Evaluación de la capacidad de respuesta del tono vascular utilizando arterias mesentérica aisladas con un enfoque en la modulación por tejidos adiposo perivasculares

Resumen

El protocolo describe el uso de la miografía por cable para evaluar la tensión isométrica transmural de las arterias mesentérica aisladas de los ratones, con especial consideración de la modulación por factores liberados de las células endoteliales y los tejidos adiposo perivasculares.

Resumen

La respuesta alterada del tono vascular a los estímulos fisiopatológicos contribuye al desarrollo de una amplia gama de enfermedades cardiovasculares y metabólicas. La disfunción endotelial representa un importante causante de la reducción de la vasodilatación y una mayor vasoconstricción de las arterias. Los tejidos adiposo (grasa) que rodean las arterias desempeñan un papel importante en la regulación de la relajación y/o contracción dependiente del endotelio de las células musculares lisas vasculares. Las conversaciones cruzadas entre el endotelio y los tejidos adiposos perivasculares pueden evaluarse ex vivo utilizando vasos sanguíneos montados por un sistema de miografía por cable. Sin embargo, se deben establecer ajustes óptimos para las arterias derivadas de animales de diferentes especies, edades, antecedentes genéticos y/o condiciones fisiopatológicas.

Introducción

Las dilataciones y constricciones de las arterias se logran mediante relajaciones y contracciones, respectivamente, de sus células musculares lisas vasculares. Los cambios en la capacidad de respuesta vascular de las arterias pequeñas contribuyen a la regulación homeostática de la presión arterial por los nervios y las hormonas autonómicas presentes en la sangre (p. ej., catecolaminas, angiotensina II, serotonina, vasopresina). A nivel local, las respuestas vasculares de las células musculares lisas son modulada por las señales de las células endoteliales de la íntima y el tejido adiposo que rodea las arterias (figura 1).

El endotelio no es sólo una barrera pasiva, sino que también sirve como una superficie para intercambiar señales entre la sangre y las células musculares lisas vasculares subyacentes. Al liberar varias sustancias vasoactivas, el endotelio desempeña un papel fundamental en el control local de las respuestas del tono vascular¹. Por ejemplo, en respuesta a la acetilcolina, óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) se activa en el endotelio para producir óxido nítrico (NO), que induce la relajación del músculo liso vascular subyacente mediante la activación soluble guanylyl ciclasa (sGC) ². otras sustancias vasoactivas incluyen los productos de ciclooxigenasas (p. ej., prostaciclina y tromboxano A₂), lipoxigenasa (por ejemplo, ácidos 12-hidroxieicosatetraenoico, 12-hete) y monooxigenasas del citocromo P450 (HETES y ácidos epoxieicosatrienoicos, EETs), especies reactivas de oxígeno (ROS) y péptidos vasoactivos (p. ej., endotelina-1 y angiotensina II) y factores hiperpolarizantes derivados del endotelio (EDHF)³. Un delicado equilibrio entre los vasodilatadores derivados del endotelio y vasoconstrictores mantienen el tono vasomotores local^4,5.

La disfunción endotelial se caracteriza por el deterioro de la vasodilatación dependiente del endotelio⁶, un sello distintivo del envejecimiento vascular⁷. Con la edad, la capacidad del endotelio para promover la vasodilatación se reduce progresivamente, debido en gran parte a una disminución NO biodisponibilidad, así como la expresión anormal y función de eNOS en el endotelio y sGC en las células musculares lisas vasculares^{8 , 9 , 10}. la reducción de la biodisponibilidad no potenciúa la producción de vasoconstrictores dependientes del endotelio^11,12. En las arterias envejecidas, la disfunción endotelial causa hiperplasia en los medios, como se refleja en los aumentos marcados en el espesor de la pared, número de núcleos mediales, que son una reminiscencia del engrosamiento arterial en la hipertensión y la aterosclerosis observada en humanos pacientes^13,14. Además, condiciones fisiopatológicas como la obesidad, diabetes o hipertensión aceleran el desarrollo de la disfunción endotelial^15,16.

