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Resumen

Caracterizamos una nueva proteína quinasa utilizando enfoques bioquímicos robustos: análisis de Western Blot con un anticuerpo específico específico específico específico en diferentes líneas y tejidos celulares, interacciones por experimentos de coinmunoprecipitación, actividad quinasa detectada por Western Blot usando un anticuerpo fosfo-específico y por el etiquetado ATP de32P.

Resumen

La secuenciación extensa del genoma entero ha identificado muchos marcos de lectura abiertos (ORF) que proporcionan muchas proteínas potenciales. Estas proteínas pueden tener funciones importantes para la célula y pueden desentrañar nuevos procesos celulares. Entre las proteínas, las quinasas son los principales actores, ya que pertenecen a las vías de señalización celular y tienen la capacidad de activar o desactivar muchos procesos cruciales para el destino de la célula, como el crecimiento celular, la división, la diferenciación, la motilidad y la muerte.

En este estudio, nos centramos en una nueva proteína quinasa potencial, LIMK2-1. Demostramos su existencia por Western Blot usando un anticuerpo específico. Evaluamos su interacción con una proteína reguladora aguas arriba utilizando experimentos de coinmunoprecipitación. La coinmunoprecipitación es una técnica muy potente capaz de detectar la interacción entre dos proteínas diana. También se puede utilizar para detectar nuevos socios de una proteína de cebo. La proteína de cebo puede ser purificada ya sea a través de una etiqueta diseñada para su secuencia o a través de un anticuerpo dirigido específicamente a ella. Estos complejos proteicos pueden separarse por SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamidGel Gel) e identificarse mediante espectrometría de masas. El LIMK2-1 inmunoprecipitado también se utilizó para probar su actividad de quinasa in vitro mediante el etiquetado de ATP de32P. Este ensayo bien establecido puede utilizar muchos sustratos diferentes, y las versiones mutadas del cebo se pueden utilizar para evaluar el papel de residuos específicos. Los efectos de los agentes farmacológicos también pueden evaluarse ya que esta técnica es altamente sensible y cuantitativa. No obstante, el manejo de la radiactividad requiere especial precaución. La actividad de la quinasa también puede evaluarse con anticuerpos específicos dirigidos al grupo fosfo del aminoácido modificado. Este tipo de anticuerpos no están disponibles comercialmente para todos los residuos modificados fosfo.

Introducción

Durante muchas décadas, numerosas vías de señalización se han aclarado y su participación en procesos celulares cruciales como la división celular, diferenciación, motilidad, muerte celular programada, inmunidad y neurobiología, se ha demostrado. Las quinasas desempeñan un papel importante en estas vías de señalización, ya que a menudo regulan finamente su activación o inactivación y forman parte de complejos versátiles transitorios que responden a estímulos externos1,2,3. La mutación y la desregulación de las quinasas a menudo conducen a enfermedades en los seres humanos, y por lo tanto se han convertido en uno de los objetivos farmacológicos más importantes en los últimos cuarenta años4.

En este contexto, es importante ser capaz de detectar la interacción de la quinasa con sus reguladores aguas arriba o sustratos aguas abajo e identificar nuevos socios. La purificación de afinidad y la inmunoprecipitaciónson técnicas muy potentes para el aislamiento de complejos proteicos 5. La proteína de cebo o quinasa puede ser etiquetada con una secuencia de péptidos específica que permite el uso de cuentas comerciales covalentemente junto con anticuerpos dirigidos al péptido. Este material permite una alta reproducibilidad en los experimentos6,7,8. Las proteínas endógenas también pueden inmunopreciarse utilizando anticuerpos dirigidos directamente a la proteína de cebo. Los anticuerpos pueden estar reticulados a cuentas de agarosa de proteína A o proteína G o simplemente incubados con estas cuentas antes de añadir lisato. Los amortiguadores de lisis deben optimizarse para permitir la solubilización de proteínas sin perder la interacción y evitar la degradación de las proteínas. Un inconveniente importante de este enfoque es que la interacción se detecta sobre la lisis celular; por lo tanto, pueden perderse las interacciones transitorias o débiles, junto con las que requieren contexto subcelular. Otras técnicas se pueden utilizar para trabajar directamente en la célula, como el ensayo de ligadura de proximidad (PLA)9, in vivo cross-linking-assisted affinity purification (XAP)10, Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) o F-rster Resonance Energy Transferencia (FRET)11,12. Además, la inmunoprecipitación no es adecuada para determinar las constantes termodinámicas de la unión, para las que se requieren técnicas físicas como la Resonancia de Plasmón superficial, la Calorimetría de Valoración Isotérmica o la Termoresis microescala 13,14.

