Ensayo Desafiador durotaxis de una sola célula para evaluar el control mecánico del movimiento celular y los eventos de señalización relacionados

Resumen

Las fuerzas mecánicas son importantes para controlar la migración celular. Este protocolo demuestra el uso de hidrogeles elásticos que se pueden deformar utilizando una micropipeta de vidrio y un micromanipulador para estimular las células con un gradiente de rigidez local para provocar cambios en la estructura celular y la migración.

Resumen

Durotaxis es el proceso por el cual las células detectan y responden a gradientes de tensión. Para estudiar este proceso in vitro, se debe manipular la rigidez del sustrato subyacente a una célula. Mientras que los hidrogeles con rigidez calificada y ensayos de migración a largo plazo han demostrado ser útiles en estudios de durotaxis, las respuestas inmediatas y agudas a los cambios locales en la tensión del sustrato permiten el estudio centrado de los movimientos celulares individuales y los eventos de señalización subcelular. Para probar repetidamente la capacidad de las células para detectar y responder a la rigidez del sustrato subyacente, se utiliza un método modificado para la aplicación de gradientes agudos de mayor tensión a las células individuales cultivadas en hidrogeles deformables que permite tiempo real la resistencia y la dirección de los gradientes de rigidez impartidos sobre las células en cuestión. Además, al afinar los detalles y parámetros del ensayo, como la forma y las dimensiones del micropipeta o la posición relativa, la colocación y la dirección del degradado aplicado, el ensayo se puede optimizar para el estudio de cualquier tipo de celda sensible y sistema. Estos parámetros se pueden modificar para cambiar de forma fiable el estímulo aplicado y ampliar la funcionalidad y versatilidad del ensayo. Este método permite el examen tanto del movimiento durotáctico a largo plazo como de cambios más inmediatos en la señalización celular y la dinámica morfológica en respuesta a la rigidez cambiante.

Introducción

En las últimas décadas, la importancia de las propiedades mecánicas del entorno de una célula ha ganado un reconocimiento creciente en la biología celular. Diferentes tejidos y matrices extracelulares tienen diferentes rigidezes relativas y, a medida que las células migran por todo el cuerpo, navegan por estos cambios, utilizando estas propiedades mecánicas para guiarlos^{1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7}. Las células utilizan la rigidez de un tejido dado para informar su comportamiento móvil durante procesos como el desarrollo, la cicatrización de heridas y la metástasis del cáncer. Sin embargo, los mecanismos moleculares que permiten la sensación y respuesta a estas entradas mecánicas siguen siendo en gran medida desconocidos^{1,2,3,4,5, 6 , 7}.

Para estudiar los mecanismos a través de los cuales las células responden a las señales ambientales físicas, se debe manipular la rigidez o rigidez de las células adherentes subyacentes del sustrato. En 2000, Chun-Min Lo, Yu-Li Wang y sus colegas desarrollaron un ensayo⁸ por el cual la respuesta móvil de una célula individual a las señales mecánicas cambiantes podría ser probada directamente mediante el estiramiento de la matriz extracelular deformable (ECM) recubierto de poliacrilamida hidrogeles en los que se dolaron las células. Las células exhiben una preferencia significativa por migrar hacia sustratos más rígidos, un fenómeno que llamaron "durotaxis".

Desde el informe original en 2000, se han empleado muchas otras técnicas para el estudio de durotaxis. Los gradientes de rigidez escarpados se han fabricado mediante la fundición de geles sobre características rígidas como cuentas de poliestireno⁹ o postes de polímero rígido¹⁰ o polimerizando el sustrato alrededor de los bordes de una cubierta de^vidrio1 para crear mecánica ' escales». Alternativamente, los hidrogeles con gradientes de rigidez más superficiales pero fijos han sido fabricados por una variedad de métodos como gradientes de reticulador creados por dispositivos microfluídicos^12,13 o gotas de solución de hidrogel lado a lado de rigidezdiferente 8, o hidrogeles con retitulador fotoreactivo tratado con exposición a la luz UV calificada para crear un gradiente de rigidez lineal^14,15. Estas técnicas se han utilizado con gran efecto para investigar el movimiento celular durotáctico en masa con el tiempo. Sin embargo, normalmente estas características se fabrican antes del revestimiento de celdas y sus propiedades permanecen consistentes en el transcurso del experimento, confiando en el movimiento aleatorio de las celdas para el muestreo de gradientes mecánicos. Ninguna de estas técnicas es susceptible a la observación de cambios rápidos en el comportamiento celular en respuesta a estímulos mecánicos agudos.

