Una tubería completa para aislar y secuenciar microRNAs, y analizarlos mediante herramientas de código abierto

Resumen

Aquí, describimos una estrategia paso a paso para aislar pequeños ARN, enriquecer para microARN y preparar muestras para la secuenciación de alto rendimiento. A continuación, describimos cómo procesar lecturas de secuencia y alinearlas con microRNAs, utilizando herramientas de código abierto.

Resumen

Se cree que la mitad de todas las transcripciones humanas están reguladas por microARN. Por lo tanto, la cuantificación de la expresión de microARN puede revelar mecanismos subyacentes en los estados de la enfermedad y proporcionar dianas terapéuticas y biomarcadores. Aquí, detallamos cómo cuantificar con precisión los microRNAs. Brevemente, este método describe el aislemiento de microARN, ligando a adaptadores adecuados para la secuenciación de alto rendimiento, la amplificación de los productos finales y la preparación de una biblioteca de muestras. A continuación, explicamos cómo alinear las lecturas de secuenciación obtenidas con horquillas microRNA, y cuantificar, normalizar y calcular su expresión diferencial. Versátil y robusto, este flujo de trabajo experimental combinado y análisis bioinformático permite a los usuarios comenzar con la extracción de tejidos y terminar con la cuantificación de microARN.

Introducción

Descubierto por primera vez en 1993¹, ahora se estima que casi 2000 microARN están presentes en el genoma humano². Los MicroRNAs son ARN pequeños que no codifican y que suelen tener entre 21 y 24 nucleótidos de largo. Son reguladores post-transcripcionales de la expresión génica, a menudo uniéndose a sitios complementarios en la región 3 no traducida (3-UTR) de genes diana para reprimir la expresión de proteínas y degradar el ARNm. La cuantificación de los microARN puede proporcionar información valiosa sobre la expresión génica y se han desarrollado varios protocolos para este propósito³.

Hemos desarrollado un protocolo definido, reproducible y de larga data para la secuenciación de ARN pequeño, y para analizar lecturas normalizadas utilizando herramientas bioinformáticas de código abierto. Es importante destacar que nuestro protocolo permite la identificación simultánea de microARN endógenos y construcciones exógenas que producen especies similares a microARN, al tiempo que minimiza las lecturas que se asignan a otras especies de ARN pequeños, incluyendo ARN ribosomales ( rRNAs), transferir ARN pequeños derivados del ARN derivados del ARN (trnA), ARN pequeños derivados de repetición y productos de degradación de ARNm. Afortunadamente, los microRNAs son 5-fosforilados y 2-3 hidroxilados⁴, una característica que se puede aprovechar para separarlos de estos otros pequeños ARN y productos de degradación de ARNm. Existen varias opciones comerciales para la clonación y secuenciación de microARN que a menudo son más rápidas y fáciles de multiplexar; sin embargo, la naturaleza propietaria de los reactivos del kit y sus modificaciones frecuentes hace que comparar las corridas de muestras sea un reto. Nuestra estrategia optimiza la recolección de sólo el tamaño correcto de los microRNAs a través de pasos de purificación de gel de acrilamida y agarosa. En este protocolo, también se describe un procedimiento para alinear las lecturas de secuencia con los microRNAs mediante herramientas de código abierto. Este conjunto de instrucciones será especialmente útil para los usuarios de informática novato, independientemente de si se utiliza nuestro método de preparación de bibliotecas o un método comercial.

Este protocolo se ha utilizado en varios estudios publicados. Por ejemplo, se utilizó para identificar el mecanismo por el cual la enzima Dicer corta ARN de horquilla pequeña a una distancia de dos nucleótidos del bucle interno de la estructura de bucle de tallo - la llamada "regla de recuento de bucles"⁵. También seguimos estos métodos para identificar la abundancia relativa de ARN de horquilla pequeña (shRNA) entregados a partir de vectores virales adeno-asociados a la recombinante (RAAVs), para identificar el umbral de expresión de ARNS pequeños que se puede tolerar antes del hígado toxicidad asociada con el exceso de expresión de ARNH⁶. Utilizando este protocolo, también identificamos microARN en el hígado que responden a la ausencia de microARN-122 - un microARN hepático altamente expresado - al mismo tiempo que caracterizan el patrón de degradación de este microARN⁷. Debido a que hemos utilizado nuestro protocolo consistentemente en numerosos experimentos, hemos sido capaces de observar los preparativos de la muestra longitudinalmente, y ver que no hay efectos de lote discernibles.

