Una técnica de lesión mínimamente invasiva para los músculos intrínsecos al odontoforo de Aplysia californica

Resumen

Aquí te presentamos un protocolo para lesiones quirúrgicas mínimamente invasivas de los músculos intrínsecos al aparato de alimentación del molusco marino Aplysia californica para entender las funciones de estos músculos durante el comportamiento de alimentación.

Resumen

Aplysia californica es un sistema modelo para estudiar el control neuronal del aprendizaje y el comportamiento. Este animal tiene un sistema circulatorio semiabierto, lo que permite acceder a muchas de sus estructuras internas sin causar ningún daño significativo. Muchas manipulaciones se pueden realizar fácilmente tanto in vivo como in vitro, por lo que es un modelo altamente manejable para el análisis de comportamiento y circuitos neuronales. Para entender mejor las funciones de los músculos dentro de la pinza de alimentación, hemos desarrollado una técnica para lesionarlos sin abrir la cavidad principal del cuerpo del animal o dañar las capas externas del órgano de alimentación (es decir, la masa bucal). En esta técnica, la pinza se vuelve parcialmente siempre, lo que permite el acceso directo a la musculatura. Este procedimiento permite a los animales recuperarse de forma rápida y fiable. Esto ha hecho posible lesionar los músculos I7 y las fibras subrradiulares, lo que nos permite mostrar que ambos músculos contribuyen significativamente a la apertura in vivo.

Introducción

El sistema de alimentación de Aplysia californica tiene una larga historia de uso como sistema modelo para entender el aprendizaje y la memoria¹, comportamientos motivados^2,3, y la interacción entre el comportamiento, la biomecánica y la control neural durante la alimentación⁴. Tiene circuitos neuronales altamente accesibles, con un número relativamente pequeño de grandes neuronas identificables. El animal tiene un sistema circulatorio semiabierto, lo que permite acceder a muchas de sus estructuras internas sin causar daños significativos. También es robusto para muchas manipulaciones tanto in vivo como in vitro, por lo que es un modelo altamente manejable para el análisis de comportamiento y circuitos neuronales.

Para entender los patrones neuronales que dan lugar a comportamientos de alimentación, es importante describir la mecánica subyacentede la estructura blanda que compone el órgano de alimentación, la masa bucal 4. Si bien se ha hecho un trabajo para caracterizarlos músculos exteriores que componen la masa bucal 5,⁶, los músculos internos de la estructura subyacente dentro de la masa bucal que controla la superficie de la pinza, el odontoforo, han sido en gran medida inaccesible a la experimentación in vivo. Aunque ha habido estudios in vitro sobre lasfunciones de algunos de estos músculos 7,⁸, la falta de acceso directo a estos músculos ha hecho difícil estudiar su papel en intactos, comportarse animales.

La mayoría de las técnicas de implantación de electrodos o lesiones enAvelsia o especies similares de moluscos requieren que la pared corporal se abra 9,^10,11,12. La apertura de la pared del cuerpo causa una lesión epitelial, y la incisión debe estar sellada de forma segura para prevenir la fuga de hemolinfa. Se plantean dificultades aún más graves al intentar llegar a los músculos internos de la pinza de Aplysia (músculos subyacentes a la superficie radular o dentro del odontóforo): después de haber entrado a través de la cavidad principal del cuerpo, uno debe pasar por algunos parte de la pared muscular de la masa bucal para acceder a las estructuras interiores (Figura1A). Esta lesión acumulada y la dificultad de acceso han hecho que el enfoque a través de los medios convencionales sea problemático porque los animales no se recuperan bien de estas cirugías (de animales con todas las eversiones, sólo el 17% recuperó cualquier capacidad de alimentación, N .12. Alrededor del 85% de los animales no everted recuperaron la capacidad de alimentarse, N.o 84).

El músculo I7, que se ha caracterizadocomo un abridor radular 8, está en lo profundo del propio odontoforo, lo que complica aún más el acceso. Se extiende entre la base del tallo radular (Figura1C)y la parte inferior de la superficie radular, a través de un lumen en el odontoforo (Figura 1C). En tres lados de los músculos I7 son paredes de músculo, y la cuarta pared consiste en el tallo radular. A los efectos de un estudio biomecánico, un deterioro importante de cualquiera de estas estructuras comprometería el funcionamiento normal del aparato de alimentación. Desarrollamos un enfoque novedoso de trabajar el odontóforo a través de las mandíbulas, y la realización de la cirugía a través de una incisión a la superficie radular delgada y cartilaginosa, que hizo posible lesionar el músculo I7, así como las fibras musculares finas recién descritas que correr justo debajo de la superficie radular, que nos referimos como las fibras subrradicales (Figura 1C).

