Método de electroporación para la entrega in Vivo de ADN plásmido en el telencéfalo adulto de pez cebra

Resumen

Aquí se presenta un método de electroporación para la entrega de ADN plásmido y el etiquetado de células ependimarinas en el telencéfalo adulto de pez cebra. Este protocolo es un método rápido y eficiente para visualizar y rastrear células ependymoglial individuales y abre nuevas posibilidades para aplicar la electroporación a una amplia gama de manipulaciones genéticas.

Resumen

La electroporación es un método de transfección en el que se aplica un campo eléctrico a las células para crear poros temporales en una membrana celular y aumentar su permeabilidad, permitiendo así introducir diferentes moléculas en la célula. En este artículo, la electroporación se utiliza para introducir plásmidos a las células ependigliales, que recubren la zona ventricular del telencéfalo adulto del pez cebra. Una fracción de estas células muestra propiedades de células madre y genera nuevas neuronas en el cerebro del pez cebra; por lo tanto, estudiar su comportamiento es esencial para determinar sus funciones en la neurogénesis y la regeneración. La introducción de plásmidos a través de la electroporación permite el etiquetado y seguimiento a largo plazo de una sola célula ependymoglial. Además, los plásmidos como Cre recombinase o Cas9 pueden ser entregados a células ependymoglial únicas, lo que permite la recombinación genética o la edición genética y proporciona una oportunidad única para evaluar la función génica autónoma de la célula en un control natural Ambiente. Por último, este protocolo de electroporación detallado paso a paso se utiliza para obtener una introducción exitosa de plásmidos en un gran número de células ependimarinas individuales.

Introducción

Zebrafish son excelentes modelos animales para examinar la regeneración cerebral después de una lesión en la herida de puñalada. En comparación con los mamíferos, en la escala evolutiva, las especies menos evolucionadas como el pez cebra generalmente muestran tasas más altas de neurogénesis constitutiva y áreas más amplias de residencia de células madre neurales adultas, lo que conduce a la generación constante de nuevas neuronas a lo largo de la mayoría de las áreas cerebrales en la vida adulta. Esta característica parece correlacionarse con una capacidad regenerativa significativamente mayor del pez cebra en comparación con los mamíferos¹, ya que los peces cebra tienen un potencial notable para generar eficientemente nuevas neuronas en la mayoría de los modelos de lesiones cerebrales estudiados^{2, 3,4,5,6,7,8}. Aquí se estudia el telencéfalo de pez cebra, ya que es un área cerebral con neurogénesis prominente en la edad adulta. Estas zonas de neurogénesis adulta son homoólogas a zonas neurogénicas en el cerebro adulto de^{mamíferos9,10,11}.

Abundantes áreas neurogénicas en el telencéfalo de pez cebra están presentes debido a la existencia de glia radial como células o células de ependymoglia. Las células ependymoglial actúan como células madre neurales adultas residentes y son responsables de la generación de nuevas neuronas en el cerebro intacto y regenerador^3,5. Los experimentos de rastreo de linaje han demostrado que la ependymoglia ventricular reacciona a la lesión, luego proliferan y generan nuevos neuroblastos que migran al sitio de la lesión^5. Debido a la naturaleza evertida del telencéfalo de pez cebra, las células epentimoglial eslacionan la superficie ventricular y construyen la pared ventricular ventral. La pared ventricular dorsal está formada por una capa de células ependitas dorsales(Figura 1A). Es importante destacar que la epentioglia del pez cebra encarna las características tanto de la glia radial de mamíferos como de las células epentimales. Los procesos radiales largos son una característica típica de las células glia radiales, mientras que las extensiones celulares y las uniones estrechas (así como sus posiciones ventriculares) son características típicas de las células epentimales^12,13,14. Por lo tanto, estas células se conocen como células epenymoglial.

Para seguir el comportamiento in vivo de células ependymoglial individuales durante la regeneración, deben etiquetarse de forma fiable. Se han descrito previamente varios métodos de etiquetado de células in vivo para microscopía fluorescente, como reporteros endógenos o colorantes lipofílicos^15. Estos métodos, a diferencia de la electroporación, pueden requerir períodos de tiempo más largos y a menudo no ofrecen la posibilidad de etiquetado de una sola célula o rastreo permanente a largo plazo. La electroporación, sin embargo (además del etiquetado de una sola célula), ofrece la posibilidad de introducir nuevo ADN en la célula huésped. Además, en comparación con otros métodos de transferencia de ADN a las células, se ha demostrado que la electroporación es uno de los métodos más eficientes^16,17,18,19.