La actividad de la quinasa puede evaluarse utilizando múltiples técnicas. En este documento, nos centramos en los anticuerpos fosfo-específicos y el etiquetado in vitro deATP(Trifosfato de adenosina). Los anticuerpos fosfo-específicos se dirigen a la modificación fosfato de un residuo particular dentro de una proteína. Se pueden utilizar en Western Blot o ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) después de la lisis celular, para la inmunohistoquímica, y también en células intactas utilizando citometría de flujo o inmunofluorescencia. Sus inconvenientes pueden incluir su falta de especificidad, que puede ser evaluada usando una versión mutada de la proteína objetivo, y su no estar disponible comercialmente para todas las proteínas. El etiquetado ATP in vitro á[32P] es un método muy robusto, bien establecido y altamente sensible15. Se pueden utilizar proteínas inmunopreciadas o recombinantes, y se pueden probar diferentes sustratos. Los efectos de los medicamentos también pueden evaluarse ya que este método es cuantitativo. Su principal inconveniente es que la radiactividad asociada con el enfoque requiere manejo con precaución. Los métodos alternativos también son posibles basados en la medición de sustratos de péptidos fluorescentes o luminiscentes y aprovechando las propiedades fluorescentes/luminiscentes alteradas al fosforilación. Estos métodos también permiten un alto rendimiento, que es necesario, por ejemplo, en el cribado de moléculas que pueden ser inhibidores potenciales de la quinasa diana. De hecho, las quinasas representan una de las mayores clases de objetivos farmacológicos perseguidos por las compañías farmacéuticas16.

En este estudio, nos centramos en la proteína LIMK2-1 (LIMK2-1 significa Lin11, Isle1, Mec3 Kinase isoform 2-1). La proteína quinasa LIMK2 fue descrita por primera vez en 199517. Tres isoformas de LIMK2 son producidas por empalme alternativo: LIMK2a, LIMK2b y LIMK2-1. En la actualidad, LIMK2-1 sólo se ha descrito a nivel de ARNm en un solo estudio18. Aquí, caracterizamos esta nueva proteína quinasa potencial a nivel molecular utilizando enfoques bioquímicos robustos. En primer lugar, demostramos que LIMK2-1 está sintetizado. Al igual que sus dos homólogos, LIMK2a y LIMK2b, interactúa con la quinasa rock (proteína quinasa asociada a Rho). Demostramos que LIMK2-1 tiene una actividad quinasa en Myelin Basic Protein (MBP), pero no en la cofilina, el sustrato canónico de las quinasas LIM.

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Protocolo

1. Preparación celular para la transfección

ADVERTENCIA: Todos los pasos del cultivo celular deben realizarse en un laboratorio dedicado, y las células se manipulan dentro de un gabinete microbiológico de clase 2.