Con el fin de observar las respuestas celulares a los cambios agudos en el entorno mecánico, los ensayos de durataxis de una sola célula ofrecen varias ventajas. En estos ensayos, las células individuales reciben un estímulo mecánico agudo al alejar el sustrato subyacente de la célula con una micropipeta de vidrio, introduciendo así un gradiente direccional de tensión de matriz celular. A continuación, se observan cambios en el comportamiento móvil, como la velocidad o la dirección de la migración, mediante microscopía de contraste de fase de células vivas. Este enfoque facilita la observación directa de las relaciones de causa y efecto entre los estímulos mecánicos y la migración celular, ya que permite una manipulación rápida e iterativa de la dirección y magnitud del gradiente de tensión y la evaluación de los consiguientes respuestas celulares en tiempo real. Además, este método también se puede utilizar para estimular mecánicamente las células que expresan proteínas de fusión fluorescentes o biosensores para visualizar los cambios en la cantidad, actividad o localización subcelular de proteínas sospechosas de estar involucradas en la mechanosensing y durotaxis.

Esta técnica ha sido empleada por grupos que estudian durotaxis^8,16 y se describe aquí ya que ha sido adaptada por el Laboratorio Howe para estudiar el comportamiento durotáctico de las células cancerosas de ovario SKOV-3 y los mecanismos moleculares que subyacente durotaxis¹⁷. Además, se describe un método modificado para la fabricación de hidrogeles con una sola capa uniforme de microesferas fluorescentes cerca de la superficie de cultivo celular; esto facilita la visualización y optimización de gradientes de tensión generados por micropipette y puede permitir la evaluación de la contractilidad celular mediante microscopía de fuerza de tracción.

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Protocolo

1. Fabricación de hidrogeles de poliacrilamida desformables con microesferas fluorescentes integradas

NOTA: Las instrucciones describen la polimerización de un hidrogel de 25 kPa de 22 m de diámetro y de aproximadamente 66 m de espesor. Todos o cada uno de estos parámetros se pueden modificar y las direcciones para hacerlo se pueden encontrar en el Cuadro 1 y en las notas¹⁷.

