Síntesis de un estándar deuterated para la cuantificación de 2-Arachidonoylglycerol en Caenorhabditis elegans

Resumen

Este trabajo describe un método robusto y sencillo para detectar y cuantificar el endocannabinoide 2-arachidonoylglycerol (2-AG) en C. elegans. Un estándar analítico deuterado nos preparó y utilizó para la cuantificación de 2-AG por dilución isotópica y cromatografía líquida-electrospray ionización-espectrometría de masas tándem (LC-ESI-MS/MS).

Resumen

Este trabajo presenta un método para preparar un estándar analítico para analizar 2-arachidonoyl glicerol (2-AG) cualitativa y cuantitativamente mediante cromatografía líquida-electrospray ionización-espectrometría de masas tándem (LC-ESI-MS/MS). Los endocannabinoides son mediadores de lípidos conservados que regulan múltiples procesos biológicos en una variedad de organismos. En C. elegans,2-AG se ha encontrado que poseen diferentes funciones, incluyendo la modulación de la formación de dauer y el metabolismo del colesterol. Este informe describe un método para superar las dificultades asociadas con los costos y la estabilidad de las normas deuteradas necesarias para la cuantificación de 2 AG. El procedimiento para la síntesis de la norma es simple y se puede realizar en cualquier laboratorio, sin necesidad de experiencia en síntesis orgánica o equipo especial. Además, se describe una modificación del método de Folch para extraer el estándar deuterated de la cultura C. elegans. Por último, se describe un método cuantitativo y analítico para detectar 2-AG utilizando el análogo 1-AG-d₅ etiquetado isotópicamente estable, que proporciona resultados fiables en una ejecución cromatográfica rápida. El procedimiento es útil para estudiar las múltiples funciones de 2-AG en C. elegans mientras que también es aplicable a otros estudios de metabolitos en diferentes organismos.

Introducción

Los endocannabinoides regulan múltiples procesos biológicos en una variedad de organismos y se conservan mediadores de lípidos¹. Los primeros endocannabinoides descubiertos y más bien caracterizados son anandamida (arachidonoylethanolamida, AEA) y 2-arachidonoyl glicerol (2-AG). Los endocannabinoides juegan muchos papeles críticos, incluyendo los involucrados en los sistemas de recompensa cerebral, así como la adicción a las drogas, memoria, estado de ánimo, y procesos metabólicos². AEA y 2-AG sólo se sintetizan cuando es necesario y tienen una vida útil corta, y se degradan a través de la retoma de proteínas de transporte y la hidrólisis^3.

El uso de modelos animales como Caenorhabditis elegans (C. elegans) se ha convertido en importante para estudiar la gran variedad de procesos biológicos incluyendo apoptosis, señalización celular, ciclo celular, polaridad celular, regulación genética, metabolismo, envejecimiento, y determinación del sexo^4,5. Además, C. elegans es un excelente modelo para estudiar las funciones fisiológicas de los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA). AEA se ha identificado en C. elegans y se reduce bajo restricción dietética⁶. Esta deficiencia extiende la vida útil del nematodo a través de un mecanismo de restricción dietética que puede ser suprimido por la suplementación con el endocannabinoide. Recientemente, se descubrió que 2-AG y AEA desempeñan un papel fundamental en la regulación del tráfico de colesterol en C. elegans⁷. Más importante aún, se determinó que la suplementación con 2-AG exógeno puede rescatar el arresto de Dauer, que es causado por el deterioro del tráfico de colesterol en Niemann-Pick tipo C1 C. elegans mutantes.

Para comprender mejor la relación de 2-AG con el tráfico de colesterol y otros procesos biológicos en el nematodo (es decir, señalización monoaminérgica, nocicepción y locomoción), es crucial estudiar este metabolito endógeno y cómo es afectados en determinadas condiciones ambientales y dietéticas^{8,9,10,11,12,13}. Por lo tanto, es imperativo diseñar y optimizar un método para detectar y cuantificar las 2-AG endógenas en C. elegans que sea fácil de usar para científicos de diferentes campos, especialmente aquellos que estudian el comportamiento del nematodo en relación con esto Endocannabinoide.

En 2008, Lethonen y sus compañeros de trabajo lograron identificar 2-AG y AEA en C. elegans utilizando los métodos analíticos de LC-MS¹⁴. En 2011, lograron expandir esta técnica a otros endocannabinoides^15. Trabajos más recientes han mostrado otros métodos analíticos que han tenido éxito en la detección y cuantificación de endocannabinoides en C. elegans,incluyendo espectrometría de masas y GC-MS^16,17,18, y ha también se ha informado de que métodos analíticos similares pueden ampliarse a otros modelos¹⁹.