Aquí se presenta un protocolo de electroporación que se ha refinado con el fin de etiquetar células ependymoglial únicas en el telencéfalo adulto de pez cebra. Este protocolo permite el etiquetado de células epentimogliales individuales con el fin de seguirlas a largo plazo²⁰ o manipular vías específicas de manera autónoma celular^21,22.

Protocolo

Todos los animales utilizados en este protocolo se mantuvieron en condiciones estándar de cría, y los experimentos se han realizado de acuerdo con las directrices y reglamentos de manipulación de la UE y el Gobierno de Alta Baviera (AZ 55.2-1-54-2532-0916).

1. Preparación de la mezcla de plásmido para la electroporación

1. Diluir el plásmido de interés en agua estéril y añadir solución de tinción verde rápida [1 mg/ml]. Asegúrese de que la concentración final del plásmido es de 1 g/L. Añadir la mancha a una concentración no superior al 3%, ya que su único propósito es colorear la solución y visualizar la inyección ventricular.
2. Una vez preparada, mezcle la solución de plásmido pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces o tocando con los dedos. Conservar a temperatura ambiente (RT) hasta su uso.
   NOTA: Para la coelectroporación de dos plásmidos en la misma célula, asegúrese de que la concentración de cada plásmido individual utilizado en la mezcla sea de al menos 0,8 ng/L con una relación molar de 1:1 para obtener una eficiencia de coelectroporación del 80%-90%.

2. Preparativos para el procedimiento de inyección y electroporación

1. Preparar los capilares de vidrio (diámetro exterior 1 mm, diámetro interior 0,58 mm) necesarios para la inyección en el aparato de tracción de agujas.
2. Para inyectar la cantidad correcta de plásmido (ver arriba), tire del capilar a una temperatura de 68,5 oC con dos pesos ligeros y dos pesados (ver Tabla de Materiales para las especificaciones del tirador).
   NOTA: En caso de que se utilice un tirador diferente, calibrar el capilar para entregar el volumen adecuado de mezcla de electroporación.
3. Ajuste manualmente el dispositivo de inyección a una presión de inyección de 200 hPa (girando la perilla Pi) y presión constante de 0 hPa. Ajuste manualmente el tiempo de inyección al modo manual y controle la presión con el pedal.
4. Ajuste el dispositivo de electroporación a "modo LV" con cinco pulsos a 54–57 V (25 ms cada uno con intervalos de 1 s). Conecte los electrodos al dispositivo.
5. Preparar una pecera con agua de pescado limpia, donde el pescado se despertará de la anestesia después del procedimiento de electroporación. Airear el agua manteniendo la piedra de aire unida a la bomba de aire durante todo el período de recuperación hasta que el pez se despierte por completo.
6. Tome una esponja de cocina regular y haga un corte longitudinal en la esponja para sujetar el pescado durante el procedimiento de inyección y electroporación (ver publicación anterior³).
   NOTA: La esponja de cocina debe lavarse o intercambiarse regularmente para eliminar posibles sustancias químicas tóxicas.
7. Coloque una pequeña cantidad de gel de ultrasonido multiusos altamente conductivo junto a la configuración de inyección y electroporación.
   NOTA: Esto garantizará una conductividad eléctrica adecuada y, en consecuencia, la distribución de células electroporadas a lo largo de todo el telencéfalo.

3. Anestesia de pez cebra

1. Antes de la anestesia, prepare una solución de siembra de anestesia con 0.2% MS222 en agua destilada y ajuste el pH a 7 con tampón Tris-HCl. Diluir esta población 1:10 (es decir, a 0,02% MS222) utilizando agua de pescado.
2. Anestesiar a los peces manteniéndolos en esta solución de trabajo hasta que el movimiento del cuerpo y las branquias disminuya (normalmente durante un par de minutos).