  1. Células de semilla HEK-293 (riñón embrionario humano) en placas de 10 cm en 10 ml de DMEM (medio de águilas modificadas de Dulbecco) suplementadas con 10% de suero fetal. Cultivo durante 3 a 5días por debajo del 5% co2, a 37 oC, hasta que las células alcancen una confluencia del 90 %.
  2. Tratar placas de 10 cm con colágeno R para aumentar la adhesión celular a las placas de plástico.
    1. Añadir 5 ml de una solución de colágeno R, 200 veces diluido en tampón de fosfato salino (PBS) en una placa de 10 cm. Superponga el líquido sobre toda la superficie de la placa.
    2. Incubar a temperatura ambiente durante al menos 1 h dentro del armario de bioseguridad.
    3. Retire la solución de colágeno y deséchela. Añadir 5 ml de PBS, extenderlo por toda la superficie de la placa, retirarlo y desecharlo. Repita este lavado una vez.
    4. Añadir 8 ml de DMEM suplementado con 10% de suero de ternera fetal. Mantenga las placas preparadas dentro del gabinete de bioseguridad.
  3. Lleve las placas HEK-293 del paso 1.1 dentro del gabinete de bioseguridad. Retire el medio de las placas y deséchelo en una basura de lejía dedicada. Añadir 2 ml de DMEM suplementado, y lavar las células para separarlas utilizando el flujo de un micropipeta de 1 ml, teniendo cuidado de evitar hacer espuma.
  4. Recoger las células en un tubo de 15 ml y añadir 4 ml de DMEM suplementado. Homogeneizar con una pipeta de 10 ml, pipeteando hacia arriba y hacia abajo 3 veces.
  5. Tome 2 ml de esta solución celular y agréguelas a las placas tratadas con colágeno que contengan DMEM suplementado del paso 1.2.4.
  6. Crecer durante 24 horas en la incubadora a 5% co2 y 37 oC. Las células deben ser 50-80% confluentes en el momento de la transfección.

2. Transfecciones transitorias

  1. Retire el medio de las placas, deséchelo en una basura de lejía dedicada y agregue 10 ml de DMEM fresco complementado. Vuelva a colocar las placas en la incubadora a 37oC mientras prepara la mezcla de transfección.
  2. En un tubo de 15 ml, añadir 450 ml de una solución de 10 mM Tris-HCl pH 7,5/1 mM EDTA (Tris significa Tris(hidroximetil)aminometano y EDTA para ácido etilenodinitrilotetraacético) y 50 ml de una solución de 2,5 M CaCl 2. Mezclar por inversión.
  3. Añadir 10 g de ADN plasmipsódico (ácido desoxirribonucleico) preparado a partir de una preparación midi sobre un cultivo líquido de bacterias transformadas con el plásmido dedicado. Mezclar por inversión.
  4. Bajo agitación suave en un vórtice, añadir 500 l de concentrado de solución salina 2x tamponada BES (composición: BES, 10,7 g/L, NaCl, 16,0 g/L, Na2HPO4, 0,27 g/L; BES significa N,N-Bis(2-hidroxietilo)-2-ácido aminoetanosulfónico, N,N-Bis(2-hidroxietilo)taurino) lentamente gota a gota.
  5. Incubar durante al menos 15 min (hasta 45 min) a temperatura ambiente dentro del armario de bioseguridad. No vórtice, no mezclar! Mueva los tubos con mucho cuidado para no perturbar la compleja formación entre el ADN y el fosfato cálcico.
  6. Lleve las placas del paso 2.1 al armario de seguridad. Añadir los complejos de ADN con mucho cuidado, gota a gota, en las células por toda la superficie de la placa.
  7. Incubar durante 24 a 72 horas en la incubadora a 37oC. Por lo general, la expresión máxima de proteínase alcanza en un plazo de 48 horas.

3. Lisis

NOTA: Trabaje sobre hielo y con tampón frío para evitar la degradación de las proteínas.