Figura 1: Visión general anatómica. (A) Ubicación de la masa bucal dentro de Aplysia. (B) Anatomía externa del odontoforo. La superficie de la rádula y el saco radular son amarillos; los músculos que componen el odontóforo se muestran en rojo, en función de sus colores reales. (C) Sección sagital de odontoforo, que muestra la ubicación de las fibras subrareles (línea rosa curva) y el músculo I7 (línea rosa recta). La sección transversal del músculo I6 se muestra en rojo oscuro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

Las aaplysias son invertebrados y, por lo tanto, no están sujetos a la aprobación de la UIC. Para minimizar las molestias a los animales, asegúrese de que estén completamente anestesiados antes de aplicar las técnicas quirúrgicas descritas a continuación.

1. Selección y anestesia de animales

1. Seleccione un animal activo ofreciéndole algas marinas y confirmando que los intervalos de mordida no son mayores que entre 3 y 5 s.
2. Anestesiar al animal con cloruro de magnesio molar 0.333 (ver Tabla 1) inyectando cerca de la cabeza con una aguja de 18 G en una jeringa de 60 ml para que la mayor concentración de anestésico esté alrededor de la masa bucal.
   1. Tenga cuidado de penetrar tanto el epitelio externo como la capa interna del tejido con la aguja. Asegúrese de que la inyección está aproximadamente debajo del rinoforo, a medio camino entre el rinoforo y el pie, y la aguja debe entrar oblicuamente, apuntando en la dirección de las mandíbulas.
3. Después de 10 minutos, intente insertar suavemente un alfiler en la branquia y el rinoforo, verificando que estos no se retraigan, para asegurar la anestesia suficiente.
4. Asegúrese de que los labios y la mandíbula de la estén relajados para que el odontóforo pueda ser expuesto.
   NOTA: La arruga en los labios de la Figura 2A indica que los labios y la mandíbula del animal no están lo suficientemente relajados para que el procedimiento quirúrgico se realice sin daño. Los labios suaves y relajados de la Figura 2B indican que las mandíbulas están completamente relajadas.

Figura 2: Tensión y relajación en bocas de ablysia anestesiada. (A) Aplysia mostrando un alto grado de tensión muscular alrededor de los labios. Esto se correlaciona con la tensión de la mandíbula y contraindica proceder con la cirugía. (B) Aplysia con labios relajados, mostrando el interior de las mandíbulas (gris claro). Los colores corresponden de nuevo a los observados en el animal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Si los labios de un animal no están relajados, inyectar 30 ml adicionales de cloruro de magnesio y esperar otros 5 minutos. Si esto no resulta en relajación de los labios, devuélvalos a un recipiente aislado con buen flujo de agua para permitirles recuperarse (ver paso 4) y proceder con un animal diferente.

2. Exponer la superficie radular

1. Coloque la de modo que la cabeza cuelgue hacia abajo, permitiendo que la masa bucal se asiente contra las mandíbulas.
2. Aplique presión con el pulgar y el dedo índice para empujar la masa bucal hacia las mandíbulas, sosteniendo la masa bucal en su lugar.
3. Gire las mandíbulas para que sean visibles. Al mismo tiempo, mantenga la presión sobre la masa bucal para que la proa de la masa bucal sea visible a través de las mandíbulas. (Figura 3).

Figura 3: Apoyo a la masa bucal contra el interior de las mandíbulas. Los dedos sostienen la masa bucal que se ha empujado hacia arriba contra el borde interior de las mandíbulas hasta que se puede ver la punta de la proa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Trabaje suavemente las puntas de los fórceps contundentes en la hendidura del odontoforo y utilícelas para apalancar la superficie radular a través de las mandíbulas. Si las mandíbulas no están lo suficientemente relajadas, utilice los fórceps para agarrar suavemente el borde de la hendidura para ayudar a este proceso.
   PRECAUCION: Esta presión corre el riesgo de dañar al animal.
5. Una vez expuesta la superficie, trabaje las mandíbulas despejadas de la parte anterior de la superficie radular alrededor del perímetro. Esto hace que el odontoforo sea menos propenso a retraerse (Figura4). Asegúrese de que no más de la mitad de las paredes del odontóforo estén expuestas.

Figura 4: Eversión parcial del odontoforo. La superficie radular está completamente expuesta, pero los lados del odontóforo no están descubiertos, por lo que esto es sólo una eversión parcial. Es probable que una mayor eversión dañe al animal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

NOTA: Una eversión total del odontoforo causará un daño muscular importante del cual los animales son muy lentos para recuperarse.