Al compartir este protocolo, nuestro objetivo es permitir a los usuarios generar cuantificación reproducible de microRNAs de alta calidad en prácticamente cualquier tejido o línea celular, utilizando equipos y reactivos asequibles, y herramientas bioinformáticas gratuitas.

Protocolo

Los experimentos con animales fueron autorizados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Washington.

Preparación de la biblioteca de ARN pequeño

1. Aislamiento de ARN

1. Aísle el ARN de una fuente biológica utilizando un reactivo de aislamiento de ARN estándar, o un kit que enriquezca para los microARN. Para los tejidos, lo mejor es comenzar con muestras congeladas en nitrógeno líquido y molidas a un polvo utilizando un mortero preenfriado y un pestillo.
2. Mida la integridad del ARN de cada muestra en un instrumento que pueda cuantificar el ARN y proporcionar un número de integridad de ARN (RIN). Los RIN deben ser >7.

2. 3' ligadura del adaptador

1. Preparar una reacción de ligadura en tubos de tiras de PCR, combinando: 11 l de ARN (1-3 g, utilizando la misma cantidad para cada muestra), 1,5 l de búfer de reacción de ligasa de ARN 10x T4, libre de ATP, 1 l de poli-etilenglicol (PEG), y 0,5 l de 3'-linker (100 m de clonación de mirna universal de lin Ker).
   NOTA: La ausencia de ATP ayuda a enriquecer los MIRNAs y minimiza la clonación de productos de degradación de ARNm. PEG actúa como un agente de aglomeración molecular, mejorando el éxito de la ligadura. El vinculador de clonación de miRNA universal tiene un grupo de bloqueo de 3' (amina) para evitar la autoligación, la circularización y la ligadura al ARN en el extremo de 5'.
2. Calentar las muestras a 95oC en un termociclador durante 30-40 s. Enfriar sobre hielo durante 1 min. Añadir 1 l de arn a D4 ligase 2 e incubar a temperatura ambiente durante 2 h. Preparar el gel (paso 2.3) mientras las muestras se están incubando.
   NOTA: La incubación a temperatura ambiente ayuda a evitar la ligadura eslador-eslabón. También hemos utilizado con éxito la ligasa de ARN T4 1.
3. Preparar 30 ml de un gel de poliacrilamida 15% con urea de 8 M (para un gel de 20x20 cm): 14,4 g de urea, 3 ml de ácido etilendiaminetetraacético de 10x Tris tampón (TBE), 11,2 ml de 40% 19:1 acrilamida y H₂O a 30 ml. La solución se disuelve mejor a 42 oC. Inmediatamente antes de la fundición, añadir 150 ml de 10% de persulfato de amonio (APS) y 30 l de tetrametiletilendiamina (TEMED) para la polimerización.
4. Vierta entre placas de vidrio separadas de 0,8 mm en un peine de fundición de plástico e inserte. Una vez que el gel se solidifique (alrededor de 20 min), añadir 0,5x TBE al tanque y lavar los pozos de urea residual pipeteando vigorosamente.
5. Pre-ejecutar el gel a una constante 375 V durante 25 minutos sin muestras para que la urea pueda entrar en el gel, luego lavar los pozos de nuevo.
   NOTA: Es posible que sea necesario reducir la cantidad de tensión en función del tipo de fuente de alimentación y del sistema de electroforesis que se utilice.
6. Una vez que las muestras se realizan ligando, añadir 15 éC de tinte de carga de acrilamida a las muestras (para una proporción de 1:1), a continuación, desnaturalizar durante 5 minutos a 95 oC en un termociclador.
7. Preparar 25 ng/L de marcadores de tamaño de 37 y 44 bp, diluidos con un tinte de carga de acrilamida de una parte. Las secuencias se enumeran en la Tabla1.
8. Cargue las muestras en el gel de poliacrilamida, dejando al menos un carril entre cada muestra. Cargar 20 l de al menos dos conjuntos de marcadores, en un patrón asimétrico para realizar un seguimiento de la orientación del gel.
9. Ejecute el gel a una constante de 375 V durante los primeros 15 minutos y luego aumente a una constante de 425 V para la carrera restante. Correr hasta que el azul bromofenol está a unos 1-4 cm de la parte inferior, que toma aproximadamente 2 h.
   NOTA: Si es necesario, el gel puede funcionar a una tensión constante más baja durante un período de tiempo más largo hasta que el azul bromofenol esté a unos 1-4 cm de la parte inferior.
10. Retire el gel de las placas de vidrio con un separador de placas y coloque el gel en un protector de página de plástico. Diluir 5 ml de bromuro de etidio en 500 ml de agua destilada y pipetear en carriles de marcadores justo por encima del marcador azul claro superior (ver Figura 1A).
    ADVERTENCIA: Utilice guantes para bromuro de etidio y deseche los residuos de acuerdo con la normativa local. Dejar sentarse durante 5 min.
11. Bajo la luz ultravioleta (UV), corte los geles de marcador superior a inferior en cada carril usando una cuchilla de afeitar limpia (ver Figura 1A). Pasar a un cuadrado de 4 x 4 cm de película de sellado de laboratorio, luego cortar el gel con unos 4 cortes horizontalmente y 3 verticalmente para producir 12 cuadrados pequeños (ver Figura 1B).
12. Pipetear 400 l de 0,3 M NaCl en el cuadrado de la película de sellado, y embudo piezas de gel en tubos siliconizados de 1,5 ml (ver Figura 1C). Agitar las muestras en un nutator a 4 oC durante la noche.
    NOTA: Otros tubos de 1,5 ml de baja retención se pueden sustituir por tubos siliconizados.
13. Después de al menos 12 h de agitación a 4oC, recuperar las muestras y ponerlas en hielo, junto con un tubo cónico de 100% etanol.
14. Transfiera 400 ml de sobrenadante a un tubo nuevo, y luego agregue 1 ml de 100% de etanol y 1 l de 15 mg/ml de coprecio de glucógeno. Asegúrese de recoger la mayor cantidad posible de sobrenadantes, girando hacia abajo a 4 oC y pipeteando más como sea necesario. Colocar a -80 oC durante 1 h, o -20 oC durante 2 h o más. El coprecio de glucógeno mejora la visibilidad y recuperación de pellets.
15. Girar a 4 oC a 17.000 x g durante 20-30 min. Retire todos los restos de etanol y deje que el pellet se seque al aire durante 5 min.