Los métodos analíticos previamente notificados utilizados para cuantificar 2-AG en muestras biológicas suelen implicar el uso de normas deuterated que se adquieren comercialmente y requieren disponibilidad para la compra^20,21. Muchos estándares analíticos para la cuantificación LC-MS/MS de endocannabinoides están disponibles comercialmente de diferentes proveedores. Sin embargo, son caros, son sensibles y se oxidan con el tiempo, debido a la presencia de múltiples enlaces dobles. Las versiones más comunes de estas normas se basan en el ácido araquidónico octa-deuterated y son adecuadas para la cuantificación mediante dilución isótopo LC-MS/MS^14,22. Además, la mayoría de estas normas se sustituyen en la posición 2 del glicerol, haciéndolos inestables en la mayoría de las condiciones, ya que son propensos a la migración de acilo^19,23.

Para superar las dificultades asociadas con los costos y la estabilidad de estas normas deuteradas, se presenta un método conveniente y sencillo para preparar un estándar analítico basado en glicerol-d₅. La secuencia para preparar la norma penta-deuterated requiere un procedimiento de tres pasos que da como resultado el estándar 1-AG-d₅, que es estable y no se somete a migración de acil (el problema principal cuando se pretende sintetizar 2-monoacilglycerols).

El objetivo principal aquí es mostrar un método simple y reproducible para estudiar 2-AG en C. elegans, incluyendo la síntesis del estándar deuterated analítico, la preparación y extracción de las muestras de nematodos, y el análisis por LC-MS/MS (Figura 1 ). Este procedimiento sintético es alcanzable sin el sofisticado conocimiento de síntesis orgánica o equipo especial, por lo que es adecuado para científicos de diferentes campos que están estudiando el comportamiento de C. elegans bajo influencia endocannabinoide. El método también se puede expandir a otros modelos de estudio, por lo que es útil para diferentes objetivos. La norma, preparada como se ha informado aquí, se ha aplicado para desarrollar con éxito un método cromatográfico rápido y fiable que permita la detección y cuantificación efectivas de 2-AG de manera reproducible.

Protocolo

1. Preparación 1-AG-d₅

NOTA: Para obtener 1-AG-d₅ como estándar interno deuterated para ensayos de cuantificación, siga el protocolo como se detalla a continuación.

