Uso de ensayos de entrada viral y análisis de acoplamiento molecular para la identificación de candidatos antivirales contra el coxsackievirus A16

Resumen

El objetivo del protocolo es ilustrar los diferentes ensayos relacionados con la entrada viral que se pueden utilizar para identificar los inhibidores de entrada viralcandidatos.

Resumen

Los ensayos antivirales que examinan mecanísticamente la entrada viral son pertinentes para discernir en qué paso los agentes evaluados son más eficaces y permiten la identificación de los inhibidores de entrada viralcandidatos. Aquí, presentamos los enfoques experimentales para la identificación de moléculas pequeñas capaces de bloquear la infección por el coxsackievirus No envuelto A16 (CVA16) a través de la orientación a las partículas del virus o pasos específicos en la entrada viral temprana. Los ensayos incluyen el análisis de tiempo de adición de fármacos, el ensayo de unión viral basado en citometría de flujo y el ensayo de inactivación viral. También presentamos un protocolo de acoplamiento molecular que utiliza proteínas cápside de virus para predecir posibles residuos dirigidos por los compuestos antivirales. Estos ensayos deben ayudar en la identificación de agentes antivirales candidatos que actúan sobre la entrada viral. Las instrucciones futuras pueden explorar estos posibles inhibidores para el desarrollo de fármacos adicionales.

Introducción

La enfermedad de manos, pies y boca (HFMD) es una enfermedad más comúnmente causada por el coxsackievirus A16 (CVA16) y el enterovirus 71 (EV71) en niños pequeños. Recientemente en toda la región de Asia y el Pacífico, ha habido un repunte significativo en la HFMD inducida por CVA16. Si bien los síntomas pueden ser leves, pueden ocurrir complicaciones graves que afectan el cerebro y el corazón, con una posible letal^1,2. En la actualidad, no hay terapias antivirales autorizadas ni vacunas disponibles para CVA16, por lo que es urgente desarrollar estrategias antivirales para frenar futuros brotes y las complicaciones asociadas.

CVA16 es un virus no envuelto que tiene una cápside icosahedral ensamblado a partir de pentámeros que contienen 4 proteínas estructurales, a saber, VP1, VP2, VP3 y VP4. Rodear cada eje de cinco veces en el pentamer es una región 'canyon' que se muestra como una depresión y se destaca por su papel en la unión de receptores³. En la parte inferior de este cañón se encuentra un bolsillo hidrófobo en la región de VP1 que contiene un ligando graso natural llamado esfingosina (SPH). Se ha sugerido que los receptores celulares, como el ligando de glicoproteína p -1 (PSGL-1) y el receptor carroñero de la clase B miembro 2 (SCARB2), desempeñen un papel en la unión viral desplazando este ligando que resulta en cambios conformacionales en la posterior expulsión del genoma viral en la célula huésped^4,5,6. La identificación de posibles inhibidores que bloquean los sucesivos eventos en el proceso de entrada viral podría proporcionar posibles estrategias terapéuticas contra la infección por CVA16.

Los pasos en el ciclo de vida del virus se pueden diseccionar a través de enfoques experimentales como objetivos para ayudar a identificar agentes antivirales específicos del modo. Un análisis de tiempo de adición de fármacos examina el efecto del tratamiento farmacológico en diferentes momentos durante la infección viral, incluyendo la preentrada (agregada antes de la infección por el virus), la entrada (agregada simultánea a la infección por el virus) y la infección por virus)⁷. El impacto se puede evaluar utilizando un ensayo de placa estándar cuantificando el número de placas virales formadas en cada una de las condiciones del tratamiento. El ensayo de unión viral basado en citometría de flujo determina si el medicamento evita la unión viral a las células huésped. Esto se logra cambiando la temperatura de 37 oC, a la que se producen la mayoría de las infecciones por virus humanos, a 4 oC, donde los viriones son capaces de unirse a la superficie de la célula huésped pero no pueden entrar en las células⁷. Las partículas del virus unido a la membrana celular se cuantifican a través de la inmunomancha contra los antígenos virales y se evalúan mediante citometría de flujo. El ensayo de inactivación viral, por otro lado, ayuda a evaluar posibles interacciones físicas del fármaco con partículas de virus libres, ya sea protegiendo o neutralizando los viriones, o causando agregaciones o cambios de conformación que los hacen inactivos para interacciones posteriores con la superficie de la célula huésped durante la infección^8,9. En este experimento, el inóculo viral se permite incubar primero con el fármaco antes de ser diluido para valorar la droga antes de infectar a la monocapa de la célula huésped y realizar un ensayo de placa estándar⁸. Por último, el acoplamiento molecular es una poderosa herramienta para predecir posibles sitios de interacción farmacológica en la superficie del virión, incluidas las glicoproteínas virales de los virus envueltos y las proteínas cápside virales de virus no envueltos, mediante el uso de virus computacionales Algoritmos. Esto ayuda a identificar mecanísticamente los objetivos del modo de acción de la droga y proporcionar información útil que puede ser validada aún más por ensayos posteriores.