El tejido adiposo perivascular (pvat) libera numerosos Adipocinas para regular la estructura vascular y la función¹⁷. El efecto anticontráctil de la pvat está mediado por factores relajantes, como adiponectina, no, peróxido de hidrógeno y sulfuro de hidrógeno^18,19,20. Sin embargo, dependiendo de la ubicación y la condición fisiopatológica, PVAT también puede mejorar las respuestas contráctiles en varias arterias²¹. Las sustancias procontráctiles producidas por pvat incluyen angiotensina-II, leptina, resistin y Ros^22,23.  En la mayoría de los estudios sobre los vasos sanguíneos aislados, PVAT se ha considerado como un simple apoyo estructural para la vasculatura y así eliminado durante la preparación de los segmentos de anillo de los vasos sanguíneos. Dado que la disfunción adiposa representa un factor de riesgo independiente para la hipertensión y las complicaciones cardiovasculares asociadas²⁴, la pvat que rodea los vasos sanguíneos debe tenerse en cuenta al investigar la respuesta vascular de diferentes arterias.

Los sistemas de miografía de alambre múltiple han sido ampliamente utilizados para investigar las funciones vasomotoras de una variedad de vasos sanguíneos, incluyendo las arterias aorta, mesentérica, renal, femoral, cerebral y coronaria^25,26. Los protocolos descritos en este documento utilizarán la miografía por cable para evaluar la capacidad de respuesta vascular en las arterias mesentérica aisladas de los modelos de ratones modificados genéticamente, con un enfoque especial en la modulación por PVAT.

Protocolo

Todos los animales utilizados para el siguiente estudio fueron provistos por la unidad de animales de laboratorio de la Facultad de medicina, la Universidad de Hong Kong. Se obtuvo la aprobación ética del Comité Departamental de uso de animales de laboratorio para la docencia y la investigación (CULATR, Nº: 4085-16).