1. Activación de platos con fondo de vidrio o tapas
   1. Prepare la solución de trabajo de silano de unión para la activación de una placa de imágenes con fondo de vidrio o una cubierta que se ajuste a una cámara de imágenes de células vivas. Mezclar 950 éL de etanol al 95%, 50 ml de ácido acético glacial y 5 l de silano de unión (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane).
      NOTA: El uso de un cubreobjetos inferior más grande en comparación con la cubierta superior dará espacio adicional para trabajar al preparar el gel y facilitará la colocación de la micropipeta de vidrio en pasos posteriores. Además, si utiliza un cubreobjetos en lugar de una placa de imágenes con fondo de vidrio, limpie la cubierta como se describe en la siguiente sección.
   2. Activar la superficie del vidrio durante 20 s con una varita corona e inmediatamente superponer 50 l de la solución de trabajo de silano de unión. Deje que la solución se seque durante 10 min.
   3. Enjuagar dos veces con 95% de etanol, luego dos veces con isopropanol y luego dejar que los cubreobjetos se sequen al aire durante aproximadamente 20 minutos.
      NOTA: El vidrio activado se puede almacenar durante un máximo de una semana en un desecador.
2. Limpieza de los cubrecubiertas superiores
   1. Limpie los cubreobjetos superiores de 22 mm incubando en 2% de HCl a 70 oC durante 30 min, luego lave en ddH₂O durante 10 min dos veces.
   2. Incubar los cubreobjetos en una solución de concentrado de limpieza de cubeta del 2% en ddH₂O a 50 oC durante 30 min, luego lavar en ddH₂O durante 10 min dos veces.
   3. Incubar los labios de las cubiertas en ddH₂O a 90 oC durante 30 min, luego en etanol 70% a 70 oC durante 10 min, y luego secar al aire a 60 oC durante un mínimo de 2 h.
      NOTA: Los cubreobjetos limpios se pueden almacenar indefinidamente en un desecador limpio.
3. Microesfera fluorescente / deposición de perlas en los cubreobjetos superiores
   1. Sonicar la solución de stock de microesferas fluorescentes durante 1 h en un baño de agua ultrasónico. Hacer una solución de perlas de trabajo diluyendo el stock de perlas 1:200 en 100% etanol y sonicar de nuevo durante 1 h.
   2. 15 minutos antes de que la solución de perlas haya terminado de sonicar, limpie a fondo los revestimientos colocándolos verticalmente en un soporte de cubierta de cerámica y tratando con plasma de aire de habitación durante 3 minutos en un limpiador de plasma demesa.
   3. Para facilitar el manejo y evitar el deslizamiento de la cubierta durante los pasos posteriores, coloque un pedazo de parafilm en una tapa de 60 mm de petri o en un recipiente similar. Coloque el cubreobjetos en el estabilizador y toque ligeramente hacia abajo, asegurando un buen contacto entre el parafilm y el cubreobjetos.
   4. Para un cubreobjetos de 22 mm, agregue 150 s de la solución de cordón de trabajo a la parte superior de la cubierta. Aspirar inmediatamente la solución de etanol desde el lado de la cubierta, dejando las perlas en la cubierta. Deje que el cubreobjetos se seque al aire.
      NOTA: La cantidad de solución de perlas de trabajo añadida debe ser de 4 l/cm² y se puede escalar para adaptarse a cualquier resbalón de tamaño.
4. Hidrogeles de fundición con perlas fluorescentes incrustadas
   1. Preparar la solución de hidrogel de acrilamida y bis-acrilamida. Mezclar la solución de acuerdo con la Tabla1, luego añadir 2,5 s de 10% de APS y 0,5 l de TEMED. Mezcla bien. Pase inmediatamente al siguiente paso.
      NOTA: La mezcla de la solución de hidrogel se puede modificar para variar el módulo del Joven, o rigidez, del hidrogel cambiando la relación de acrilamida a bis-acrilamida como se muestra en la Tabla1. Estos valores han sido verificados para su uso en el laboratorio Howe utilizando microscopía de fuerza atómica, pero deben ser confirmados dentro de su institución.
   2. Inmediatamente después de hacer la solución de hidrogel, agregue una gota de 25 l al lado activado de la placa de fondo de vidrio o al cubreobjetos inferior, luego coloque inmediatamente el cubreobjetos recubierto de perlas en la solución, lado perla hacia abajo. El contacto con la caída con el otro lado de la cubierta seguido de una bajada lenta ayuda a evitar la captura de burbujas de aire dentro del hidrogel.
      NOTA: La altura del hidrogel debe estar dentro de la distancia de trabajo de la lente objetivo que se utilizará en el experimento posterior. Una altura de hidrogel de 66 m funciona bien para la mayoría de los sistemas. El tamaño del hidrogel se puede escalar añadiendo más o menos solución de hidrogel dependiendo del tamaño de la cubierta. Para calcular el volumen adecuado de la solución de hidrogel, utilice la ecuación para el volumen de un cilindro, V á r²h donde r es el radio de deslizamiento de cubierta y h es la altura de hidrogel deseada. Típicamente, este cálculo predice con precisión justa la altura real del hidrogel, medida por la preparación de un gel con cubiertas recubiertas de perlas en la parte superior e inferior y utilizando un microscopio confocal para medir la distancia entre los dos planos del cordón. Sin embargo, se ha observado que la altura real del hidrogel puede desviarse de este cálculo en 20 m (por ejemplo, dependiendo del espesor y fabricante de la cubierta superior de vidrio). Se recomienda la medición directa de la altura del gel utilizando el método descrito anteriormente.
   3. Deje que el gel polimerice durante 30 minutos, luego retire suavemente el cubreobjetos superiores con fórceps. Añadir 50 mM HEPES pH 8.5 al plato puede facilitar la eliminación. Lavar durante 5 min en 50 mM HEPES pH 8,5 tres veces.
5. Activación de hidrogel y recubrimiento de matriz extracelular
   1. Active la superficie del hidrogel incubando en hexanoato de 0,4 mM Sulfo-SANPAH (sulfosuccinimidil 6-(4'-azido-2'-nitrofeniloamino) en 50 mM HEPES pH 8.5. Exponer inmediatamente a una lámpara de arco UV en un área cerrada.
      NOTA: Proteja Sulfo-SANPAH de la luz antes de la activación. Para una lámpara de 400 W, coloque el gel a 10 cm de distancia de la bombilla dentro de la caja de luz e ilumine durante 100 s. La solución Sulfo-SANPAH cambiará de naranja brillante a marrón oscuro.
   2. Lavar durante 5 min en 50 mM HEPES pH 8,5 tres veces.
      NOTA: Los geles hidratados pueden almacenarse a 4oC durante un máximo de una semana.
   3. Incubar el hidrogel activado en fibronectina de 20 g/ml en 50 mM de HEPES pH 8,5 durante 1 h a 37oC.
   4. Aspirar la solución de fibronectina y lavar durante 5 minutos en solución salina con fosfato (PBS) tres veces. Esterilice el hidrogel y la tapa del plato durante 15 minutos bajo luz UV en una campana de cultivo de tejido con un bajo volumen de PBS. Lavar una vez en PBS estéril.
      NOTA: Se pueden utilizar otros tipos de proteína ECM para recubrir el hidrogel, incluyendo colágeno y laminina.