3. Incisiones quirúrgicas

1. Una vez que la superficie radular esté completamente expuesta, coloque la bajo un endoscopio de disección para la cirugía.
   1. Alternativamente, utilice una banda ancha de goma y una tercera mano para estabilizar las mandíbulas y la superficie radular para la cirugía, especialmente mientras aprende. Esto, sin embargo, añade tiempo y mayor daño tisular al procedimiento, lo que lo hace menos ideal a largo plazo.
2. Coloque la superficie radular de modo que el lado hendido se dirija hacia el investigador.
3. Sujete suavemente la superficie radular, cerca de la base radular, de modo que se forme un pliegue horizontal perpendicular al pliegue anatómico. Utilice tijeras finas para cortar a través de este pliegue, haciendo una incisión a lo largo del pliegue anatómico (Figura5).

Figura 5: Ubicación de la incisión a la superficie radular. (A) Superficie radular, con una incisión. (B) Superficie radular con círculos que muestran dónde se unen las hebras del músculo bilateral I7; líneas punteadas muestran la ubicación de los músculos descendentes debajo de la superficie radular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Extender esta incisión inicial a 3-5 cm para permitir el acceso al interior de la masa bucal.
5. Ajuste la luz para que apunte directamente a través de esta incisión.
6. Separe los bordes de la incisión para que la parte posterior del lumen del odontoforo y las hebras verticales delgadas del músculo I7 sean visibles. (Figura 6)

Figura 6: Ubicación de I7 a través de la Incisión de Superficie Radular. Mirando a través de la incisión, ambas hebras de I7 se pueden ver entre las superficies internas de I4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

7. Llegar a través de la incisión, agarrar ambas hebras de I7, y tirar de ellos hacia arriba a través de la incisión, donde tanto como el músculo se puede cortar como sea práctico (Figura 7).

Figura 7: Tirar de la hebra muscular I7 a través de la incisión. El músculo I7 es altamente elástico y se puede tirar a través de la incisión para la extracción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

NOTA: Con la práctica, por lo general es más eficaz localizar I7 por la sensación que por la vista.

4. Atención postoperatoria

1. Después de que se hayan realizado lesiones, agarre los tentáculos anteriores y empuje hacia abajo en la superficie radular para devolver la a su configuración original.
2. Colocar animales postquirúrgicos en un ambiente protegido con un buen flujo de agua. El aumento de la oxigenación acelera la recuperación. Asegúrese de que los animales estén alerta y receptivos el día después de la cirugía. Si este no es el caso, se puede suponer que no se recuperarán.
   NOTA: Los animales generalmente comenzarán a alimentarse el primer o segundo día después de la cirugía. Incluso a los animales que están teniendo problemas para morder se les deben ofrecer algas marinas, ya que es nuestra observación anecdótica que la recuperación de un animal se ve mejorada por sus intentos de comer.

5. Para lesiones de fibra subrradular

1. Siga los pasos del 1.1 al 3.5
2. Inserte la punta de una pequeña cuchilla recta del bisturí (#11 o similar) a través de la incisión con el borde afilado en ángulo hacia arriba. Raspar suavemente las finas fibras musculares de la parte inferior de la superficie radular. (Figura 8).

Figura 8: Lesiones de las fibras subradulares. El borde de la hoja del bisturí está inclinado hacia arriba a través de la incisión hasta la parte inferior de la superficie radular para que pueda raspar suavemente las fibras subraretiares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Vuelva al paso 4.1.

Resultados

Trabajo anterior había sugerido que el músculo I7 contribuyó a la apertura de la pinza⁸. Nuestros propios estudios anatómicos sugirieron que las fibras subrareulares también podrían contribuir a la apertura de la captación. Para probar estas hipótesis, los animales fueron inducidos a generar mordeduras antes y después de recibir un procedimiento quirúrgico. Los animales de Sham fueron sometidos a todos los pasos quirúrgicos, incluyendo la incisión en la superficie radular, pero no se extirparon los músculos internos. A los animales sometidos a una lesión I7 se les extirparon ambos músculos I7. A los animales sometidos a una lesión de fibra subrradular se les ha quitado el 25 % de las fibras subraretiares inmediatamente debajo de la incisión. Las lesiones de sham no tuvieron ningún efecto significativo en el ancho de la abertura en el pico de morder, mientras que las lesiones de fibras I7 y subrradulares redujeron significativamente el ancho de la mordida (Figura9).