1. preparaciones

1. Preparación de fármacos
   1. Almacene los medicamentos apropiadamente como se indica en la ficha de datos de seguridad (MSDS) inmediatamente después de recibirlos. Disolver los fármacos en forma de polvo en disolventes como soluciones de alta concentración y luego alícuota para almacenamiento a-20 ° c.
      Nota: la mayoría de los fármacos se disuelven en agua destilada para preparar las soluciones en stock; puede ser necesario calentar o sonicación para algunos fármacos. Si los fármacos no se disuelven completamente en agua, se puede añadir una gota de 1 M NaOH, mientras que para los fármacos básicos se puede utilizar una gota de 1 M HCl. Los fármacos hidrófobos se pueden disolver en dimetilsulfóxido (DMSO) o en etanol absoluto. En estos últimos casos, debe conocerse la concentración final del baño (en M) y se deben realizar los controles apropiados para descartar los efectos de los disolventes.
   2. Antes de experimentar, disolver los alícutes de la droga (tabla de materiales) en la solución de bicarbonato de Krebs-Ringer (Krebs) que contiene 115 mm nacl, 4,6 mm KCl, 2,5 mm CaCl₂, 1,17 mm mgso₄, 1,17 mm KH₂po₄, 25 mm NaHCO_3, 11,1 mm D-glucosa y 0,01 mm EDTA, pH 7,4.
   3. Para las curvas de concentración-respuesta acumuladas, prepare las existencias y las soluciones de trabajo de diferentes fármacos mediante diluciones seriales (tabla 1).
2. La configuración del instrumento
   1. Calibrar el transductor de fuerza para todos los canales antes de utilizar el sistema de miografía en cada día, o cada vez que el sistema se ha movido.
      Nota: el procedimiento de calibración detallado varía según el modelo. En general, se aplica un peso de dos gramos a las mandíbulas y la fuerza correspondiente debe 9,81 ± 0,1 mN. Si la lectura está apagada en más de 0,1 mN, el transductor debe volver a calibrarse. Para el sistema utilizado en el presente Protocolo (véase la tabla de materiales), los valores de funcionamiento del transductor de fuerza durante la calibración deben estar entre 3000 y 3500. Si el valor del transductor es mayor o menor, se debe reemplazar el transductor de fuerza.
   2. Ajuste y alinee los soportes de montaje en cada cámara. El uso continuo y repetido de la cámara del miograma puede causar cierta desalineación del soporte de montaje, que necesita un ajuste ocasional antes de los experimentos para asegurar que las mandíbulas están correctamente alineadas.
      Nota: es necesario prestar especial atención al ajustar los soportes de montaje, ya que los transductores de fuerza son muy sensibles y frágiles.
   3. Encienda los calentadores y gases (95% O₂ y 5% Co₂) al menos 30 minutos antes del experimento para permitir que las cámaras y los amortiguadores se calienten hasta 37 ± 0,1 ° c y se equilibren con la mezcla de gas.
      1. Compruebe la temperatura en el termómetro para garantizar la precisión del calentador. La temperatura se puede modificar para ejecutar experimentos de enfriamiento o calentamiento. Si la temperatura no es correcta según lo establecido, aplique la función offset de la máquina para aumentar o disminuir los ajustes para alcanzar la temperatura requerida.
   4. Al final del experimento, limpie todas las cámaras y apague el calentador, así como el gas que se ejecuta en la configuración.
      1. No apague el gas antes de que todo el líquido en la cámara haya sido succionado fuera del sistema, de lo contrario el ácido/agua destilada puede regurgitar y llegar a la cámara de órganos durante el próximo uso.
      2. Para limpiar las cámaras del miograma de alambre, la forma más eficaz es realizar lavado ácido utilizando una solución de ácido acético diluido. Limpie el borde y el interior de las cámaras con un bastoncillo de algodón.
      3. Después del lavado, enjuague bien las cavidades con agua destilada. Limpie el exterior de las cavidades con un paño húmedo para eliminar la sal seca. El etanol también se puede utilizar si se han utilizado fármacos hidrófobos durante el experimento.
      4. Un ejemplo del procedimiento de lavado es el siguiente. Llenar las cavidades con un 8% de solución de ácido acético e incubar durante 2 min. Utilice un aplicador con punta de algodón para limpiar mecánicamente la superficie de la cámara de acero. Evite cualquier contacto con la parte de aluminio del miograma.
      5. Aspirar el ácido acético y lavar la cámara del miograma y apoya varias veces con agua destilada y secar las superficies utilizando papel absorbente o aplicadores de punta de algodón.
3. Disección de los anillos arteriales mesentéricos
   Nota: los animales utilizados para el estudio actual fueron dieta alta en grasas alimentados con ratones Adipo-SIRT1 macho y camada de tipo salvaje como controles. Cada animal pesaba aproximadamente 45 g en el momento de los experimentos.
   1. Eutanasia al ratón por inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (50 mg/kg).