2. Células de chapado

1. Añadir 3 ml de medios que contengan 21.000 celdas para llenar un plato de 60 mm para una densidad celular final de 1000 celdas/cm^2. Ajuste la densidad de sembrado según sea necesario para evitar el hacinamiento y permitir el libre movimiento de las células individuales.
2. Permita que las células se recuperen a 37 oC durante al menos 4 horas y hasta 18 horas antes de la toma de imágenes. Prepárese para la toma de imágenes entrando con medios de diagnóstico por imágenes dos veces antes de agregar medios de diagnóstico por imágenes. Permita que las células se equilibren durante al menos 30 minutos antes de tomar imágenes.
   NOTA: Las condiciones de los medios de pantalla de antemano para determinar las condiciones que optimizarán la migración en la línea de celda que se está utilizando. Para las células SKOV-3, DMEM sin rojo fenol, que contiene 20 mM HEPES y 12,5 ng/ml factor de crecimiento epidérmico estimula la mayor cantidad de migración. Las condiciones óptimas para las células Ref52 son Tampón de Ringer con 10% de suero bovino fetal (FBS) y factor de crecimiento derivado de plaquetas de 25 ng/ml.

3. Preparación de micropipeta de vidrio: pipeta tirando y forja

1. Tire de micropipetas de vidrio borosilicato de 100 mm de largo con un diámetro exterior de 1,0 mm y diámetro interior de 0,58 mm en un proceso de dos pasos para obtener un cónico de más de 2 mm que se reduce a 50 mm en el primer milímetro y se extiende a un tubo largo y paralelo de 10 m de diámetro en el último milímetro.
2. Cargue el pipeta tirado en una microforja. Dé forma a la pipeta para tener una punta contundente de 15 m que se encierra en el extremo de una sección de 250 m doblada en un ángulo de 35o desde el resto de la tubería. El diámetro aproximado en la curva debe ser de alrededor de 30 m para dar fuerza a la punta.
   NOTA: Las dimensiones de la inclinación y la punta se pueden ajustar para aplicar correctamente la fuerza deseada (consulte el paso 5). Tirando de micropipetas a 65 oC para el primer paso para 3 mm, y 60 oC para el segundo paso produce las dimensiones descritas en el paso 3.1. Los resultados con diferentes tiradores de pipetas pueden variar.
3. Esterilice el micropipeta en 70% de etanol antes de su uso.

