Aislamiento de subconjuntos de macrófagos y células estromas de especímenes miocárgonos humanos y de ratón

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para aislar varios subconjuntos de macrófagos y otras células no inmunes del miocardio humano y de ratón mediante la preparación de una suspensión de una sola célula a través de la digestión enzimática. También se presentan esquemas de gating para la identificación basada en citometría de flujo y la caracterización de macrófagos aislados.

Resumen

Los macrófagos representan las poblaciones de células inmunitarias más heterogéneas y abundantes del corazón y son fundamentales para impulsar la inflamación y las respuestas reparadoras después de una lesión cardíaca. Cómo varios subconjuntos de macrófagos orquestan las respuestas inmunitarias después de una lesión cardíaca es un área activa de investigación. Aquí se presenta un protocolo simple que nuestro laboratorio realiza de forma rutinaria, para la extracción de macrófagos de muestras de ratón y miocardio humano obtenidas de individuos sanos y enfermos. Brevemente, este protocolo implica la digestión enzimática del tejido cardíaco para generar una suspensión de una sola célula, seguida de la tinción de anticuerpos, y la citometría de flujo. Esta técnica es adecuada para ensayos funcionales realizados en células clasificadas, así como secuenciación de ARN a granel y de una sola célula. Una de las principales ventajas de este protocolo es su simplicidad, mínima variación diaria y amplia aplicabilidad que permite investigar la heterogeneidad de los macrófagos en varios modelos de ratón y entidades de enfermedades humanas.

Introducción

Los macrófagos representan el tipo de células inmunitarias más abundante en el corazón, y desempeñan un papel importante en la generación de respuestas inflamatorias y reparativas robustas después de una lesión cardíaca^1,2,3,4. Anteriormente, nuestro grupo identificaba dos subconjuntos principales de macrófagos en el corazón murino derivados de orígenes de desarrollo distintos^5,6. En términos generales, se pueden identificar poblaciones distintas de subconjuntos de macrófagos cardíacos residentes en tejidos en función de la expresión de la superficie celular de CCR2 (receptor de quimioquina con motivo C-C 2). CCR2^- los macrófagos (expresión de la superficie celular: CCR2^-MHCII^low y CCR2^-MHCII^high)son de origen embrionario (linajes primitivos y eritromieloides), capaces de autorenovarse y representar a una población dominante en condiciones homeostáticas. Los macrófagos residentes CCR2⁺ son de origen hematopoyético definitivo, se mantienen a través del reclutamiento de monocitos circulantes y representan a una población menor en condiciones homeostáticas. Funcionalmente, CCR2^- los macrófagos generan una inflamación mínima y son críticos para el desarrollo coronario de regeneración cardíaca neonatal^5,7. Por el contrario, CCR2⁺ macrófagos inician respuestas inflamatorias robustas después de insultos cardíacos y contribuyen a la lesión colateral de cardiomiocitos, la remodelación adversa del ventrículo izquierdo, y la progresión de la insuficiencia cardíaca^8,9.

Recientemente, hemos demostrado que el miocardio humano también contiene dos subconjuntos distintos de macrófagos identificados de manera similar como CCR2^- o CCR2⁺⁸. La expresión génica y los análisis funcionales revelaron que los macrófagos ccr2^{humanos -} y CCR2⁺ representan subconjuntos funcionalmente divergentes y son funcionalmente análogos a CCR2^- y los macrófagos CCR2⁺ que se encuentran en el corazón del ratón. CCR2 humano^- los macrófagos expresan niveles robustos de factores de crecimiento, incluyendo IGF1, PDGF, Cyr61, y HB-EGF. CCR2⁺ macrófagos se enriquecen en quimioquinas y citoquinas que promueven la inflamación, como IL-1b, IL-6, CCL-2, CCL-7, y TNF-a. Los macrófagos estimulados CCR2⁺ macrófagos secretan niveles notablemente más altos de la interleucina de citoquina inflamatoria-1o (IL-1o) en cultivo. La forma en que estos subconjuntos contribuyen diferencialmente a la reparación de tejidos y a la remodelación del ventular izquierdo (LV) en el contexto de una lesión cardíaca sigue siendo un área de investigación activa.

