Inmunoetiquetado Desgeneración de miofibra en biopsias musculares

Resumen

Aquí se describe un protocolo para el inmunoetiquetado directo de miofibers necróticas en criosecciones musculares. Las células necróticas son permeables a las proteínas séricas, incluyendo la inmunoglobulina G (IgG). Revelar la aceptación de IgG por miofibers permite la identificación y cuantificación de miofibers que sufren necrosis independientemente de la condición muscular.

Resumen

La necrosis de las fibras musculares (mionecrosis) desempeña un papel central en la patogénesis de varias afecciones musculares, incluyendo distrofias musculares. Se espera que las opciones terapéuticas que abordan las causas de la patogénesis de la distrofia muscular alivien la degeneración muscular. Por lo tanto, se necesita un método para determinar y cuantificar el alcance de la muerte celular en las biopsias musculares. Los métodos convencionales para observar la degeneración de la miofibra in situ son poco cuantitativos o dependen de la inyección de distos vitales. En este artículo, se describe un protocolo de inmunofluorescencia que mancha las miofibers necróticas al atacar la admisa de inmunoglobulina G (IgG) por miofibers. El método de admisión de IgG se basa en características celulares que caracterizan la muerte necrótica, incluyendo 1) la pérdida de integridad de la membrana plasmática con la liberación de patrones moleculares asociados al daño y 2) la adopción de proteínas plasmáticas. En las secciones transversales murinas, el co-inmunoetiquetado de miofibers, proteínas de matriz extracelular e IgG de ratón permite una identificación limpia y directa de las miofibers con el destino necrótico. Este método simple es adecuado para el análisis cuantitativo y aplicable a todas las especies, incluidas las muestras humanas, y no requiere la inyección de tinte vital. La tinción de miofibers necróticas por la suación de IgG también se puede emparejar con otro co-inmunoetiquetado.

Introducción

El músculo esquelético estriado consiste principalmente en fibras musculares (miofibers), que son responsables de la característica función contráctile voluntaria. Estas células son estructuras multinucleadas y postmitoticas que soportan el estrés mecánico que ocurre durante la contracción. La estabilidad estructural de la membrana de la miofiber (sarcolemma) y su matriz extracelular son cruciales para la homeostasis tisular. Las células satélite comprenden la población principal de progenitores musculares en el músculo esquelético maduro y existen en un estado de reposo en músculos sanos. Después de la muerte de la miofibra, la regeneración muscular es apoyada por células satélite después de un programa miogénico que implica activación de células satelitales, proliferación, diferenciación y fusión para, en última instancia, formar nuevas miofibers multinucleadas.

La miofibra la muerte puede ocurrir en múltiples condiciones musculares, incluyendo trauma mecánico, lesiones de isquemia-reperfusión, o distrofias musculares, y se asocia con la morfología necrótica de las células muertas^1,2. La muerte necrótica se caracteriza por la rápida permeabilidad de la membrana plasmática y la liberación del contenido celular en el compartimiento extracelular^3. Puede ser el resultado de un proceso no regulado que no implica señalización celular adecuada (es decir, necrosis accidental), o de una vía intracelular orquestada (es decir, necrosis regulada). En la miofibras, tanto los procesos^{regulados 4} como^{los 5} no regulados pueden conducir a la necrosis. Una consecuencia típica de la mionecrosis es la liberación de patrones de moléculas asociadas al daño, activando una potente respuesta inflamatoria⁶. La presencia de macrófagos se observa alrededor de 48 h y 72 h después de una lesión⁷. Además de su papel en el aclaramiento de escombros necróticos, también son importantes en la regeneración muscular^8,9.