4. Colocación del micromanipulador y la micropieta

1. Retire la tapa del plato y cargue el plato en el escenario y el centro del microscopio. Utilice un objetivo de aumento 10X o similarmente bajo. Cubra el medio con aceite mineral para evitar la evaporación de los medios.
2. Inserción de pipeta tirada
   1. Inserte el pipeta tirado en la vaina de la micropipette, apuntando el gancho hacia el plato. La punta del gancho será el punto más bajo cuando se baje al gel.
   2. Inserte la vaina en el micromanipulador y ajuste hasta que la punta del pipeteo esté centrada sobre la lente objetivo en ambas direcciones X e Y.
   3. Baje el pipeta usando un manipulador grueso hasta que solo toque la superficie del líquido.
3. Usando contraste de fase o campo brillante, enfoca el microscopio en la capa de perlas en la parte superior del gel. Este será el plano de referencia.
4. Asegurarse de que el objetivo no está en peligro de golpear la muestra o etapa, poner el foco por encima del gel para encontrar la punta de la micropipeta, utilizando pequeños ajustes del manipulador grueso en las direcciones X e Y para proyectar sombras en el plano focal. Sólo baje el micropipeta cuando esté seguro de que la punta misma del pipeteo está en el campo de visión.
5. Asegúrese de que la punta contundente del micropipeta esté apuntando hacia abajo girando el pipeta en la vaina o girando la vaina en el micromanipulador hasta que la punta sea perpendicular al plano focal. Repita los pasos 4.4 y 4.5 según sea necesario. Concéntrese en la punta de la tubería.
6. Enfóquese de nuevo a la capa superior del cordón del gel para medir qué tan lejos está el pipeteo de la superficie del gel. Enfóquese de nuevo en un plano que se encuentra a parte del gel y la punta de la tubería. Baje lentamente la tubería para llegar al plano focal intermedio.
7. Repita el paso 4.6 hasta que se puedan apreciar sombras muy débiles de la punta del micropipeta cuando se enfoque en el hidrogel. Aumente a la siguiente ampliación más alta.
8. Baje el micromanipulador hasta que las sombras y las refracciones de la punta misma del micropipeta se puedan apreciar dentro del plano focal de la capa de perlas.
9. Aumente el aumento a lo que se utilizará en el experimento. Baje el pipeta hasta que se cierne justo por encima de la superficie del hidrogel.

5. Calibración del micromanipulador y la generación de fuerza

1. En fase o campo brillante, baje el micropipeta flotante para tocar la superficie del hidrogel. Observe cómo el pipeteo se ve al contacto con el hidrogel. Continúe bajando el micropita en Z hasta que los ajustes en X e Y causen tracción y desviación del hidrogel en esas direcciones. Utilice las microesferas o células cercanas como marcas fiduciarias.
   NOTA: Si el micromanipulador está unido al brazo del condensador de fase o al banco y no a la etapa de la muestra en sí, desenganche siempre el gel antes de mover el escenario para evitar romper la tubería o perturbar las células. Si el pipeteo se rompe, vuelva al paso 3 y al paso 4.
2. Encuentre un área desprovista de células para enganchar el gel. Tire de él en todas las direcciones y sentirse cómodo con la forma en que la micromanipulación se traduce en la deformación del gel.
3. Tome imágenes fluorescentes del campo de cuentas sin manipulación, con el pipeta enganchando el gel, y con el pipeteo comprometido tirando del gel. Repita esto varias veces tomando buenas notas con respecto a las marcas de graduación en el micromanipulador, la forma en que la punta del pipeteo se ve en fase o campo brillante en cada etapa de tirar, y la distancia que la punta se mueve usando esa manipulación.
4. Utilice ImageJ como se describió anteriormente^16,17 para calcular los desplazamientos relativos de perlas y la fuerza aplicada a las perlas comparando el campo de cordón nulo con el campo de cordón sin compromiso de pipeta, el campo de cordón con el gel activado, y el gel tirado.
5. Para afinar el estímulo tensal, compare la aplicación de la fuerza utilizando diferentes dimensiones de la punta de la micropipeta, distancias de la célula o distancia tirada por el micromanipulador desde el punto inicial de touchdown. El efecto de la dimensión de la punta de la micropipeta en la aplicación de la fuerza da una gran flexibilidad al usuario, pero también demuestra la necesidad de generar mapas de fuerza para nuevos micropipetas, incluso cuando las dimensiones y la forma se asemejan mucho a las puntas calibradas anteriormente.

6. Llevar a cabo el ensayo durotaxis

1. Antes de realizar el experimento, practique la participación del gel cerca de una célula y observe la deformación de la célula cuando se reposiciona el micromanipulador.
2. Supervise un grupo de celdas que tienen polaridad clara y parecen moverse durante 30 minutos para identificar las celdas que se mueven de forma dirigida.
3. Elija una celda que se mueva en una sola dirección clara y monitorícela a la velocidad de fotogramas deseada durante 30 minutos adicionales.
4. Si se desea la determinación de las fuerzas ejercidas sobre la célula o la tensión ejercida por la célula, capture las imágenes de campo del cordón en cada adquisición. Si la célula cambia su curso de dirección durante el monitoreo, elija una célula diferente para monitorear, ya que esto hará difícil determinar el efecto de la estimulación.
5. Encienda el hidrogel aproximadamente a 50 m de distancia de la célula. Coloque el pipeta delante del lado cercano del borde delantero y mueva el micromanipulador de forma que el gel se deforme ortogonalmente a la dirección de viaje de la celda. Observe la célula a lo largo del tiempo a medida que responde al gradiente agudo y local de rigidez.
   NOTA: El tiempo proporcionado aquí es eficaz cuando se monitorean los fibroblastos SKOV3 o Ref52, sin embargo, el intervalo y el curso de tiempo general deben ajustarse para adaptarse al tipo de célula y al evento biológico que se observa. Si se empareja con microscopía de fluorescencia, detenga la adquisición de fluorescentes inmediatamente antes del paso 6.5., utilice el contraste de fase o el campo brillante para colocar la micropipeta y el tirón, y reinicie la adquisición de fluorescentes inmediatamente después.
6. Si el pipeteo se desliza o si el degradado se relaja o suelta de otro modo, busque una nueva celda repitiendo los pasos 6.2 y 6.3.