  1. Preparar tampón de lisis: 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 50 mM NaF, 10 mM de pirofosfato sódico, 1 mM Na3VO4, 20 mM de fosfato de p-nitrofenil, 20 mM de glucerofosfato, 10 g/ml de aprotinin, 0,05 g/mdicáácido ometa, ácido aprotina de 0,05 g/mdic, 0,05 g/módico, ácido okail de 0,05 g/mdic, 0,05 g/módico, 0,05 g/módico de ometafosfato, 0,05 g/mdicáto, 0,05 g/m. , 1 g/ml de leupeptina y 1 mM de PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonil). Se requieren alrededor de 4 ml de tampón de lisis para cada placa transinfectada.
  2. Retire las placas con células transinfectadas de la incubadora. Ponlos en hielo.
    NOTA: A partir de este paso, es posible trabajar en un banco "normal".
  3. Retire el medio y deséchelo en una basura de lejía dedicada.
  4. Lavar dos veces con 3 ml de PBS frío: añadir 3 ml de PBS en el lado de la placa gota a gota para evitar separar las células transinfectadas, se extendió por toda la superficie de la placa, eliminar PBS y desecharlo; repetir este paso una vez más. Al final, retire cuidadosamente el resto de PBS inclinando la placa para evitar la dilución tampón de lisis para el siguiente paso.
  5. Añadir 500 ml de tampón de lisis fría en las células lavadas transinfectadas. Esparcirlo por toda la superficie de la placa.
  6. Incubar durante 10 minutos sobre hielo. De vez en cuando (al menos dos veces), extienda de nuevo el tampón por toda la superficie de la placa.
  7. Desguace las células y recógelas en un tubo de microcentrífuga.
  8. Centrífuga durante 10 min a 10.000 x g a 4oC.
  9. Recoger sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga. Esta fracción corresponde al lisado (extracto de celda entera). Deseche el pellet que corresponde a los desechos de membrana celular.
  10. Recoger una alícuota de esta fracción a un nuevo tubo de microcentrífuga (alrededor de 50 l). Esta fracción corresponde a la "fracción TOTAL" o "Lisato celular" o "Extracto de célula sin gas" que permite el análisis de si las proteínas transinfectadas son expresadas por Western Blot.
    NOTA: En este punto, las muestras se pueden utilizar directamente para los análisis de Western Blot. El tampón de Laemmli debe añadirse a la muestra, que luego se calienta a 95 oC durante 5 min, se centrifuga a 10.000 x g durante 5 min y se carga en SDS-PAGE adecuado. Las muestras también pueden almacenarse a -80 oC.

4. Inmunoprecipitación

  1. Resuspenda suavemente las perlas de agarosa junto con el anticuerpo apropiado: HA (Human influenza hemagglutinin), Flag o GFP (Green Fluorescent Protein) mediante una inversión suave.
  2. Corte el extremo de una punta de 200 ml de un micropipeta para permitir que las cuentas entren en la punta. Pipetear las perlas hacia arriba y hacia abajo varias veces para saturar la punta para asegurarse de tomar el volumen correcto de cuentas.
  3. Tomar 40 s de perlas en un tubo de microcentrífuga.
  4. Añadir 500 l de TENET (30 mM Tris-HCl pH 7.5, 120 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100) tampón. Mezclar por inversión. Centrífuga durante 2 min a 1.000 x g a 4oC. Retire cuidadosamente el sobrenadante y deséchelo. Añadir 500 l de TENET. Incubar durante al menos 1 hora a 4oC en una rueda giratoria.
    NOTA: Este paso de preincubación en TENET permite reducir las interacciones no específicas y así disminuir la señal de fondo.
  5. Lave las perlas dos veces con 500 ml de tampón de lisis.
    1. Centrífuga 2 min a 1.000 x g a 4oC.
    2. Retire el tampón de sobrenadante cuidadosamente y deséchelo.
      NOTA: Tenga cuidado de no aspirar perlas durante estos pasos de lavado.
    3. Añadir 500 l de tampón de lisis. Homogeneizar invirtiendo el tubo.
    4. Repita los pasos 4.5.1- 4.5.3.
  6. Centrífuga durante 2 min a 1.000 x g a 4oC. Retire con cuidado el tampón de sobrenadante y deséchelo.
  7. Incubar perlas con el lisado del paso 3.9 durante 2 a 4 horas a 4oC en una rueda giratoria.
  8. Lave las cuentas inmunopreciadas.
    NOTA: En este punto, las cuentas inmunoprecipitadas pueden lavarse cinco veces con el tampón de lisis, y luego eluyentes con el tampón de Laemmli. El eluido puede utilizarse para análisis de Western Blot o almacenarse a -80 oC. Alternativamente, las perlas se pueden lavar dos veces con el búfer de lisis y luego tres veces con el búfer de quinasa para realizar el etiquetado de ATP de32P.