Las distrofias musculares (MID) son un grupo heterogéneo de patologías que a menudo resultan de un defecto en la estructura del sarcolemma. La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad juvenil ligada al X que afecta aproximadamente a 1 de cada 3.500 nacimientos masculinos en todo el mundo^10,y es causada por la ausencia de expresión de distrofina en el sarcolemma. La degeneración crónica del tejido muscular en los niños DMD conduce a la debilidad muscular extrema y la mortalidad temprana. La inflamación resultante de la muerte necrótica mejora la citotoxicidad, y promueve la fibrosis muscular y la pérdida de la función muscular^11,12. Se espera que los tratamientos actualmente en ensayos clínicos dirigidos a las raíces de los trastornos degenerativos musculares, como la terapia génica, alivien la mionecrosis. Por lo tanto, se necesitan técnicas simples para cuantificar con precisión la degeneración muscular.

Varios métodos se utilizan rutinariamente para controlar la pérdida de miofibra in vivo. La medición de la actividad enzimática de la creatina quinasa (CK) en la sangre permite una cuantificación fiable de la necrosis continua en los tejidos musculares y cardíacos. In situ, la tinción de hemexilina y eosina (H&E) es el método más popular que se utiliza actualmente en el diagnóstico para evaluar la remodelación de la degeneración-regeneración. Sin embargo, la base molecular del etiquetado H&E de las células muertas sigue sin estar clara. Además, las modificaciones de color que sugieren la muerte de miofibra en la tinción de H&E son relativamente sutiles y no facilitan la cuantificación fiable y reproducible. Métodos que revelan la fragmentación del ADN, como el etiquetado terminal de desoxinucleorden de la transferencia dUTP (TUNEL), etiqueta imperfectamente la muerte necrótica³. También están mal adaptados para monitorear la muerte de células sincitiales como la miofibras. La inyección de tintes vitales, como el tinte azul (EBD) de Evan, representa una alternativa útil para evaluar las miofibers que han perdido la integridad del sarcolemma, pero no es necesariamente conveniente en algunos protocolos experimentales. Por ejemplo, la presencia de EBD en muestras de sangre puede afectar a los resultados de las mediciones de CK, un ensayo colorimétrico. Además, la ingesta intracelular de EBD dificulta el co-inmunoetiquetado. Por lo tanto, un método alternativo que permite el etiquetado directo de miofibers sometidos a necrosis es de interés.

El mecanismo de acción de los tintes vitales se basa en la pérdida de la integridad de la membrana plasmática en las miofibers necróticas y la aceptación pasiva del tinte inyectado. Del mismo modo, las miofibers necróticas toman proteínas de la sangre como la albúmina, para la que EBD tiene una fuerte afinidad^13,14,inmunoglobulina G (IgG) e IgM^15. Por lo tanto, la presencia anormal de proteínas sanguíneas dentro de las miofibers representa marcadores convenientes para la mionecrosis in situ. La tinción de estas proteínas puede ser una alternativa para el uso de colorantes vitales.

Mediante el uso de la ingesta de IgG como un marcador de mionecrosis in situ, este protocolo se utiliza para evaluar la degeneración muscular en los tibialis anterior (TA) de ratones con deficiencia de distrofina mdx. Este método presenta ventajas significativas sobre las técnicas alternativas: 1) es reproducible y simple en su ejecución; 2) no requiere ningún tratamiento animal antes de la recolección muscular, como la inyección de dedos vitales circulantes, y 3) como cualquier inmunoetiquetado convencional, es compatible con el etiquetado cooperativo.

Protocolo

Los experimentos se realizaron de conformidad con la legislación francesa y comunitaria (número de licencia 11-00010).

1. Preparación de las encías tragacanth

1. En un vaso de precipitados de vidrio, disolver 6 g de polvo de tragacanth en 100 ml de agua desionizada. Cubrir con papel de aluminio y dejar durante al menos 3 h. Revuelva ocasionalmente manualmente con una espátula metálica a medida que la mezcla se vuelve rápidamente viscosa.
2. Dejar la mezcla de tragacanto a 60oC durante la noche en un baño de agua o en el horno. Selle cuidadosamente el vaso de precipitados para evitar el secado. Revuelva al menos una vez antes de alícuota.
3. Aliquot y conservar a 4oC durante un máximo de 2 semanas.