Figura 9: Resultados de las lesiones en la anchura de apertura durante el pico de morder. Los datos mostrados son las diferencias entre la anchura de apertura normalizada media de la rádula antes y después del procedimiento quirúrgico para 5 animales en cada uno de los 3 grupos (sham, i7 lesion, o lesión SRF), con cada animal sirviendo como su propio control. Los promedios se tomaron de 5 mordeduras antes, y 5 mordeduras después del procedimiento quirúrgico para determinar la diferencia media normalizada. La anchura de apertura era la distancia desde el centro de la rádula hasta el borde radular en el pico de protracción, normalizada por la distancia desde la superficie interna de la base radular hasta los bordes del lado hendido de la superficie radular. Las diferencias se muestran como las medias más o menos la desviación estándar. Después de establecer que los datos de diferencia se distribuyeron normalmente, se determinó la probabilidad de que la lesión no tuviera ningún efecto (es decir, se probó la hipótesis nula de que los efectos de los procedimientos quirúrgicos serían cero, en promedio) aplicando un t a cada grupo independiente. Los datos demuestran que la lesión falsa no tuvo ningún efecto significativo, mientras que una lesión de los músculos I7 o una lesión de las fibras subrareles tuvo un efecto significativo en la abertura radular (p < 0.031 para el grupo de lesiones I7, indicado con un solo asterisco , o p < 0,002 para el grupo de lesiones SRF, indicado por un asterisco doble). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Peso corporal	Dosis de cloruro de magnesio
<200 g	1/2 peso corporal
200-350 g	1/3 peso corporal
350-450 g	1/4 de peso corporal

Tabla 1: Dosis de cloruro de magnesio por peso corporal.

Discusión

Los pasos más críticos dentro del protocolo son la necesidad de asegurar que el animal esté completamente anestesiado, y que la eversión de la masa bucal sea suficiente para acceder a los músculos subyacentes. Puede requerir cierta práctica para perfeccionar estos pasos, pero una vez que se dominan, el rendimiento de las cirugías es probable que sea mayor que el 85% de todos los experimentos realizados. La forma más importante de modificar y solucionar problemas del protocolo es pasar tiempo haciendo disecciones de la masa bucal para que las ubicaciones de los músculos internos sean completamente claras para el investigador. Debido a que la incisión sugerida a través de la superficie radular inevitablemente causa algún daño a las fibras subrareles subyacentes, puede ser apropiado modificar la ubicación exacta de la incisión para evitar regiones específicas de estas fibras.

Una limitación de la técnica quirúrgica es que puede tener efectos no específicos en las respuestas de alimentación, como la fuerza de la protracción. Una manera de superar esta limitación es que los animales sirvan como sus propios controles. Además, es fundamental tener un grupo de lesiones falsas que se someta a todo el protocolo quirúrgico, excepto para la eliminación del músculo específico (es decir, I7 o los SRF). Siguiendo estas sugerencias, un investigador reducirá los efectos de la variabilidad entre los animales y tendrá una medida intrínseca de los efectos no específicos de la cirugía.

El trabajo anterior ha utilizado enfoques a través de la pared del cuerpo para lesionar o registrar ya sea desde los nervios^13,14,o músculos^15,16,17. En nuestro laboratorio, hemos observado anecdóticamente que las incisiones de la pared del cuerpo a menudo van acompañadas de una pérdida significativa de hemolinfa y por lo tanto del volumen corporal. Los animales a menudo requieren varios días para recuperarse de esto, y si la lesión de la pared del cuerpo no se sutura cuidadosamente, los animales pueden no recuperarse. Además, el examen post mortem de los animales revela cicatrices considerables alrededor de la incisión y una fuerte respuesta inmune (observaciones anecdóticas). Por el contrario, los animales no muestran pérdida de hemolinfa ni cambio en el volumen corporal después de la recuperación del protocolo descrito aquí (basado en observaciones en 96 animales).

Las aplicaciones futuras de la técnica pueden extenderla a otros músculos dentro del aparato de alimentación de Aplysia, y a otros animales. Nos hemos centrado en la eliminación del músculo I7 y las fibras subrradulares. Estas mismas técnicas quirúrgicas generales también permiten el acceso a la mayoría de los otros músculos del odontoforo. Algunos de estos, como la parte interna del músculo I5, se acceden mejor a través de la superficie radular. Otros, como los foliolos internos de I4, pueden ser mejor alcanzados a través del epitelio exterior del odontoforo. Hemos realizado ensayos preliminares donde una incisión bajo la hendidura radular del odontóforo parcialmente evertado permitió el acceso para que se insertara un gancho afilado que luego podría ser utilizado para lesionar otro músculo dentro del odontoforo, músculo I8⁸. Debido a que el protocolo quirúrgico descrito aquí no abre la cavidad principal del cuerpo, no se requiere sutura.

El protocolo que hemos descrito puede ser de interés general para otros investigadores que trabajan en estructuras de tejidos blandos que de otro modo serían difíciles de manipular, por ejemplo, el aparato de alimentación de otros moluscos. En términos más generales, este protocolo podría sugerir otros enfoques quirúrgicos novedosos para el análisis de estructuras blandas como lenguas, troncos o tentáculos^18.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blunt forceps	Fine Science Tools	11210-10	2 pair
Scalpel blade (#11)	Fine Science Tools	10011-00
Spring scissors	Fine Science Tools	15024-10
Webcam	Logitech	c920	for recording data