3. Ligación de eslabones de 5'

1. Vuelva a suspender el pellet pipeteando en 6,5 ml de agua libre de nucleasas. Dejar que el pellet se siente en el agua durante unos minutos primero ayudará con la resuspensión.
2. Después de girar el pellet y volver a cargar en agua, añadir 0,5 l de 100 m 5'-linker (con códigos de barras; ver tabla 1), 1 l de tampón de ligasa de ARN T4, 1 l de 10 mM de ATP y 1 l de PEG. Calentar a 90 oC durante 30 s, luego colocar sobre hielo. Añadir 1 l de ARN ligados 1 t4 y dejar incubar a temperatura ambiente durante 2 h.
3. Añadir 400 l de NaCl de 0,3 M, seguido de 400 ml de ácido fenol/cloroformo. Vortex 30 s - 1 min (la solución se verá turbia), y luego girar a 4 oC durante 10-15 min a la velocidad máxima en una microcentrífuga (17.000 x g). Extraiga la capa superior y colóquela en un nuevo tubo de 1,5 ml.
   NOTA: Evite pipetear cualquiera de la capa inferior.
4. Añadir 350 l de cloroformo, vórtice brevemente, y luego girar a 4 oC durante 10 minutos a la velocidad máxima (17.000 x g). Extraiga la parte superior más tarde y colóquela en un nuevo tubo de 1,5 ml. Añadir 1,5 ml de coprecio de glucógeno y 1 ml de etanol al 100%.
   NOTA: Una vez más, evite pipetear cualquiera de la capa inferior.
5. Vortex brevemente, luego colocar a -80 oC durante al menos 1 h, o -20 oC durante la noche.