   2. Con tijeras quirúrgicas y fórceps, realizar una laparotomía de línea media para revelar el contenido abdominal.
   3. Recoja el Arcade mesentérico en una placa de Petri recubierta de silicio.
   4. Esparcir y anclar la red mesentérica en la placa de Petri para revelar la ramificación de mesenty y tejido conjuntivo.
   5. Bajo un microscopio (10x), y con tijeras finas y fórceps, diseccionar cuidadosamente los tejidos conectivos circundantes. Evite dañar la capa adventicial. Alternativamente, el tejido adiposo circundante se puede retener alrededor del vaso sanguíneo para experimentar (si es necesario).
   6. Usando las tijeras finas y fórceps, el consumo de las ramas secundarias de las arterias mesentérica en el tampón de Krebs frío hielo.
      Nota: cada investigador debe tener su propio conjunto de kit de disección, cuerdas y estribos. Estas herramientas deben mantenerse correctamente y limpiarse cada vez después del experimento ya que algunos fármacos son difíciles de lavar y los residuos pueden adherirse a ellos.
      1. Mantenga los vasos sanguíneos en frío tampón de Krebs mientras separa los tejidos conectivos circundantes, incluyendo PVAT. Durante la manipulación del vaso sanguíneo, sea suave para evitar daños innecesarios en el endotelio.
      2. Si el experimento involucra el estudio de PVAT, conserve una esfera de 1,5 a 2 mm de diámetro de PVAT alrededor del vaso sanguíneo. Alternativamente, se pueden agregar las mismas cantidades de tejidos adiposo en cada cámara para experimentar.
   7. Opcional Retire el endotelio del vaso sanguíneo diseccionado como un control para evaluar la dependencia del endotelio de las respuestas. Para las arterias mesentérica, retire el endotelio deslizando suavemente sobre un estribo de alambre o un cabello.
   8. Cortar el vaso sanguíneo preparado como arriba en anillos pequeños (~ 2 mm de longitud) y ponerlos en un plato de plástico lleno de aireado (95% O₂ y 5% Co₂) tampón Krebs para su posterior montaje en las cámaras de un miografo de alambre²⁷.
   9. Transfiera los anillos de los vasos a una cámara de miografía colocada bajo el microscopio. Los anillos deben colocarse uniformemente, con los estribos superior e inferior paralelos. El alambre de fijación (40 μm) debe ser recién preparado ya que los fármacos pueden unirse a las cuerdas.
   10. Enrosque el anillo de los vasos sanguíneos en una longitud adecuada (2 cm) del alambre y asegure a una mandíbula de la cámara de montaje atornillando para fijar la posición.
   11. Pasa un segundo alambre a través del anillo y ancla a la mandíbula opuesta.
   12. Con anillos roscados y asegurados a las mandíbulas de la cámara, Monte la cámara en la configuración del miograma y gire el tornillo del micrómetro hacia la derecha para mover los alambres cerca uno del otro hasta que la lectura de la fuerza en la interfaz de usuario correspondiente a la cámara montada sea cero o simplemente Abajo.
       Nota: el alambre conectado a la mandíbula superior debe ser de longitud mínima para asegurar que la tensión puede ser completamente transducidas al detector.
   13. Equilibrar los preparativos a 37 ° c durante al menos 30 minutos antes de la primera aplicación de la fuerza utilizando el micrómetro ajustable.
   14. Evaluar la viabilidad del tejido en 115 mM de alto potasio (NaCl reemplazado por KCl sobre una base molar) Krebs conteniendo 4,6 mm NaCl, 115 mM KCl, 2,5 mm cacl₂, 1,17 mM MGSO₄, 1,17 mm KH₂po₄, 25 mm NaHCO₃ y 11,1 mM D-glucosa a pH 7,4.
       Nota: los recipientes aislados se consideran viables si la fuerza contráctil transducida y registrada como desviación por encima de la línea de base en el software de grabación de datos del sistema de miografía es más del 40% de su tono de reposo, en respuesta a un agente contráctil. Si la arteria no se contrae apropiadamente, entonces la tensión basal/presión de pared óptima no se ha ajustado correctamente o la arteria puede haber sido dañada durante el aislamiento o el montaje del recipiente.
   15. Opcional Evaluar la integridad de las células endoteliales mediante la aplicación de fenilefrina para inducir la contracción del recipiente a 50% de la respuesta inicial a KCl (según lo registrado por el transductor de fuerza en el software de grabación de datos), seguido de la adición de 1 μM de acetilcolina.
       Nota: una buena preparación de los vasos sanguíneos es crucial para obtener resultados consistentes y precisos. No se debe utilizar una preparación para el experimento, ya sea si la prueba de integridad endotelial no es satisfactoria o no responde a la KCl, lo que indica que la función endotelial o la contractilidad del músculo liso vascular, respectivamente, no son satisfactorias. En este caso, la preparación debe reemplazarse con un nuevo anillo del mismo vaso sanguíneo o un nuevo vaso sanguíneo.