Recientemente empleamos los métodos descritos anteriormente para identificar compuestos antivirales que bloquearon eficientemente la infección por el CVA16⁹no envuelto. En este documento, se describen y discuten los protocolos detallados que se utilizaron.

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Protocolo

NOTA: Todos los cultivos celulares y las infecciones por virus deben llevarse a cabo en campanas de bioseguridad certificadas que sean adecuadas para el nivel de bioseguridad de las muestras que se manipulan. Las dos moléculas pequeñas de ácido quebulágico (CHLA) y punicalagin (PUG), quese observaron para bloquear eficientemente la infección CVA16 9, se utilizan como ejemplos de agentes inhibidores candidatos. Para los principios básicos en técnicas virológicas, propagación de virus, determinación de la sentenciadeda de virus y conceptos de unidades formadoras de placas (PFU) o multiplicidad de infección (MOI), se remite al lector a la referencia¹⁰.

1. Cultivo celular, preparación de virus, preparación de compuestos y citotoxicidad compuesta

1. Las células humanas de rabdomiosarcoma (RD) son células huésped permisivas a la infección CVA16¹¹. Cultivar las células RD en 10 ml del medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 200 U/ml de penicilina G, 200 g/ml de estreptocina y 0,5 g/ml de anfotericina B en frascos De-75 a 37 oC en una incubadora de CO 2.
2. Prepare CVA16 propagando el virus en las células rd y determine el titer viral en PFU/ml. Para el protocolo optimizado, consulte la referencia¹¹.
3. Preparar los compuestos y controles de ensayo utilizando sus respectivos disolventes: por ejemplo, disolver CHLA y PUG en dimetilsulfóxido (DMSO). Para todos los pasos de infección, el medio basal consistía en DMEM más 2% FBS y antibióticos.
   NOTA: La concentración final de DMSO en los tratamientos compuestos de ensayo es igual o inferior al 0,25% en los experimentos; 0.25% DMSO se incluye como un tratamiento de control negativo en los ensayos para la comparación.
4. Realizar el ensayo de citotoxicidad de los compuestos de ensayo en las células RD utilizando un reactivo determinante de viabilidad celular como XTT ((2,3-bis[2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenilo]-5-feniloamino)-carbonilo]-2H-tetrazolium hidróxido). Para un protocolo detallado, consulte la referencia¹². Determinar las concentraciones de citotoxicidad de los compuestos de ensayo utilizando un software analítico como GraphPad Prism de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para el resto del estudio se utilizan concentraciones de fármacos que no influyen significativamente en la viabilidad celular (células viables del 95%) .