1. Protección diferencial
   1. Para proteger únicamente los alcoholes primarios, primero agregue 38 mg de glicerol-d₈ a un tubo de reacción de 10 ml utilizando una pipeta Pasteur y agregue un agitador magnético.
   2. Añadir 5 ml de diclorometano anhidro (DCM) utilizando una jeringa Hamilton de 5 ml, y llenar el tubo con N₂ seco para producir una atmósfera inerte.
   3. Preparar un baño con un matraz Dewar poco profundo lleno de acetato de etilo destilado.
   4. Coloque el tubo de reacción herméticamente cerrado dentro del baño y enfríe lo agregando lentamente el líquido N₂ al acetato de etilo hasta que el disolvente se congele.
      ADVERTENCIA: El líquido hierve violentamente a temperatura ambiente (RT) y puede causar quemaduras graves al contactar con los ojos y la piel.
   5. Añadir 54 mg de colidina anhidra utilizando una jeringa Hamilton.
      ADVERTENCIA: Collidine es volátil y tiene un aroma muy fuerte y desagradable.
   6. Añadir 70 mg de cloruro de tert-butildimethylsilyl y remover toda la solución durante 3 h a -78 oC en un agitador magnético.
   7. Después de 3 h, deje que la reacción se caliente en RT y siga revolviendo durante 12 h adicionales.
   8. Añadir 2 ml de salmuera para saciar la reacción.
   9. Extraer la solución 3x con 2 ml de diclorometano destilado utilizando un embudo separador, ahorrando el extracto orgánico cada vez.
   10. Combine los tres extractos orgánicos y séquelos sobre sulfato de sodio.
   11. Evaporar el diclorometano bajo presión reducida en un evaporador rotativo al vacío con cuidado para evitar proyecciones de disolvente.
   12. Purificar la mezcla bruta por cromatografía de columna utilizando gel de sílice como fase estacionaria y un 10% más de hexano/acetato de etilo, comenzando a partir de 100% hexano y terminando con 100% acetato de etilo.
   13. Combine las fracciones que contienen el producto y retire el disolvente bajo presión reducida en un evaporador rotativo al vacío para obtener el glicerol-d₅ puro de 1-O,3-O-bis-(TBDMS) como líquido incoloro.
2. Esterificación
   1. Añadir 10 mg de la 1-O,3-O-bis(TBDMS)-glicerol-d₅ (previamente sintetizado) a un tubo de reacción de 10 ml utilizando una pipeta Pasteur y añadir un agitador magnético.
   2. Agregue 2 ml de diclorometano anhidro con una jeringa Hamilton de 5 ml y llene el tubo con N₂ seco para producir una atmósfera inerte.
   3. Enfríe la solución a 0 oC con un baño de hielo.
   4. Añadir 36 mg de ácido araquidónico utilizando una micropipeta ajustable de varios volúmenes y remover.
   5. Añadir 15 mg de 4-dimetilaminopiridina y remover.
   6. Añadir 15 mg de N,N'-diisopropylcarbodiimide utilizando un micropipeta ajustable de varios volúmenes y remover.
   7. Dejar que la mezcla reaccione a 0oC durante 3 h.
   8. Después de 3 h, deje que la reacción se caliente en RT y siga revolviendo durante 12 h adicionales.
   9. Añadir 2 ml de agua para saciar la reacción.
   10. Extraiga la solución orgánica 3x con 2 ml de diclorometano destilado (DCM) utilizando un embudo separador.
   11. Coloque los tres extractos orgánicos en el mismo tubo y séquelos sobre sulfato de sodio.
   12. Evaporar el diclorometano bajo presión reducida en un evaporador rotativo al vacío con cuidado para evitar proyecciones de disolvente.
   13. Purificar la mezcla bruta por cromatografía de columna utilizando gel de sílice como fase estacionaria y un 10% más de hexano / acetato de etilo, comenzando a partir de 100% hexano y terminando con 50% de hexano/50% acetato de etilo.
   14. Combine las fracciones que contienen el producto y retire el disolvente bajo presión reducida en un evaporador rotativo al vacío para obtener el 1-O, 3-O-bis(TBDMS)-2-AG-d₅ puro puro.
3. Desprotección
   1. Añadir 15 mg de la 1-O,3-O-bis(TBDMS)-2-AG-d₅ (previamente sintetizado) a un tubo de reacción de 10 ml utilizando una pipeta Pasteur y añadir un agitador magnético.
   2. Agregue 2 ml de THF anhidro con una jeringa Hamilton de 5 ml y llene el tubo con N₂ seco para producir una atmósfera inerte.
   3. Enfríe la solución a 0 oC con un baño de hielo.
   4. Añadir 150 l con gota de 1 M de solución de fluoruro de tetrabutilammonio en THF utilizando una jeringa de Hamilton.
   5. Dejar que la reacción sea caliente a RT y revuelva durante 1 h.
   6. Después de 1 h, añadir 2 ml de agua para saciar la reacción.
   7. Extraiga la solución 3x con 2 ml de diclorometano destilado utilizando un embudo separador.
   8. Combine los tres extractos orgánicos y séquelos sobre sulfato de sodio.
   9. Evaporar el diclorometano bajo presión reducida en un evaporador rotativo al vacío para obtener el 1-AG-d₅ puro como un líquido amarillento.
4. Supervise todas las reacciones mediante cromatografía de capa fina realizada en gel de sílice 60 F₂₅₄ hojas de aluminio pre-revestidas. Visualice las bandas bajo una lámpara UV de 254 nm después de manchar con una solución etanólica de 4-anisaldehído.

2. Preparación de stock estándar y soluciones de medición

1. Disolver 1 mg de la norma interna 1-AG-d₅ en 1 ml de ACN y sonicar durante 1 min para obtener la solución estándar de 1.000 ppm.
2. Para preparar la solución de 1.000 ppb utilizada para la cuantificación en gusanos, primero prepare una solución de 10 ppm: tome 10 ml de la solución en stock utilizando una jeringa de Hamilton y diluya a un volumen final de 1 ml añadiendo 990 ml de ACN.
3. Tomar 100 ml de la solución producida en el paso 2.2 utilizando una jeringa de Hamilton, y diluirla a un volumen final de 1 ml añadiendo 900 ml de ACN para obtener la solución de 1.000 ppb utilizada para la cuantificación.
4. Sonicar durante 1 min entre cada paso para asegurar la solubilización completa. Almacene las soluciones a -78 oC para mantener las concentraciones y la integridad de las normas. Después de utilizar la solución estándar, fluya un poco de nitrógeno antes de cerrar el vial para evitar la oxidación.