2. normalización para determinar la tensión inicial óptima

Nota: el procedimiento de normalización permite la determinación del diámetro interior óptimo (IC) de las arterias a las que el vaso sanguíneo experimenta una presión transmural de reposo adecuada (100 mmHg o 13,3 kPa para las arterias mesentérica) y produce el máximo activo fuerzas en respuesta a los agentes vasoactivos.

1. Encienda el ordenador y abra el software de grabación de datos (consulte la tabla de materiales).
2. Guarde el experimento como un "archivo de datos LabChart" con un nuevo nombre para evitar sobrescribir el archivo de configuración original.
3. Abra la ventana de configuración de normalización y establezca el factor k como 1. Acepte los valores predeterminados para la calibración del ocular (0,3, si la longitud del recipiente es desconocida, o 1 si se conoce la longitud del recipiente), la presión objetivo (13,3), el tiempo promedio en línea (2) y el tiempo de retardo (60). Haga clic en Aceptar para guardar la configuración.
4. Seleccione los canales de interés e introduzca el diámetro del alambre (40 μm), los puntos finales del tejido (a1:0; a2: longitud del tejido medido), lectura del micrómetro inicial en la ventana de normalización.
5. Inicie el procedimiento de normalización aplicando el primer estiramiento pasivo al vaso sanguíneo (gire el tornillo del micrómetro en sentido antihorario).
6. Espere a que el recipiente se estabilice (3 min) e introduzca la nueva lectura del micrómetro en la ventana de normalización. La tensión de la pared se calcula automáticamente y se muestra como un punto en el gráfico.
   Nota: los "pasos" del micrómetro utilizados durante el estiramiento pasivo no necesitan ser los mismos. Los primeros tramos podrían ser de 20 μm cada uno. A medida que los tramos se acercan a la línea Isobar, los pasos se pueden reducir a 10 μm, 5 μm, 2 μm o incluso más pequeños. Se abre la ventana principal del gráfico mientras se ajustan los ajustes del micrómetro — si aparece un pico grande que excede la línea isobarra en un gráfico de longitud/tensión (que indica los puntos de presión correspondientes a un valor predeterminado), reduzca la tensión.
7. Después de cada tramo pasivo, reemplace el control Krebs con una ISO-osmótica de alto potasio Krebs que contiene 115 mM KCl. Cuando la contracción alcanza una meseta (alrededor de 3 min), registre la fuerza activa (F) restando la fuerza pasiva en cada tramo de la fuerza activada por potasio. Calcule la tensión de la pared, así como los valores de la circunferencia interna (IC).
   1. Mida la tensión activa como la desviación por encima de la línea base. La tensión activa (T) se calcula en base a la ecuación F (mN) = T (mN/mm) x 2 x longitud del recipiente (mm). Los valores de la circunferencia interna (IC) se calculan a partir de los datos del micrómetro (IC = 205,6 μm + 2 x "gap").
8. Elimine la condición de alto potasio reemplazando con Krebs frescos. Repetir el lavado por tres veces durante 5 min.
9. Repita los pasos 2,5 a 2,8 (induciendo estiramientos pasivos seguidos de contracción activa en turnos alternativos) hasta que la tensión activa empiece a disminuir (figura 2).
10. Después de múltiples rondas de tramos alternativos, las curvas de longitud/tensión pasiva dan el valor de IC100, la circunferencia interna del recipiente a una presión transmural de 100 mmHg, como el punto de cruce con la línea isobarra.
    Nota: cada valor de micrómetro durante los tramos pasivos se introduce manualmente en el módulo de normalizaciónde software. El programa graba automáticamente la medida de fuerza correspondiente para generar la curva de longitud/tensión pasiva, que da el valor de IC100 como el punto de cruce con la línea isobarra (figura 2, paneles de la derecha). Cuanto más cerca está el último punto de la línea de Isobar, pero justo por encima de la mejor normalización es sin dañar los recipientes. Un punto demasiado por encima de la línea de Isobar puede dañar físicamente el recipiente montado, causando resultados poco fiables durante el experimento.
11. Cree las curvas de longitud/tensión activas para determinar los valores IC1 y calcule el factor k de normalización como la relación de IC1/IC100, que se utilizará para este tipo de vaso sanguíneo en experimentos de miografía posteriores.
    Nota: las curvas de longitud/tensión activas se crean trazando los valores de IC calculados a partir de los datos del micrómetro en el eje x y las tensiones activas en el eje y. La IC1 es el valor que se encuentra dentro de la región de la meseta pico (rastros rojos en la figura 2, paneles de la derecha). Después de trazar las curvas de longitud/tensión activas y determinar IC1, el factor de normalización k se calcula como la relación de IC1/IC100. Basado en el factor k de normalización, el IC óptimo para la línea de base, denotado como IC1, se mostrará en la curva de longitud/tensión pasiva. El ajuste del micrómetro para este IC aparece debajo de la curva y se debe utilizar para establecer el microposicionador para los experimentos posteriores de la miografía. La tensión inicial (T) es igual a la presión objetivo (PI) x IC/2 π y la fuerza óptima (F) aplicada al recipiente equivale a la longitud del recipiente de T x 2x.
12. Lavar a fondo los Krebs de alto potasio y equilibrar los preparativos de otros 30 a 45 min. restablezca las tensiones basales a "cero" para que solo se registren las respuestas contráctiles activas durante el experimento subsiguiente.

3. las contracciones inducidas por fenilefrina

Nota: los fármacos que se pueden seleccionar para inducir las respuestas vasoconstrictivas incluyen la norepinefrina agonista receptores adrenérgicos inespecífica, la fenilefrina Agonista α-1 selectiva, la hormona peptídica angiotensina II, y la monoamina neurotransmisor 5-hidroxitriptamina. La fenilefrina se utiliza en el presente Protocolo para el examen (tabla de materiales).