7. Determinación de la respuesta migratoria dura

1. Usando ImageJ¹⁹ u otro programa de análisis de imágenes, calcule el ángulo de giro dibujando una línea entre el centro del borde inicial de la celda a 0 min y 30 min monitor de poste (reflejando la trayectoria original de la celda) y otra línea entre el centro de el borde delantero justo antes y 80 minutos después de la estimulación y la medición del ángulo entre estas dos líneas.

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Resultados

Mediante la preparación de micropipetas (Figura 1) y la normalización de la generación de fuerza de los tiradores (Figura2 y Figura 3) como se ha descrito anteriormente, se han identificado condiciones durasóptimas óptimas para varias líneas celulares. Utilizando esta técnica, como se describe en la Figura4, las células cancerosas de ovario SKOV-3¹⁷ y los fibroblastos emb...

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Discusión

Aquí se muestra un ensayo repetible de durataxis de una sola célula que permite evaluar la capacidad de una célula para alterar su comportamiento de migración en respuesta a señales mecánicas agudas. Esta técnica también se puede utilizar en combinación con microscopía de fluorescencia y proteínas de fusión o biosensores apropiados para examinar la señalización subcelular y los eventos citoqueléticos en cuestión de segundos de estimulación mecánica o en un plazo más largo durante movimiento durotáctic...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide 40 %	National Diagnostic	EC-810
Ammonium Persulfate	Fisher	BP179-25
BD20A High frequency generator	Electro Technic Products	12011A	115 V - Handheld Corona Wand
Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) (	Sigma Aldrich	M6514
Bis-acrylamide 2%	National Diagnostic	EC-820
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	1B100-4
Branson 2510 Ultrasonic Cleaner	Bransonic		40 kHz frequency
Coarse Manipulator	Narshige	MC35A
DMEM	Corning	10-013-CV
DMEM without phenol red	Sigma Aldrich	D5030
Dual-Stage Glass Micropipette Puller	Narshige	PC-10
Epidermal Growth Factor	Peprotech	AF-100-15
Ethanol	Pharmco-aaper	111000200
Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot)	Gibco	A31606-02
Fibronectin	EMD Millipore	FC010
Fluospheres Carboxylate 0.2 um	Invitrogen	F8810, F8807, F8811
Fugene 6	Roche	1815091	1.5 μg DNA / 6 μL fugene 6 per 35 mm dish
Glacial Acetic Acid	Fisher Chemical	A38SI-212
Glass Bottom Dish	CellVis	D60-60-1.5-N
Glass Coverslip	Electron Microscopy Sciences	72224-01	22 mm, #1.5
HCl	JT Baker	9535-03
Hellmanex III Special cleaning concentrate	Sigma Aldrich	Z805939	Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips
HEPES powder	Sigma Aldrich	H3375	Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5
Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light	Uviton International	UV0338
Isopropanol	Fisher Chemical	A417-4
Microforge	Narshige	MF900
Micromanipulator	Narshige	MHW3
Mineral Oil	Sigma Aldrich	M5904
Nanopure Life Science UV/UF System	Barnstead	D11931	ddH2O
Nikon Eclipse Ti	Nikon
OptiMEM	Invitrogen	31985062
Parafilm M	Bemis Company, Inc	PM-992
PBS			139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4
Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB)	Sigma Aldrich	P4056
Ref52			Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS
Ringer's Buffer			134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4
SKOV-3	American Type Culture Collection		Culture in DMEM + 10% FBS
Sulfo-SANPAH	Covachem	12414-1
Tabletop Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
TEMED	Sigma Aldrich	T9281-50