3. Crecimiento y mantenimiento de C. elegans

NOTA: Siembre las placas de agar de medio de crecimiento de nematodos (NGM) con E. coli OP50 y propague los gusanos en estas placas.

1. Mezclar 3 g de NaCl con 17 g de agar.
2. Añadir 2,5 g de peptona, luego añadir 975 mL de H₂O.
3. Autoclave durante 50 min, luego enfríe el matraz a 55 oC.
4. Mezclar lo siguiente: 1 mL de 1 M CaCl₂, 1 mL de 1 M MgSO₄, 25 mL de 1 M KH₂PO₄ tampón (todos los cuales han sido previamente autoclavedos), y 1 mL de colesterol 5 mg/ml en etanol.
5. Mientras mantiene un ambiente estéril, dispensar la solución NGM en placas Petri de 60 mm, llenando las placas a dos tercios de su volumen. Conservar las placas a 4oC.
6. Raya el cultivo bacteriano de E. coli de una culata de glicerol de -80 oC en la placa de agar LB. Dejar crecer en el plato durante la noche a 37oC.
7. Recoger una sola colonia para inocular 100 ml de LB líquido durante la noche a 37 oC con agitación.
   NOTA: No es necesario comprobar el D.O. porque esta cepa puede alcanzar la fase estacionaria durante este tiempo.
8. Retire las placas NGM almacenadas, retire las tapas de la campana de flujo laminar y déjelas abiertas para permitir la evaporación del exceso de humedad de las placas.
9. Una vez que las placas se secan, utilice una pipeta Pasteur para añadir 100 éL de OP50 E. coli al centro de la placa sin esparcerse.
10. Dejar el césped OP50 E. coli para crecer durante la noche en RT o a 37 oC durante 8 h.
11. Añadir el número deseado de embriones de gusano obtenidos mediante tratamiento con hipoclorito o "blanqueo" (Sección 4).
    NOTA: Enfríe las placas a RT antes de la adición de gusanos.

4. Técnica de blanqueo para sincronizar cultivos De C elegans

1. Semillas y gusanos trozos en placas NGM de 6 cm.
2. Deje los gusanos creciendo durante 2-3 días para obtener un número suficiente de huevos y adultos gravid en el plato.
3. Una vez que haya suficientes huevos/adultos, vierta 5 ml de M9 en el plato.
4. Transfiera los gusanos a un tubo centrífugo de 15 ml utilizando una pipeta de vidrio.
5. Centrifugar el tubo durante 2 min a 2.000 x g y peletizar los gusanos.
6. Succionada la mayor parte del M9, evitando la perturbación del pellet de gusano.
7. Añadir 3 ml de solución de blanqueo (2:1:1 relación de NaOH:NaOCl:H₂O).
8. Invierta suavemente para mezclar la solución durante 5 minutos o hasta que disminuya el número de gusanos adultos intactos.
   ADVERTENCIA: No lejía durante más de 5 min.
9. Centrifugar durante 1 min a 2.000 x g y succionar la mayor parte de la solución de blanqueo sin alterar el pellet de gusano.
10. Añadir 15 mL de M9 y mezclar bien.
11. Centrífuga de nuevo a 2000 x g durante 1 min.
12. Succionar la mayor parte del M9 sin molestar el pellet de gusano.
13. Repita los pasos 4.10-4.12 una o dos veces más.
14. Añadir 5 mL de M9 fresco y agitar.
15. Deje que los huevos eclosionen durante la noche con un suave balanceo.

5. Preparación de la muestra de gusano

1. Deje que los embriones N2 obtenidos por el procedimiento de blanqueo eclosionen durante la noche en tampón M9 (5 ml en un tubo centrífugo de 15 ml) a 20 oC.
2. Cosecha los L1 sincronizados centrifugando el tubo durante 2 min a 2.000 x g.
3. Lave los gusanos con el búfer M9 1x, luego cuantifique el número de gusanos L1 vivos.
4. Semilla de aproximadamente 10.000 gusanos en placas NGM (10 cm de diámetro) con 1 ml de OP50 E. coli (previamente secado).
5. Incubar las placas durante 48 h a 20oC hasta que los gusanos lleguen a la etapa L4.
6. Cosecha los gusanos usando un tampón M9 frío en un tubo centrífugo de 15 ml, lávalos 1x, luego transfiéralos a un tubo de 1,5 ml.
7. Peletar los gusanos por centrifugación a 2.000 x g durante 1 min, eliminar la mayor parte del sobrenadante, sumergir los tubos en nitrógeno líquido y almacenar a -80 oC.