5. Análisis de inmunoprecipitación

  1. Lave las cuentas inmunopreciadas del paso 4.7 con el tampón de lisis.
    1. Centrífuga durante 2 min a 1.000 x g en una centrífuga refrigerada a 4oC.
    2. Retire con cuidado el sobrenadante y deséchelo.
    3. Añadir 500 l de tampón de lisis. Homogeneizar invirtiendo el tubo.
    4. Repita los pasos 5.1.1-5.1.3 cuatro veces.
  2. Elución
    1. Centrífuga durante 2 min a 1.000 x g en una centrífuga refrigerada a 4oC.
    2. Retire con cuidado el sobrenadante y deséchelo. Retire las últimas gotas de sobrenadante con una jeringa de Hamilton para evitar la aspiración de las cuentas y deseche el sobrenadante.
    3. Añadir 40 l de tampón de 4x Laemmli (200 mM Tris/HCl pH 6.8, 4% SDS, 40% glicerol, 0.5 M -mercaptoetanol, 0.02% azul bromofenol). Homogeneizar tocando suavemente el tubo.
    4. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
    5. Centrífuga durante 5 min a 10.000 x g a temperatura ambiente.
    6. Con una jeringa Hamilton, retire el sobrenadante y recójalo en un nuevo tubo de microcentrífuga. Esta fracción corresponde al "Eluato", que puede ser almacenado a -80 oC, o analizado directamente por Western Blot.