El análisis basado en citometría de flujo de la heterogeneidad de macrófagos en el ratón y el corazón humano requiere digerir el tejido cardíaco y generar una suspensión de una sola célula seguida de un análisis citométrico de flujo o clasificación celular para otros procesos aguas abajo, como la secuenciación masiva de ARN/secuenciación de ARN de una sola célula o el cultivo de las células para ensayos funcionales. El protocolo original para hacer una suspensión de una sola célula de corazones murinos fue reportado por primera vez por el grupo Nahrendorf en Nahrendorf et al. 2007¹⁰. Nuestro laboratorio ha adaptado y modificado el protocolo para extraer macrófagos del miocardio humano. Usando el mismo protocolo pero con ligera modificación en el esquema de tinción y gating, CD45^- células estromales del miocardio humano también se pueden cosechar. Aquí se presenta, en texto y vídeo, un protocolo que se realiza rutinariamente para la extracción de macrófagos o estromatos del miocardio humano.

Las muestras de tejido cardíaco se obtienen de pacientes adultos con cardiomiopatía dilatada (DCM: idiopática o familiar) o cardiomiopatía isquémica (MIC) sometidos a implantación de dispositivode asistencia ventricular izquierda (LVAD) o trasplante cardíaco. Los corazones explantados o los núcleos LVAD se perfunden intravascularmente con salina fría antes de iniciar el procedimiento de digestión. Es importante tener en cuenta que la "calidad" de la muestra de tejido determinada en términos de grado de cicatrización o infiltración de tejido adiposo puede afectar en gran medida el rendimiento de los macrófagos. Los especímenes cardíacos con grandes áreas de cicatrización tendrán un rendimiento celular mucho menor y pueden plantear una limitación técnica grave cuando los métodos de análisis aguas abajo deseados requieren el cultivo celular in vitro.

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Protocolo

El protocolo presentado ha sido aprobado por la Universidad de Washington en st. Louis Institutional Review Board (#201305086). Todos los sujetos proporcionan consentimiento informado antes de la recolección de muestras y los experimentos se realizan de acuerdo con el protocolo de estudio aprobado. El protocolo presentado se realiza con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Escuela de Medicina de la Universidad de Washington y sigue las pautas descritas en la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Preparación de especímenes de tejido cardíaco humano

1. Enjuague los corazones explantados mediante la cánula de la ostia de la arteria coronaria izquierda y derecha y perfundie con 200 ml de salina fría.
2. Enjuague los tejidos de núcleo apical de LVAD cannuando un vaso epicardial y perfundie con 50 ml de salina fría.
3. Muestra de tejido diseccionado de la pared apical o lateral del ventrículo izquierdo en solución salina fría o HBSS utilizando una tijera estéril.
4. Diseccionar cuidadosamente la grasa epicardial y las tendineas de chordae de la muestra usando tijeras finas.
5. Diseccionar trozos de tejido en trozos que pesan aproximadamente 200 mg con la ayuda de una hoja estéril o tijeras.

2. Preparación del corazón del ratón

1. Eutanasia del ratón mediante asfixia por_CO2 o dislocación cervical.
2. Abra la cavidad torácica con la ayuda de tijeras afiladas. Usa hemostats contundentes para levantar el corazón hacia arriba. Perfumar el corazón con PBS frío utilizando una aguja de 25 G unida a una jeringa de 5 ml. Perfundie hasta que el corazón aparezca blanqueado en color.
3. Retire el corazón y colóquelo en un plato estéril de Petri sobre hielo.

3. Preparación de la suspensión de una sola célula

1. Coloque trozos de tejido cardíaco humano (200 mg) o corazón murino en un plato estéril de Petri. Picar finamente el tejido usando una cuchilla estéril o tijeras.
2. Configure las digestiones:
   1. Utilice un volumen de digestión final de 3 ml por trozo de tejido cardíaco humano (200 mg) o por corazón murino. Las concentraciones finales de enzimas son las siguientes: Colagenasa1 (450 U/ml), DNase1 (60 U/ml), Hialuronidasa (60 U/ml).
   2. Para cada reacción de digestión añadir DMEM y todas las enzimas a un tubo cónico de 15 ml. Con la ayuda de fórceps limpios, coloque el tejido finamente picado en cada tubo de reacción. Mezclar bien mediante vórtice suave.
3. Digerir durante 1 h a 37oC en una incubadora de agitación a una velocidad de agitación baja a media.
4. Después de 1 h de digestión, saque los tubos de la incubadora y colóquelos sobre hielo. Ponga tubos cónicos de 50 ml con un colador de células de 40 m en la parte superior. Humedezca los filtros con 2 ml de tampón de desactivación de enzimas (ED).
5. Desactive las enzimas de digestión añadiendo 8 ml de tampón ED a cada tubo de digestión. A continuación, vierta la mezcla total de 13 ml resultante a través del colador de células de 40 m en los tubos cónicos de 50 ml. Transfiera las muestras de nuevo en un tubo cónico fresco de 15 ml. Esto permite una peletización celular óptima y minimiza la pérdida celular durante la centrifugación.
6. Girar las muestras a 400 x g durante 6 min (Centrifugar a 4oC). Deseche el sobrenadante dejando 0,5 ml de medios. Resuspenda el pellet celular pipeteando suavemente y agregue 1 ml de tampón de lisis ACK. Gire suavemente el tubo e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos para realizar la lisis de glóbulos rojos (RBC).
7. Después de 5 min en el búfer ACK, agregue 9 mL de DMEM a la muestra. Vuelva a colocar la tapa en los tubos e invierta suavemente los tubos para mezclar y filtre a través de un colador de células de 40 m. Recoger el filtrado en tubos cónicos de 15 ml.
8. Centrifugar los tubos a 400 x g durante 6 min y desechar el sobrenadante.
9. Agregue 1 mL de búfer FACS y vuelva a suspender el pellet. A continuación, transfiera en las celdas del búfer FACS a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar de nuevo a 400 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 100 ml de facS Buffer. Una suspensión de una sola célula ya está lista para la tinción de anticuerpos.