6. Extracción de lípidos

1. Descongelar aproximadamente 100 ml de gránulos de gusano congelados pertenecientes a N2 sobre hielo, añadir 1,3 ml de metanol y sonicar la muestra durante 4 min.
2. Añadir 2,6 ml de cloroformo y 1,3 ml de 0,5 M KCl/0,08 M H₃PO₄ a una proporción final de 1:2:1, 1.000 ppb del estándar interno 1-AG-d_5,e hidroxitolueno butilado como agente antioxidante a una concentración final de 50 g/ml.
3. Vortex las muestras durante 1 min y sonicar en un baño de agua ultrasónico durante 15 minutos en hielo.
4. Vortex las muestras 2x durante 1 min y centrífuga durante 10 min a 2.000 x g para inducir la separación de fase.
5. Recoger la fase inferior y recogerla en un tubo limpio, secarla con nitrógeno y resuspender el residuo sólido en 100 oL de ACN.

7. Análisis endocannabinoide por HPLC-MS/MS

1. Utilice cromatografía líquida junto con un espectrómetro de masas triple cuadrúpolo ESI para detectar y cuantificar 2-AG a partir de muestras de nematodos.
2. Utilice la siguiente relación para HPLC de fase inversa: de 0,0-0,5 min H₂O:ACN (40:60), 0,5-6,5 min H₂O:ACN (40:60) a (25:75), 6 .5-7.5 min H₂O:ACN (25:75), 7.5-8.0 min H₂O:ACN (25:75) a (40:60), 8.0-12.0 min H₂O: ACN (40:60).
3. Mantenga la temperatura de la columna a 40 oC y ajuste la temperatura de la bandeja del muestreador automático a 10 oC.
4. Establezca las siguientes condiciones de ionización: modo de iones positivos; gas de secado (N₂) temperatura a 300 oC; caudal de gas de secado a 10 L/min; presión del nebulizador a 10 UA; y gorra. tensión de 4 kV.
5. Para la detección de analitos, utilice MRM con las siguientes transiciones: 379,2 m/z a 289,2 m/z para 2-AG; y 384,2 m/z a 289,2 m/z para 1-AG-d₅.

8. Cuantificación endocannabinoide en gusanos

1. Utilice la norma interna deuteada 1-AG-d₅ y calcule las relaciones de área pico del analito según la norma interna.
2. Utilice las siguientes transiciones: 384,2 m/z a 287,2 m/z para 2-AG; y 379,2 m/z a 287,2 m/z para 1-AG-d₅.
3. Calcular la concentración del 2-AG endógeno comparando con las relaciones de área pico de la norma deuterada utilizando el valor de concentración de la norma.

Resultados

Un análogo etiquetado isotópicamente fue sintetizado con éxito a partir de d₈-glicerol y ácido araquidónico disponibles comercialmente utilizando un método sintético de 3 pasos(Figura 2, Figura 3). Estos pasos son sencillos y no requieren equipos sofisticados, condiciones especialmente controladas o costosos reactivos. Por lo tanto, este método es robusto y puede extenderse con éxito para sintetizar monoacilgl...

Discusión

Los endocannabinoides son una clase de lípidos que se han implicado en la regulación de la formación de dauer en C. elegans⁷. Más específicamente, la síntesis de ácidos grasos poliinsaturados (PUF) es importante para el tráfico de colesterol y el desarrollo reproductivo de gusanos. Aquí se revela que 2-AG, un ácido araquidónico que contiene endocannabinoide, es responsable de restitución de la larva dauer a su ciclo normal en gusanos que han deteriorado el metabolismo del cole...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-dimethylaminopyridine	Sigma-Aldrich	107700	reagent grade, 99%
antioxidant BHT	Sigma-Aldrich	W21805
Arachidonic acid	Sigma-Aldrich	10931
Glycerol-d8	Sigma-Aldrich	447498
Mass detector Triple Quadrupole	Thermo Scientific		TSQ Quantum Access Max
N,N’-diisopropylcarbodiimide	Sigma-Aldrich	D125407
NMR spectrometer	Bruker		Avance II 300 MHz
reversed-phase HPLC column	Thermo Fisher	25003-052130	C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm)
tert-Butyldimethylsilyl chloride	Sigma-Aldrich	190500	reagent grade, 97%
tetrabutylammonium fluoride	Sigma-Aldrich	216143	1.0M in THF
UHPLC System	Thermo Scientific		Ultimate 3000 RSLC Dionex
worm strain N2 Bristol	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)