1. Preparar y montar anillos arteriales emparejados como se describe en la sección 1,3, uno con PVAT intacto y el otro con PVAT removido, de las secciones adyacentes de cada arteria para el experimento.
2. Después de la normalización (descrita en la sección 2), pre-contratar los segmentos arteriales con alto potasio Krebs buffer añadiendo 115 mM solución de KCl a la cámara que contiene Krebs.
3. Espere a que la contracción a la meseta (3 min), lave el alto potasio y reemplace con el amortiguador de Krebs aireado fresco. Repetir el lavado tres veces durante 5 min.
4. Repita la estimulación y el lavado de la KCl tres veces y registre la respuesta/tensión máxima contráctil a la KCl restando la tensión basal de la tensión debida a la estimulación de la KCl.
5. Después de la última contracción y lavado, rellene la cámara con el tampón Krebs caliente y aireado y permita que la arteria se recupere durante aproximadamente 30 minutos antes de realizar la siguiente tarea.
6. Para cada cámara, añadir cantidades acumulativas de fenilefrina (incrementos de medio logaritmo de 10^-10 a 10^-4 M) para inducir los aumentos dependientes de la concentración en la tensión isométrica de las preparaciones de reposo.
7. Empiece agregando una baja concentración del agonista a la cámara. Después de dejar suficiente tiempo para una contracción estable (3 – 5 min), añadir la siguiente concentración. Repita los pasos con concentraciones crecientes de fenilefrina.
8. Después de agregar la última dosis de agonista (fenilefrina), lavar el fármaco a fondo y rellenar la cámara con el amortiguador Krebs fresco. Trace las respuestas dependientes de la concentración como porcentajes crecientes de las contracciones máximas inducidas por la KCl (figura 3).
9. Opcional Para evaluar la contribución del NO, incubar los preparados con el inhibidor de la NO sintasa, L-NAME (10^-4 M), durante 30 min antes de la adición de fenilefrina. L-NAME mejora las contracciones inducidas por fenilefrina en las preparaciones quiescentes de las arterias mesentérica (figura 4).
   Nota: los inhibidores o antagonistas deben tener tiempo suficiente para lograr el equilibrio, generalmente 30 – 45 min (ser consistente para cualquier conjunto de experimentos).
10. Para realizar una segunda curva de concentración-respuesta secuencialmente, lavar la cámara por completo y repetidamente para eliminar todos los agonistas anteriores, hasta que no se observan más cambios en el tono.
    Nota: la experimentación paralela expone al menos dos anillos obtenidos del mismo vaso sanguíneo al agonista, uno bajo condiciones de control y otro en presencia del inhibidor (s); en cada anillo, la curva de concentración-respuesta se realizará una sola vez. Se prefiere realizar experimentos paralelos, ya que esto proporciona un mejor control para la acción del fármaco y la sensibilidad de los vasos sanguíneos. Los experimentos seriales obtienen una curva de concentración-respuesta a un agonista en un solo anillo; lavarlo, cambiando las condiciones experimentales (p. ej., añadiendo un inhibidor), y luego repitiendo la curva de respuesta de concentración en el mismo anillo. En este caso, se necesitan controles de tiempo para demostrar que las respuestas de los medicamentos no se deben a cambios en el tejido a lo largo del tiempo. Uno nunca puede estar seguro de que el tejido esté exactamente en el mismo estado después de la exposición a un experimento de respuesta a la concentración. Se debe dar tiempo suficiente (al menos 30 – 60 min) para permitir que los segmentos del recipiente vuelvan a su tensión de reposo (basal) aunque en algunos casos, esto puede no ocurrir instantáneamente después de la disociación del agonista de alta afinidad de los receptores. Además, los Krebs de alto potasio se pueden aplicar entre las curvas de concentración-respuesta acumuladas para reducir la desensibilización²⁸. Recuerda que la mayoría de los antagonistas no pueden ser lavados completamente, así que sigue agregándolo para el resto del experimento.