4. Transcripción inversa (RT)

1. Encienda el bloque de calor de 42 oC. Gire las muestras a 4 oC y 17.000 x g durante 20-30 min. Retire todo el sobrenadante y deje que el pellet se seque al aire durante 5 min.
2. Vuelva a suspender la muestra de peletización en 8,25 ml de agua libre de nucleasas y, a continuación, añadir: 0,5 ml de imprimación RT de 100 m (Tabla1), y 5 ml de mezcla de reacción de 2 x RT a partir de un kit de síntesis de ADNc. Incubar a 42oC durante 3 min.
3. Añadir 1,5 ml de enzima RT de 10x a cada muestra e incubar a 42 oC durante 30 minutos en un termociclador. Colocar a -20oC o continuar con hidrólisis y neutralización.
   NOTA: Se pueden utilizar varios kits RT para los pasos 4.2 y 4.3.
4. Realizar hidrólisis alcalina y neutralización: Hacer 1 mL de 150 mM de solución de hidróxido de potasio (KOH) (150 ml de KOH de 1 M, 20 ml de 1 M Tris Base pH 7.5, y 830 l de H₂O) y 1 ml de ácido clorhídrico de 150 mM (HCl) (150 ol de 1 M H Y 500 ol y 850 ol de ácido clorhídrico (HCl) (150 ol de 1 M H y 850 ol de hclólvico) de H₂O).
5. Antes de añadir a las muestras, determine la cantidad de HCl necesaria para neutralizar la solución KOH. Generalmente, alrededor de 20-24 l de HCl neutralizará los 25 s de KOH. Compruebe la combinación en una tira de pH para asegurarse de que está en el rango correcto (pH 7.0 a 9.5).
6. Hidrolizar las muestras añadiendo 25 sL de solución KOH de 150 mM e incubar durante 10 min a 95 oC.
7. Neutralice las muestras añadiendo la cantidad de 150 mM de HCl determinada en el paso 4.4, para obtener un pH de muestra final entre 7.0 y 9.5.

5. Amplificación de PCR

1. Después de la neutralización, prepare una reacción de PCR con: 29,5 l de agua, 5 l de tamp taq 10x, 1 l de dNTP, 2 l de imprimación directa de 25 m (Tabla1), 2 ml de imprimación inversa de 25 m (Tabla1), 0,5 l de Taq y 10 l del ADNC transcrito inverso del paso 4.6 .
2. Ejecuta la siguiente reacción de PCR: 94oC durante 2 min, luego 20 ciclos de 94oC para 45 s, 50oC para 75 s y 72oC para 60 s.
3. Ejecuta una segunda reacción de PCR de aproximadamente 2-4 ciclos más usando 5 l de producto del paso 5.2. Mezclar: 34,8 l de agua, 5 l de tampón Taq de 10x, 1 l de dNTP, 1 l de imprimación directa de 25 oM (Tabla1), 1 l de imprimación inversa de 25 m (Tabla1) y 0,2 ml de polimerasa Taq. Siga los mismos parámetros termocicladores descritos en el paso 5.2.
   NOTA: El propósito de hacer dos reacciones de PCR – con la primera para 20 ciclos y la segunda para sólo 2-4 más – es asegurar que la cantidad de ADNc amplificado está en un rango dinámico (es decir, no una cantidad saturada).

6. Purificación del gel de agarosa

1. Prepara un gel de agarosa del 4% con agarosa de baja fusión. Cargue 40 l o más del producto PCR en el gel, junto con el tinte de carga. Cargue marcadores de tamaño de 100 bp y 25 bp.
   NOTA: La escalera de 25 bp ayuda a distinguir el producto amplificado de los productos de ligadura vinculador-vinculador. Los geles de agarosa de baja fusión deben ser fundidos con mayor cuidado que los geles de agarosa tradicionales, así que siga atentamente las instrucciones del fabricante.
2. Para la extracción de gel, seleccione el número de ciclo que es visible en el gel pero no está saturado (generalmente 22–24 ciclos). Elija bandas de intensidad similares al ejecutar varias muestras.
3. Corte la banda que está por encima de la banda de 125 bp (la banda más oscura en la escalera de 25 bp; véase la figura 1D). Usando un kit de extracción de gel, siga las instrucciones del fabricante para agregar tampón basado en un gel del 4%, luego agite para disolver la agarosa en el tampón a temperatura ambiente.
   NOTA: La disolución a 55 oC aumenta el potencial de ligadura vinculador-vinculador.
4. Siga las instrucciones de extracción de gel del fabricante y elule en 30 l de tampón de elución o agua. Si el producto se veía débil en el gel, a continuación, reducir la elución a 20 L.
5. Mida la concentración de ADNc utilizando una técnica sensible y prepare la biblioteca de muestras para la secuenciación. La preparación dependerá del tipo de secuenciación utilizada.
   NOTA: Los requisitos mínimos para una biblioteca de secuenciación suelen ser un volumen de 10 ml de producto de 10 m. Si las concentraciones son demasiado bajas, las muestras de piscina y etanol precipitan para llevar la biblioteca a la concentración deseada.
6. Secuenciar las muestras utilizando el equipo disponible. Un ejemplo común sería ejecutar muestras utilizando un kit para lecturas individuales de 50 bp, para obtener aproximadamente 15-25 millones de lecturas en un formato de salida FASTQ.