6. Ensayo Kinase

  1. Preparar el tampón de quinasa: 50 mM HEPES-NaOH pH 7.5 (HEPES significa 4-(2-hidroxietilo)-1-piperazineethanesácido ácido sulfónico), 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM MnCl2, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 20 mM -glicerofosfato, 1 g/mL leupeptina, y 1 mM PMSF. Se requieren alrededor de 2 ml del tampón de quinasa para cada condición de inmunoprecipitación.
  2. Lave las cuentas inmunopreciadas del paso 4.7 dos veces con 500 ml de tampón de lisis.
    1. Centrífuga durante 2 min a 1.000 x g en una centrífuga refrigerada a 4oC.
    2. Retire con cuidado el sobrenadante y deséchelo. Añadir 500 l de tampón de lisis. Homogeneizar por inversión.
    3. Repita los pasos 6.2.1 y 6.2.2.
  3. Lave las cuentas inmunopreciadas tres veces con 500 ml de tampón de quinasa.
    1. Centrífuga durante 2 min a 1.000 x g en una centrífuga refrigerada a 4oC.
    2. Retire con cuidado el sobrenadante y deséchelo. Añadir 500 l de tampón de quinasa. Homogeneizar por inversión.
    3. Repita los pasos 6.3.1 y 6.3.2 dos veces.
  4. Centrífuga durante 2 min a 1.000 x g en una centrífuga refrigerada a 4oC.
  5. Retire con cuidado el sobrenadante y deséchelo. Retire las últimas gotas de sobrenadante con una jeringa de Hamilton para evitar la aspiración de las cuentas y deseche el sobrenadante.
  6. Añadir 40 l de tampón de quinasa a las cuentas inmunopreciadas. Resuspenda las perlas tocando suavemente el tubo.
  7. Preparar la mezcla parael etiquetado de ATP de 32 P ( el volumen final es de 22,5 l, completo con tampón de quinasa) en un tubo de bloqueo seguro.
    1. Agregue el volumen requerido de tampón de quinasa para alcanzar un volumen final de 22,5 l.
    2. Corte el extremo de una punta de 20 ml de un micropipeta. Resuspenda las cuentas inmunopreciadas del paso 6.6 pipeteando varias veces. Recoger 10 l de estas perlas en el tubo de bloqueo seguro.
    3. Añadir ATP a partir de una solución de stock de 10 M para alcanzar los 50 mM de concentración final. De acuerdo con el número de muestras tratadas, se sugiere una dilución de la solución de stock de ATP en el tampón de quinasa para permitir pipetear de 1 a 2 l, para asegurarse de que el volumen es correcto.
    4. Añadir 2,5 g de sustrato (cofilina o proteína básica de mielina, MBP en el presente caso de estudio).
  8. Agregue 5 ci de32 P] ATP (3.000 Ci/mmol) para iniciar la reacción. Mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo lentamente.
    ADVERTENCIA: A partir de este punto, el trabajo debe realizarse en un lugar de seguridad dedicado a las manipulaciones de radiactividad con precaución, protecciones específicas y controles adecuados (escudos radioactivos, contador Geiger, recogida de residuos específicos, senos personales y insignias de los dedos para detectar la exposición radiactiva, puntas de filtro).
  9. Incubar durante 20 min a 30oC.
  10. Detenga la reacción con 6 l de búfer de 5x Laemmli.
  11. Calentar a 95oC durante 5 min.
  12. Centrífuga a 10.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
  13. Cargar en un SDS-PAGE. Continúe con la migración.
    NOTA: Tenga cuidado de que la primera línea de ATP libre de32P no salga del gel para evitar la contaminación del tanque de migración.
  14. Mancha el gel a temperatura ambiente.
    1. Retire el gel de las placas de vidrio.
    2. Proceda con tres baños en agua a temperatura ambiente.
    3. Mancha el gel durante la noche con Coomassie Blue a temperatura ambiente.
    4. Destain el gel con varios baños de lavado con agua a temperatura ambiente.
  15. Envuelva el gel con una envoltura de plástico.
  16. Exponer durante una noche o más en una pantalla de fosforimager.
  17. Lea la pantalla en un fosforimager para detectar bandas etiquetadas.

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Resultados

La proteína LIMK2-1 se sintetiza
LIMK2-1 se menciona en los bancos de datos, pero hasta ahora sólo un documento ha demostrado la existencia de su ARNm18. En comparación con sus dos homólogos, LIMK2a y LIMK2b, LIMK2-1 tiene un dominio C-terminal adicional identificado como un dominio inhibidor de la fosfatasa 1 de la proteína (PP1i). Diseñamos un anticuerpo que apunta a un péptido de este dominio, los aminoácidos 671-684 (Figura

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Discusión

En este documento, hemos utilizado herramientas bioquímicas robustas para caracterizar a nivel molecular una nueva proteína, LIMK2-1, que se cree que es una quinasa basada en su secuencia y en sus homólogos, LIMK2a y LIMK2b20.