2. Colección muscular

NOTA: Para este experimento, un ratón mdx macho de 4 semanas de edad fue sacrificado por dislocación cervical. Este procedimiento no requiere anestesia y es un método de matanza humano de acuerdo con la legislación local.

1. Disección del músculo tibialis anterior (TA)
   1. Después de afeitar la pierna del ratón, coloca el ratón sobre su espalda y coloca los pies en una tabla de corcho con agujas. Usando tijeras de precisión (o un bisturí) y fórceps, retire la piel de la pierna del pie hasta la rodilla para exponer toda la longitud de la tibia y el TA.
   2. Con tijeras, haga una incisión entre la tibia y la TA. Esto facilitará la separación de la TA del hueso y proporcionará un fácil agarre al epimisio. Usando fórceps de precisión, retire cuidadosamente la capa de epimisio de la superficie de la TA.
      NOTA: A partir de este paso, el TA puede ser más susceptible al secado, lo que debe evitarse.
   3. En la región del tobillo, aísle el tendón TA de otros tendones con fórceps. Tire suavemente hacia arriba del tendón TA para aislarlo de la tibia y los músculos circundantes.
   4. Cuando el vientre TA esté completamente separado, sostenga el tendón hacia arriba de modo que sólo la parte proximal del músculo TA esté unida a la rodilla. Corta suavemente el tendón proximal lo más cerca posible del hueso de la rodilla.
   5. Coloque el TA en una gasa ligeramente humedecida con salina para evitar el secado antes de congelar el músculo.
2. Pre-enfriar 70-100 ml de isopentano en un vaso de precipitados de plástico o politetrafluoroetileno sumergiéndolo parcialmente en nitrógeno líquido. Deje que se enfríe hasta que el isopentane en la parte inferior del vaso de precipitados se convierta en un sólido blanco.
3. Sobre una pieza circular de corcho (20 mm x 11 mm x 8 mm), coloque 0,5 ml de goma tragacanto. Pre-etiquete cuidadosamente el otro lado del corcho para que la biopsia pueda ser identificada correctamente después del paso de congelación.
4. Incruste el TA en la encía con fórceps, tendón distal hacia arriba. Para permitir secciones transversales apropiadas del músculo, sostenga el músculo con su eje perpendicular a la superficie del corcho. La calidad de las criosecciones mejorará si la biopsia no está completamente incrustada en la encía. Deje que al menos la mitad de la TA (lado del tendón) sea descubierta por la encía.
5. Sumerja rápidamente el corcho con el músculo incrustado en la capa de isopentano frío y sin congelar. Tenga en cuenta que el corcho flotará en el líquido isopentano. Sostenga la muestra boca abajo como el músculo necesita ser sumergido en isopentano. Deje las muestras en el isopentane durante unos 2 minutos para permitir la congelación completa.
   NOTA: A partir de esta etapa, el TA debe permanecer congelado hasta la criosección. Almacene el músculo en hielo seco antes de guardarlo a largo plazo en un congelador de -80 oC.

3. Criosección

1. Establezca la temperatura del criostato en -25 oC. Mantenga la temperatura del objeto a unos -20 oC. Fije el objeto en el criostato usando el compuesto de temperatura de corte óptima (OCT). Recorta el músculo hasta que llegues al vientre muscular y luego corta secciones de 7 a 10 m.
   NOTA: La estabilización de la temperatura del objeto requiere al menos 10 minutos.
2. Mantenga los portaobjetos de vidrio utilizados para recoger criosecciones a temperatura ambiente (RT). Recopile al menos dos secciones en cada diapositiva. Las secciones musculares se pegarán y descongelarán automáticamente al contacto del tobogán de vidrio caliente. Retire la diapositiva y manténgala en RT.
3. Deje que las secciones se sequen al menos 20 minutos a RT en un ambiente ventilado.
4. Conservar las criosecciones en portaobjetos de vidrio a -80 oC hasta su uso.