4. Staining de anticuerpos

1. Un panel típico de anticuerpos humanos consta de los siguientes anticuerpos: CD45-PercpCy5.5, CD14-PE, CD64-FITC, HLA-DR-APC/Cy7, CCR2-APC. Consulte la Tabla 1. Añadir todos los anticuerpos a las muestras del corazón a 1:50 dilución e incubar por 30-40 min a 4 oC en la oscuridad. Continúe con el paso 4.4 a continuación.
2. Para las células estromas (células endoteliales, fibroblastos, células musculares lisas), agregue DRAQ5 (concentración final de 1 M) y CD45-percpCy5.5. Consulte la Tabla 1. Incubar durante 30 min a 4oC en la oscuridad. Continúe con el paso 4.4 a continuación.
3. Para los macrófagos cardíacos murinos, agregue los siguientes anticuerpos: CD45-PercpCy5.5, CD64-APC, MHCII-APC/Cy7, CCR2-BV421 y Ly6G-FITC. Consulte la Tabla 2. Añadir todos los anticuerpos a las muestras del corazón a 1:100 dilución e incubar por 30-40 min a 4 oC en la oscuridad. Continúe con el paso 4.4 a continuación.
4. Lave las muestras dos veces en el búfer FACS. Para cada lavado, añadir 1 ml de tampón FACS, vórtice suavemente y centrífuga a 400 x g durante 5 min, resuspender en 350 ml de tampón FACS y añadir DAPI (1 M, concentración final). Las muestras ya están listas para el análisis/clasificación de FACS.

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Resultados

El protocolo descrito permite el aislamiento de macrófagos del ratón y el miocardio humano. Usando el mismo protocolo, pero con una estrategia diferente de tinción y gating, las células estromales también se pueden cosechar del miocardio humano. Los resultados de FACS presentados aquí se adquirieron en la plataforma BD LSRII o BD FACS ARIA III. Se generaron controles de compensación a partir de muestras de control de color único a partir de splenocitos manchados.

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Discusión

El protocolo permite la extracción de varios subconjuntos de macrófagos del miocardio humano. El protocolo es simple y tarda de 3 a 4 horas en preparar la suspensión de una sola célula lista para el análisis facS. Aunque el protocolo es relativamente fácil de realizar, hay ciertos aspectos técnicos que deben ser considerados que minimizarán la variabilidad. En primer lugar, trabajar de manera oportuna con tejido humano es necesario para una óptima viabilidad celular. Es importante mantener el tejido en salina fr...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conocal Tubes	Thermo Fisher	14-959-53A
40 µm Cell Strainers	Thermo Fisher	50-828-736
50 mL Conical Tubes	Thermo Fisher	352098
ACK Lysis Buffer	Gibco	A10492-01
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2058
Collagenase 1	Sigma	C0130-1G
DAPI	Thermo Fisher	D1306
DMEM 1x	Gibco	11965-084
DNAse 1	Sigma	D4527-20KU
DRAQ5	Thermo Fisher	62251
EDTA 0.5 M pH 8	Corning	46-034-CI
Enzyme Deactivating Buffer			490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA
FACS Buffer			976 mL PBS, 20 mL FBS, 4 mL EDTA (0.5 M)
Fetal Bovine Serum	Gibco	A3840201
Forceps	VWR	82027-406
HBSS 1x	Gibco	14175-079
Hemostats	VWR	63042-052
Hyaluronidase type 1-s	Sigma	H3506-500MG
PBS 1x	Gibco	14190-136
Petri dishes	Thermo Fisher	172931
Razor Blade	VWR	55411-050
Scissors	VWR	82027-578