4. relajaciones/contracciones dependientes del endotelio

1. Pre-contratar un segmento arterial recién montado (como se describe en los pasos 3,2 a 3,5). Una vez más, registre la respuesta/tensión máxima contráctil a KCl restando la tensión basal de la tensión debida a la estimulación de la KCl.
2. Opcional Incubar los preparativos con el inhibidor de la NO sintasa, L-NAME (10^-4 M), durante 30 min antes de la adición de U46619.
3. Añadir las concentraciones precalculadas de U46619 a la cámara y permitir una contracción estable y sostenida de los segmentos de la arteria.
   Nota: las respuestas vasodilatadores se inducen en arterias mesentérica pre-contratadas a aproximadamente 80% de las respuestas máximas a 115 mM KCl. se pueden utilizar diferentes agonistas para inducir la contracción mediante la activación de sus receptores específicos. Aquí, los segmentos de los vasos sanguíneos con o sin PVAT son pre-contratados con U46619 (1 – 3 x 10^-8 M; Tabla de materiales), un agonista del receptor de tromboxano A2, para inducir contracciones musculares lisas estables y sostenidas.
4. Añadir concentraciones acumulativas de acetilcolina (10^-10 a 10^-4 M) a la cámara del órgano. Las respuestas vasodilatadores dependientes de la concentración de los segmentos de las arterias se presentan como porcentaje de las respuestas contráctiles inducidas por U46619 (figura 5).
   Nota: para la mayor parte del experimento, la siguiente concentración del agonista relajante debe añadirse inmediatamente cuando se observa una meseta para evitar el rebote en la tensión. Las respuestas vasodilatadores dependientes de la concentración de los segmentos de las arterias se normalizan como porcentaje de las respuestas contráctiles inducidas por U46619 para ajustarse a diferencias menores en la inervación y el diámetro entre los segmentos de la arteria (figura 5). Las pequeñas variabilidades en la capacidad de respuesta entre anillos individuales obtenidos del mismo vaso sanguíneo se vuelven mínimas cuando un grupo de seis o más experimentos se analizan estadísticamente. Al expresar respuestas como un porcentaje de las propias contracciones máximas del tejido individual, es conveniente utilizar un análisis emparejado (p. ej., la prueba t de Student emparejada) para comparar las respuestas del mismo tipo de tejidos de diferentes animales con el fin de comparar respuestas de un solo tejido antes y después de una intervención. Al analizar los efectos de PVAT, se utiliza ANOVA de dos vías seguido de una prueba de comparación múltiple.
5. Después de agregar la dosis final del agonista relajante, retire el fármaco de cada cámara y rellene con el amortiguador Krebs fresco. Lave la cámara a fondo con el tampón de Krebs y deje que la arteria se estabilice durante al menos 45 min antes de realizar cualquier experimento adicional.

Resultados

Examen de las relaciones de longitud/tensión para obtener el factor de normalización k

La cantidad de estiramiento aplicada a un segmento de recipiente influye en la extensión de la interacción actina-miosina y, por tanto, en la fuerza activa máxima desarrollada. Por lo tanto, para cada tipo de vaso sanguíneo, se requiere determinar la cantidad de estiramiento necesaria para la fuerza activa máxi...

Discusión

Aparte de las células endoteliales, las señales derivadas de la PVAT juegan un papel importante en la regulación de la reactividad del tono muscular suave³⁰. La pvat sana libera no y la adiponectina antiinflamatoria para ejercer un efecto anticontráctil en las arterias, que se pierde en condiciones patológicas como la obesidad y el síndrome metabólico^31,32. En los Estados de enfermedad, pvat contribuye al desarrollo de la disfunció...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetylcholine	Sigma-Aldrich	A6625	Stock concentration: 10-1 M Working concentration: 10-10 to 10-5 M
L-NAME (Nω-nitro-L-arginine methyl ester)	Sigma-Aldrich	N5751	Stock concentration: 3 x 10-2 M Working concentration: 10-4 M
Phenylephrine	Sigma-Aldrich	P6126	Stock concentration: 10-2 M Working concentration: 10-10 to 10-5 M
U46619 (9,11-dideoxy-9α,11αmethanoepoxy prostaglandin F2α)	Enzo	BML-PG023-0001	Stock concentration: 10-5 M Working concentration: 1-3 x 10-8 M
Multiwire myograph	Danish MyoTechnology (DMT)	620M
PowerLab 4/26	ADInstruments	ML848
Labchart7	ADInstruments	-
Adipo-SIRT1 wild type mice	Laboratory Animal Unit, The University of Hong Kong	CULATR NO.: 4085-16
Silicon-coated Petri dishes	Danish MyoTechnology (DMT)
Tungsten wires	Danish MyoTechnology (DMT)	300331
Surgical tools