4. Inmunoetiquetado

1. Descongelar los toboganes a RT durante al menos 15 minutos en un ambiente ventilado.
2. Delinear el área de secciones con una pluma hidrófoba. Deje que la barrera hidrófoba se seque.
3. Fijar el tejido con 2% de paraformaldehído durante 10 minutos en una cámara húmeda.
4. Lave las secciones con solución salina tamponada de fosfato (PBS) 2 veces durante 5 min cada una.
5. Bloquear las secciones musculares con 10% de suero de cabra diluido en PBS durante 1 h a RT en una cámara húmeda.
6. Incubar las secciones durante 2 horas a RT (o durante la noche a 4oC) en una cámara húmeda con los anticuerpos primarios diluidos en suero de cabra al 5%. Para un simple etiquetado de admisión de IgG en miofibers, solo incuba las secciones con anticuerpos de conejo a la pan-laminina de ratón.
   NOTA: Otros antígenos de la matriz extracelular pueden ser dirigidos siempre y cuando proporcionen un etiquetado claro de la matriz extracelular circundante de las miofibers. Los marcadores para la regeneración muscular, la inflamación u otros parámetros se pueden combinar siempre y cuando los anticuerpos no se eluden en un huésped del ratón. El microscopio utilizado para el análisis debe incluir un color de fluorescencia suplementario.
7. Lave las secciones con PBS 3x durante 5 min cada una.
8. Incubar las secciones con anticuerpo secundario policlonal de cabra fluorescente rojo para conejo IgG H&L y anticuerpo secundario policlonal de cabra fluorescente verde al ratón IgG H&L. Incubar a RT durante 45 minutos en una cámara húmeda.
9. Lavar con PBS 3x durante 10 min cada uno.
10. Monte las secciones en un medio de montaje fluorescente que contenga 100 ng/mL 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) y cubra cada diapositiva con un cubreobjetos.
11. Dejar secar durante la noche a 4oC antes de tomar imágenes.

Resultados

Las miofibers están rodeadas por una matriz extracelular que contiene laminina. La tinción roja delimita la periferia de miofibras y permite su identificación. IgG se muestra en verde. Los núcleos se tiñen con DAPI y se encuentran en azul bajo el microscopio. Sin embargo, los núcleos se muestran en blanco aquí (Figura 1). Se espera una inmunoreactividad IgG débil en el compartimento extracelular, que puede aumentarse en caso de inflamación. La tinci?...

Discusión

La necrosis de miofibra es una consecuencia común del ejercicio traumático en los músculos normales. Está bien compensado por una poderosa capacidad regenerativa de los progenitores musculares locales. Sin embargo, en varias condiciones musculares como en los D, la capacidad regenerativa de las células satélite se ve comprometida por la mionecrosis crónica y la fibrosis excesiva. Los hallazgos recientes muestran que las fibras musculares pueden morir por necroptosis, una forma regulada de necrosis. Más específic...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Circular cork disks	Pyramid Innovation	R30001-E	Don't forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing
Cryostat	Leica	CM3050 sn34	Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25°C. Thickness:7-10 micrometers.
Dakopen	Dako	S2002	A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation
Forceps	FST	91117-10	/
Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488	ThermoFischer Scientific	A-11029	Dilution: 1/500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594	ThermoFischer Scientific	A32740	Dilution: 1/500
Goat serum	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS
Isopentane	Sigma Aldrich	78-78-4	Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen.
mdx mouse	Jackson Laboratory	C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J	Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration
Microscope	Zeiss	Imager.D1	/
OCT	Cellpath	KMA-0100-00A	Embedding matrix
PFA (Paraformaldehyde)	ThermoFischer Scientific	28908	Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used)
PBS	Eurobio	CS3PBS00-01	Dilution medium for immunolabeling
Precision scisors	FST	fst 14001-12 and fst 14001-14	Used for the muscle collection
Rabbit antibody to mouse pan-Laminin	Sigma Aldrich	L9393	Dilution: 1/1000
Tragacanth	Sigma Aldrich	G1128	Aliquots to keep at +4°C