o dibujar elipse/dibujar mano alzada) para dibujar un rectángulo sobre el área que se cuantificarán.
4. Para ver el tamaño del rectángulo, seleccione formas a lo largo de la parte inferior izquierda de la pantalla y, a continuación, seleccione columnas a lo largo de la parte inferior derecha. Agregue columnas height y width para identificar el tamaño de la forma.
   Nota: Es importante controlar el tamaño de la forma al comparar la cuantificación. Se recomienda utilizar formas idénticas colocadas dentro de la ubicación de cuantificación deseada, con el fin de obtener un muestreo preciso de las emisiones para esa región.
5. Luego nombra la forma y repite. Una vez que se muestrean todas las regiones, los datos disponibles en la pestaña columnas se pueden agregar y analizar.

Resultados

Antes de usar la exploración de alta resolución para la inmunohistoquímica, uno debe verificar que el protocolo funciona. Esto se puede lograr usando un ensayo de validación donde las secciones cerebrales del mismo animal son incubadas con anticuerpos primarios y secundarios, anticuerpo secundario solo, o ningún anticuerpo primario ni secundario. Los resultados de este ensayo de validación se muestran en la figura 2. En esta reacción detectamos el gen ...

Discusión

Los resultados presentados en este artículo muestran que la inmunocitoquímica del infrarrojo cercano en combinación con la exploración de alta resolución se puede utilizar para obtener medidas semicuantitativas de la expresión de la proteína en el tejido cerebral. También se puede utilizar para etiquetar dos proteínas simultáneamente en la misma región del cerebro. Hemos utilizado previamente inmunohistoquímica de infrarrojo cercano para medir la expresión génica temprana inmediata en múltiples regiones ce...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brain Extraction
Anesthesia Induction Chamber	Kent Scientific	VetFlo-0530SM
Kleine Guillotine	Harvard Apparatus	73-1920
Friedman Rongeur	Fine Science Tools	16000-14	used to remove back of skull
Delicate Dissecting Scissors	Fischer Scientific	08-951-5	used to cut upward along midline of skull
Micro Spatula	Fischer Scientific	21-401-5	used to scoop out brain
Glass Microscope Slides	Fischer Scientific	12-549-6
Immunohistochemical Reaction
Triton X-100			Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody
Tween-20			Used as a small amount of detergent added to TBS  to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody
Licor Odyssey scanner	Licor Biotechnology Inc.
Image Studio	Licor Biotechnology Inc.