2. Ensayo de tiempo de adición de drogas

1. Evaluar la influencia de los medicamentos en las células huésped antes de la infección viral (pretratamiento)
   1. Células de RD de semillas en placas de 12 pocillos a una densidad de sembración de 2 x 10⁵ células/pozo. Incubar durante la noche a 37oC en una incubadora de CO₂ al 5% para obtener una monocapa.
   2. Tratar las células RD con compuestos de ensayo a concentraciones no citotóxicas (determinadas a partir del paso 1.4) en 1 ml de volumen de medios basales durante 1 h o 4 h.
   3. Lavar las células con 1-2 ml de PBS antes de añadir 50 PFU/pozo de virus en medio basal (el volumen final del inóculo es de 300 ol) durante 1 h. Mece la placa cada 15 minutos.
   4. Después de la infección, lave las monocapas de nuevo usando PBS, luego superponga con 1 ml de medios basales que contengan 0,8% de metilcelulosa para una mayor incubación a 37 oC en una incubadora de_CO2 al 5%.
   5. Después de 72 h de incubación, retire el medio de superposición y lave los pozos usando 2 ml de PBS.
   6. Fijar los pozos usando 0.5 mL de 37% formaldehído durante 15 min.
   7. Retire el sobrenadante y lávelo de nuevo con PBS.
   8. Mancha los pozos con 0,5 ml de solución violeta cristalina al 0,5%. A continuación, retire la solución de manchas en 2 minutos y lave los pozos con una corriente suave de agua antes de secar al aire.
   9. Cuente las placas virales colocando la placa en una caja de luz blanca. Calcular el porcentaje (%) CVA16 infección de la siguiente manera: (Media de virus de placa _{+ droga} / Media de virus de placa + _{control DMSO}) - 100%.
2. Evaluar el efecto de la adición de los fármacos y el virus simultáneamente (co-adición)
   1. Células de RD de semillas en placas de 12 pocillos a una densidad de sembración de 2 x 10⁵ células/pozo. Incubar durante la noche a 37oC en una incubadora de CO₂ al 5% para obtener una monocapa.
   2. Tratar las células RD con los compuestos de ensayo a las concentraciones adecuadas y 50 PFU/pozo de CVA16 (el volumen final del inóculo es de 300 ol) simultáneamente durante 1 h. Mecer la placa cada 15 minutos.
   3. Lavar las células con 1 ml de PBS y luego superponer con 1-2 ml de medios basales que contengan 0,8% de metilcelulosa para una mayor incubación a 37 oC en una incubadora de CO2 al 5%.
   4. Mancha las placas virales con cristal violeta después de 72 h después de la infección y determinar el% de la infección CVA16 como se describió anteriormente.
3. Evaluar el efecto del tratamiento farmacológico después de la entrada viral (post-infección)
   1. Células de RD de semillas en placas de 12 pocillos a una densidad de sembración de 2 x 10⁵ células/pozo. Incubar durante la noche a 37oC en una incubadora de CO₂ al 5% para obtener una monocapa.
   2. Inocular las células RD con 50 PFU/pozo de CVA16 (el volumen final del inóculo es de 300 ol) durante 1 h. Mece la placa cada 15 minutos.
   3. Lavar los pozos con 1-2 ml de PBS y superponer las células con medios basales que contengan 0,8% de metilcelulosa y las concentraciones adecuadas de compuestos de ensayo.
   4. Manchas placas virales con violeta cristalina y cuentan después de 72 h después de la infección y determinan el% de las incubaciones de infección CVA16 descritas anteriormente.
      NOTA: Realice todos los lavados DE PBS suavemente para evitar levantar las células.

3. Ensayo de enlace basado en citometría de flujo

1. Células de RD de semillas en placas de 12 pocillos a una densidad de sembración de 2 x 10⁵ células/pozo. Incubar durante la noche a 37oC en una incubadora de CO₂ al 5% para lograr una monocapa.
2. Enfríe previamente la monocapa celular a 4oC durante 1 h.
3. Infectar las células de RD con CVA16 (MOI a 100) en presencia y ausencia de los compuestos de ensayo durante 3 h a 4 oC.
   NOTA: Realizar la inoculación viral sobre el hielo y la incubación subsiguiente en un refrigerador de 4oC para mantener la temperatura a 4oC, lo que permite la unión viral pero no la entrada.
4. Retire el inóculo del virus y lávelo una vez con 1-2 ml de PBS helado.
5. Levante las células agregando 1 ml de tampón de disociación helada a los pozos en hielo durante 3 minutos, antes de recoger las células y resuspenderlas en tampometría de citometría de flujo de frío y hielo (1x PBS más 2% FBS).
6. Lave las células dos veces con el tampón de citometría de flujo frío y fije las células con 0,5 ml de paraformaldehído al 4% durante 20 minutos sobre hielo.
7. Lavar las células usando PBS para eliminar cualquier virus no enlazado o débilmente unido, y luego manchar las células con 1 ml de anticuerpo anti-VP1 (1:2,000; diluido en PBS que contiene 3% de BSA) en hielo durante 1 h, seguido de la incubación con un IgG secundario conjugado con el propio Ratón Conjugado Alexa 488 (1:250; diluido en PBS que contiene 3% de BSA) sobre hielo durante 1 h. Realizar lavados de PBS (3 veces) después de cada tratamiento con anticuerpos.
8. Resuspenda las células en 0,5 ml del tampón de citometría de flujo frío y realice análisis de citometría de flujo en un citometro de flujo utilizando procedimientos estándar. Presente los datos en histogramas utilizando el software asociado y el quantitado para la representación del gráfico de barras.

4. Ensayo de inactivación viral

1. Realice el ensayo de inactivación viral como se describió anteriormente¹² utilizando las siguientes condiciones:
   - Concentración inicial de 10⁶ PFU/ml de CVA16.
   - Monocapas de células RD en placas de 12 pocillos a partir de una densidad de sembrado de 2 x 10⁵ células/pozo.
   - 50 veces la dilución para la valoración de los compuestos de la droga resultando en una concentración final del virus de 50 PFU/bueno.
   - Lavar los pasos con 1-2 ml de PBS.
   - Medios superpuestos que contienen 0,8% de metilcelulosa.
2. Realizar la lectura final de la infección viral utilizando la tinción violeta cristalina de las placas virales procedimiento como se detalló anteriormente.