Alineación de secuencias de ARN pequeños y bioinformática

7. Carga de datos

1. Descargue los archivos FASTQ generados a partir de cada ejecución de secuenciación. Descargue una lista de secuencias de horquillas microRNA de miRbase.org^8,9,10.
2. Genere una cuenta Galaxy en www.usegalaxy.org y cargue un archivo FASTQ de lecturas de secuencia en esta cuenta.
3. Cargue un archivo de texto de secuencias de código de barras en la cuenta Galaxy, como barcodes.txt, que está disponible como un archivo de texto (Tabla suplementaria 1).
4. Sube un archivo FASTA de horquillas microRNA a la cuenta Galaxy desde una base de datos como miRBase.org. En la Tabla Suplementaria 2 y en la Tabla Suplementaria 3se proporcionan ejemplos de precursores de microARN (mousehairpins.fa) o humanos (humanhairpins.fa).

8. Eliminación del adaptador, clasificación de códigos de barras y ajuste

1. En la pestaña izquierda, vaya a Manipulación de archivos genómica > FASTA/FASTQ > Secuenciasde adaptador de clip .
2. En Archivo de entrada en formato FASTA o FASTQ, escriba el archivo FASTQ en la lista desplegable. Cambie Longitud mínima de secuencia a 18. Cambie Origen para introducir secuencia personalizada. Introduzca CTGTAGGC. Mantenga todos los demás parámetros predeterminados. Haga clic en Ejecutar.
   NOTA: Las lecturas de secuencia que son más cortas que 18 nucleótidos son difíciles de asignar de forma única a los microARN y contienen muchos productos de degradación.
3. En la pestaña izquierda, vaya a Manipulación de archivos genómica > FASTA/FASTQ > Divisorde código de barras .
   NOTA: Las funciones y encabezados Galaxy se actualizan periódicamente, por lo que la función de búsqueda puede ser necesaria para encontrar una herramienta equivalente o su ubicación. Los kits comerciales que utilizan imprimaciones indexadas a menudo ya están ordenados por código de barras. Por lo tanto, este paso y el paso de ajuste del código de barras no son necesarios si se inicia desde un kit comercial.
4. Para que los códigosde barras utilicen , apunte a barcodes.txt. Para que la biblioteca se divida,utilice Clip en el archivo de datos generado en el paso anterior. En Número de discrepancias permitidas, escriba 1. Haga clic en Ejecutar.
5. Recorta los primeros 4 nucleótidos: navega a Manipulaciones de texto > Recortar caracteres iniciales o finales. En Conjunto de datosde entrada , haga clic en el icono de carpeta, que es una colección de conjuntos de datos. Seleccione el archivo por lotes de muestras, que incluye la etiqueta Divisor de códigode barras en los datos. En Recortar desde el principio hasta esta posición, escriba 5. En ¿Está el dataset de entrada en formato FASTQ? escriba Sí. Haga clic en Ejecutar. La ejecución puede tardar varios minutos.