En primer lugar, demostramos la existencia de LIMK2-1 a nivel proteico utilizando el análisis de Western Blot con un anticuerpo específico. Después de esto, evaluamos su interacción con la quinasa ascendente ROCK1, que se sabe que regula LI...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por La Ligue contre le Cancer, l'Association Neurofibromatoses et Recklinghausen, y la Région Centre Val de Loire. Muchas gracias a Aurélie Cosson y Déborah Casas por los datos de citometría de flujo, y a Keyron Hickman-Lewis por la revisión exhaustiva del manuscrito.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibody anti-actinSigma-AldrichA1978for Western Blot
Antibody anti-c-MycInvitrogenMA1-21316for Western Blot
Antibody anti-cofilinCell signaling Technology3312/5175for Western Blot
Antibody anti-GFPSanta Cruzsc-9996for Western Blot
Antibody anti-HARoche Applied Science11687423001for Western Blot
Antibody anti-phospho-cofilinCell signaling Technology3313for Western Blot
Antibody Anti-PP1iEurogentecdesigned for this studyfor Western Blot
AprotininEuromedexA-162Bfor lysis buffer
ATPInvitrogenPV3227for γ[32P] labeling
γ[32P] ATPPerkin ElmerNEG502Afor γ[32P] labeling
BES buffered salineSigma-Aldrich14280for transfection
β-glycerophosphateSigma-AldrichG9422for lysis and kinase buffer
β-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148for Laemmli
BSASigma-AldrichA3059for blocking buffer
Bromophenol BlueSigma-AldrichB0126for Laemmli
CaCl2Sigma-AldrichC3881for transfection
CentrifugeSigma111-541
Collagen RPan BiotechP06-20166for transfection
Control siRNAAmbionAM4611for PP1i antibody specificity
Coomassie PageBlue Protein Staining SolutionThermo-Fisher24620for gel staining
EDTASigma-Aldrich3690for lysis buffer
Electrophoresis UnitBioradMini-Proteanfor Western Blot
EZview Red anti-HA affinity gelSigma-AldrichE6779for immunoprecipitation
GeneSys softwareOzymefor Western Blot acquisition
GeneTolls softwareOzymefor Western Blot quantification
GFP-trap beadsChromtekfor immunoprecipitation
GlycineEuromedex26-128-6405for transfer buffer
GST-cofilinUpstate Cell signaling12-556for γ[32P] labeling
Hamilton syringe 100 mLHamilton710to remove carefully supernatant from beads without aspirating them
HEPESSigma-AldrichH3375for kinase buffer
ImageQuant TL softwareGE Healthcarefor radioactivity acquisition and quantification
LIMK2 siRNAAmbions8191for PP1i antibody specificity
LeupeptinSigma-AldrichSP-04-2217for lysis and kinase buffer
MBPUpstate Cell signaling13-173for γ[32P] labeling
MgCl2Sigma-AldrichM8266for kinase buffer
MnCl2Sigma-Aldrich244589for kinase buffer
NaClEuromedex1112for lysis and kinase buffer
NaFSigma-AldrichS-1504for lysis and kinase buffer
Okaidic acidEuromedex0-2220for lysis buffer
PMSFSigma-Aldrich78830for lysis and kinase buffer
p-nitrophenylphosphateEuromedex1026for lysis buffer
PVDF membrane Immobillon-PMerck-MilliporeIPVH00010 pore size 0,45 mmfor Western Blot
Rotating wheelLabincofor bead incubation
Safe lock eppendorfEppendorf0030120.086for kinase assay
SDSSigma-Aldrich5030for Laemmli and migration buffer
Sodium orthovanadateLC LaboratoriesS8507for lysis and kinase buffer
Sodium pyrophosphateFluka71501for lysis buffer
Super Signal West DuraProtein Biology34075for Western Blot
Syngene PxiOzymefor Western Blot
Tissue extracts

 		Biochain

 		P1234035 Brain
P12345152 Lung
P1234149 Liver
P1234188 Pancreas
P1234260 Testis		for Western Blot analysis

 
Transfer UnitBioradMini-Trans-Blotfor Western Blot
TrisEuromedex26-128-3094 Bfor lysis buffer
Tween-20Sigma-AldrichP7949for blocking buffer
Typhoon FLA9500GE Healthcareto read autoradiography
Typhoon TrioAmersham Bioscienceto read autoradiography
Whatman paperGE Healthcare3030-672for Western Blot

Referencias

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