5. Análisis de acoplamiento molecular

1. Descargar moléculas 3D de compuestos de prueba de PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Si las moléculas no tienen una estructura 3D cargada, descargue las estructuras 2D o utilice la secuencia de cuerdas SMILES y transforme en moléculas 3D a través de un programa molecular (por ejemplo, CORINA).
2. Descargue la unidad de ensamblaje biológico viral de RCSB Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/) y prepare el modelo de estructura viral utilizando un programa de biocomputación (por ejemplo, UCSF Quimera). Por ejemplo, en el caso de la estructura de cristal de virión madura CVA16 (PDB: 5C4W)³, eliminar disolventes del archivo PDB, reemplazar las cadenas laterales incompletas utilizando datos de la Biblioteca Rotamer Dunbrach 2010, y añadir hidrógenos y cargas a la estructura como previamente reportado¹³. Los objetivos de acoplamiento pueden ser cualquier proteína viral relevante para el análisis previsto con información de ensamblaje biológico (Banco de Datos de Proteínas).
3. Acople compuestos de prueba en la unidad de virus preparada utilizando, por ejemplo, ucSF Quimera, y analice los archivos de salida con un software de visualización (por ejemplo, Autodock Vina, PyMol):
   1. Cargue el archivo compuesto de prueba en UCSF Quimera como el 'ligand' y realice el acoplamiento ciego seleccionando toda la proteína viral preparada como el 'receptor'. Utilice el ratón del ordenador o el trackpad para cambiar el tamaño del volumen de búsqueda a todo el 'receptor'. En 'Opciones avanzadas', permita que el número de modos de enlace sea al máximo. Los marcos de acoplamiento se clasificarán automáticamente de mayor a menor energía de enlace.
   2. (Opcional) Además del acoplamiento a ciegas, limite el sitio de acoplamiento a la proteína viral en regiones de interés derivadas de los resultados de acoplamiento ciego utilizando el ratón o el trackpad de nuevo para reducir el volumen de búsqueda (por ejemplo, 100 x 100 x 100 o). Este paso ayuda a confirmar los resultados de acoplamiento ciego y aumenta la especificidad.
   3. Utilice un sistema de gráficos moleculares (por ejemplo, PyMol) para analizar las posiciones de los modos de enlace cargando el archivo de acoplamiento. Encuentra contactos polares desde el compuesto hasta la proteína viral seleccionando el 'ligand' e identificando los contactos polares con la opción 'a cualquier átomo'; examinar los resultados.

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Resultados

El ensayo de tiempo de adición de fármacos está indicado en la Figura 1 y muestra la influencia del tratamiento utilizando las moléculas pequeñas CHLA y PUG en la infección CVA16, ya sea la entrada previral (pretratamiento), durante la entrada viral (adición co-similar) o la entrada postviral ( post-infección). Ambas moléculas pequeñas sólo produjeron un impacto marginal contra la infectividad CVA16, ya sea en el pretratamiento de las células hué...

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Discusión

En este informe, describimos los protocolos que son útiles para la identificación de candidatos antivirales que se dirigen a la entrada viral, en particular contra el CVA16 no envuelto. Los ensayos están diseñados de manera sectización de los primeros eventos durante la entrada viral, lo que es útil para aclarar el mecanismo o mecanismos de acción y los posibles objetivos de la actividad antiviral de los agentes de prueba. El "ensayo de tiempo de adición de fármacos" permite determinar ampliamente el objetivo po...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde	Sigma	AL-158127-500G
Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG	Invitrogen	A11029
Amphotericin B	GIBCO	15290-018
Anti-VP1 antibody	Merck-Millipore	MAB979	Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D
Beckman Coulter Cytometer	Beckman Coulter	FC500
Corina	Molecular Networks GmbH
Crystal violet	Sigma	C3886-100G
DMEM	GIBCO	11995-040
DMSO	Sigma	D5879
FBS	GIBCO	26140-079
Formaldehyde	Sigma	F8775
Graphpad Prism	GraphPad
Heparin sodium salt	Sigma	H3393
In vitro toxicology assay kit, XTT-based	Sigma	TOX2
Methylcellulose	Sigma	M0512-100G
PBS pH 7.4	GIBCO	10010023
Penicillin-Streptomycin	GIBCO	15070-063
PyMol	Schrödinger
UCSF Chimera	University of California, San Francisco