9. Alineación de lecturas a microRNAs

1. En Galaxy, vaya a Análisis genómico > RNA-Seq > Cuantificación de transcripción sailfish¹¹.
2. Para la pregunta Seleccione un transcriptoma de referencia de su historial o utilice un índice integrado? seleccione Usar uno del historial. Introduzca el archivo cargado mousehairpins.fa en la lista desplegable. En el archivo FASTA/Q, haga clic en el icono de carpeta para utilizar una colección de conjuntos de datos y seleccione el archivo que incluye Recortar en la colección. Haga clic en Ejecutar. La ejecución puede tardar varios minutos.
3. En la pestaña de historial de la derecha, haga clic en Sailfish en la colección... que es una lista con 19 artículos. Haga clic en cada archivo individual y haga clic en el icono de disco para guardarlo en el equipo local. Los archivos descargados individualmente primero deben descomprimirse. También es posible que deban volver a guardarse con una extensión .txt con el fin de importaren en una hoja de cálculo.
4. Abra cada archivo de hoja de cálculo y vuelva a nombrar la columna NumReads a la condición de tratamiento. Combine las columnas para generar una matriz de microARN en la primera columna y recuentos de lectura por condición en columnas posteriores.
5. Para calcular microARN expresados diferencialmente para cada condición de tratamiento, utilice el archivo con recuentos de lectura de microARN sin procesar como entrada para programas como DESeq2¹². DESeq2 está presente en Galaxy en la pestaña Análisis genómico > RNA-seq > DESeq2.
6. Convierta lecturas sin procesar en recuentos de lectura de microRNA normalizados. Los recuentos se normalizan a la profundidad de secuencia de la biblioteca mediante el siguiente cálculo: [(lecturas en bruto/lecturas totales de microARN) * (1.000.000 – número de microRNAs contados) + 1].
   NOTA: Este cálculo proporciona una lectura normalizada por millón (RPM) microARN asignados que se pueden comparar entre conjuntos de datos y condiciones biológicas. La salida es un archivo delimitado por tabulaciones. Sailfish proporciona una columna de salida tpm, aunque este valor se normaliza por longitud de horquilla microRNA, lo que no es necesario en este contexto.
7. Si procede, repita la alineación con secuencias de entrada personalizadas (por ejemplo, un vector) para identificar las lecturas que se asignan a construcciones entregadas, como shRNAs.

Resultados

Esquema de los pasos involucrados en la preparación de la biblioteca
En la Figura 2se describe un esquema general de extracción, secuenciación y alineación de ARN pequeños.
Se recogieron muestras de hígado de un ratón macho y una hembra y se congelaron en nitrógeno líquido. El ARN total se extrajo y evaluó la calidad y la concentración.

La secuenciación de ...

Discusión

A pesar de la identificación de microARN hace más de 20 años¹³, el proceso de secuenciación de microARN sigue siendo laborioso y requiere equipos especializados, impidiendo a los laboratorios adoptar rutinariamente protocolos internos^14. Otras técnicas pueden evaluar simultáneamente los microARN, como microarrays de microARN y paneles de expresión multiplexados; sin embargo, estos enfoques son limitados en el que sólo cuantifican los microRNAs presentes en su conjun...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 bp DNA ladder	NEB	N3231
19:1 bis-acrylamide	Millipore Sigma	A9926
25 bp DNA step ladder	Promega	G4511
Acid phenol/chloroform	ThermoFisher	AM9720
Acrylamide RNA loading dye	ThermoFisher	R0641
Ammonium persulfate (APS)	Biorad	161-0700
Bioanalyzer instrument	Agilent	G2991AA	For assessing RNA quality and concentration
Chloroform	Fisher Scientific	C298-500
Ethanol (100%)	Sigma	E7023
Gel Loading Buffer II	ThermoFisher	AM8547
GlycoBlue	ThermoFisher	AM9516	Blue color helps in visualizing pellet
HCl	Sigma	320331
KOH	Sigma	P5958
Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm	Genesee	45-109
miRVana microRNA isolation kit	ThermoFisher	AM1560
miSeq system	Illumina	SY-410-1003	For generating small RNA sequencing data
NaCl	Fisher Scientific	S271-500
Nusieve low-melting agarose	Lonza	50081
Parafilm (laboratory sealing film)	Millipore Sigma	P7793
Poly-ethylene glycol 8000	NEB	included with M0204
ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit	NEB	E6560S
QIAquick Gel Extraction kit	Qiagen	28704
Qubit Fluorometer	ThermoFisher	Q33226	For quantifying DNA concentration
Qubit RNA HS Assay kit	ThermoFisher	Q32855
Razor Blades	Fisher Scientific	12640
Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes	Fisher Scientific	02-681-331
T4 RNA ligase 1	NEB	M0204
T4 RNA Ligase 2, truncated K227Q	NEB	M0351S
TapeStation	Agilent	G2939BA	For assessing RNA quality and concentration
Taq DNA Polymerase	NEB	M0273X
TEMED	Biorad	161-0800
Tris Base pH 7.5	Sigma	10708976001
Tris-buffered EDTA	Sigma	T9285
Trizol	ThermoFisher	15596026
UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml)	Invitrogen	15585-011
Universal miRNA cloning linker	NEB	S1315S
Urea	Sigma	U5378