4. Inyección de solución de plásmido

1. Llene el capilar de vidrio preparado con 10 ml de solución de plásmido utilizando puntas de microcargador. Evitar la formación de burbujas de aire dentro del capilar.
2. Pulse Menú/Cambiar capilar en el dispositivo de inyección. Inserte y fije la aguja en el soporte de la aguja.
3. Bajo un estereomicroscopio con un aumento de 3.2x o 4x, corte sólo la punta del capilar usando fórceps finos. Cambie el dispositivo de inyección del modo Cambiar capilar al modo Inyección y, a continuación, aplique presión con un pedal para asegurarse de que la solución de plásmido se está quedando sin problemas y sin obstáculos.
4. Transfiera el pescado del tanque de cría al recipiente (caja de plástico) con solución anestésica. Espere unos minutos hasta que disminuya el movimiento de las branquias.
5. Coloque el pescado en la esponja premojada con el lado dorsal hacia arriba. Realice todos los siguientes pasos de inyección bajo el estereomicroscopio para garantizar la precisión del procedimiento.
6. Usando una microcuchilla dissección de acero inoxidable con filo de 40 mm y 0,5 mm de espesor, cree un pequeño agujero en el cráneo del pez en el lado posterior del telencéfalo(Figura 1B),justo al lado de la frontera con tectum óptico.
   NOTA: Este paso debe realizarse cuidadosamente ya que el agujero debe ser muy pequeño y superficial, penetrando únicamente el cráneo, para evitar daños cerebrales.
7. Incline el pez según sea necesario y oriente la punta del capilar de vidrio hacia el cráneo en el ángulo correcto para facilitar la penetración de la punta capilar a través del agujero.
8. Inserte la punta del capilar a través del orificio en el cráneo cuidadosamente hasta que llegue al ventrículo telencéfalo (ver Figura 1B). Esto requerirá penetración a través de la capa celular epentimal dorsal. Tenga especial cuidado de no insertar el capilar demasiado profundamente para evitar el contacto con el tejido cerebral. Mantenga el capilar precisamente entre los hemisferios, permaneciendo dentro del ventrículo justo después de perforar la capa épica dorsal.
   NOTA: Este es un paso muy delicado. La precisión de este procedimiento se mejora utilizando líneas mutantes de pigmentación como brassy^24,permitiendo una mejor visualización de la posición capilar de vidrio durante la inyección.
9. Con la punta capilar dentro del ventrículo, inyectar la solución plásmido aplicando presión con el pedal durante unos 10 s, que corresponde a aproximadamente 1 l de solución de plásmido.
   NOTA: Si cambia el tirador de la aguja, los capilares o el inyector, el sistema debe calibrarse para administrar siempre 1 l de solución de plásmido. La calibración se puede realizar midiendo el diámetro de la gota de plásmido expulsada en un aceite mineral (por ejemplo, aceite de parafina) y posteriormente calculando el volumen de la gota. Después de 10 s de inyección, debe haber 1 l de líquido plásmido expulsado en el aceite mineral.
10. Confirme el éxito del paso anterior observando la propagación del líquido por todo el ventrículo.

5. Electroporación

1. Retire el pescado de la configuración de la inyección mientras lo mantiene en la esponja.
2. Sumerja el lado interno de la punta de los electrodos en el gel de ultrasonido.
3. Cubra el telencéfalo de pescado con una pequeña cantidad de gel de ultrasonido.
4. Coloque la cabeza del pez entre los electrodos, colocando el electrodo positivo en el lado ventral de la cabeza del pez y el electrodo negativo en el lado dorsal(Figura 1C),mientras mantiene el cuerpo del pez en la esponja. Esto establece la dirección del flujo de la corriente necesaria para electroporato ependymoglia situado en la zona subventricular.
5. Presione los electrodos suavemente y con precisión contra el telencéfalo(Figura 1C). Administre la corriente con el pedal. Mantenga los electrodos en su lugar hasta que los cinco pulsos estén terminados.

6. Recuperación de peces

1. Deje que los peces se recuperen en el tanque previamente preparado y aireado continuamente hasta que despierte. Gel de lidocaína se puede aplicar en el cráneo con el fin de aliviar cualquier dolor posiblemente desarrollado.

Resultados

El método de electroporación descrito permite la entrega de ADN plásmido en células ependymoglial, que se encuentran superficialmente en el telencéfalo de pez cebra y justo debajo de la capa de células epentimales dorsales(Figura 1A).

Si el resultado de la electroporación es positivo, se pueden observar células ependymoglial (células rojas en la Figura 2A,B)entre otras cél...

Discusión

Este protocolo de electroporación es un método in vivo fiable de etiquetado de células epentimoglial individuales. El protocolo puede necesitar una adaptación adicional para etiquetar otros tipos de células como neuronas u oligodendrocitos. Para lograr un etiquetado exitoso, se pueden utilizar plásmidos que contengan diferentes promotores. Promotor de actina de pollo-beta, eF1alpha, CMV y promotor de ubiquitina se han utilizado previamente para impulsar la expresión de diferentes transgenes en ependymoglia y su pr...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258-25G	For coloring plasmid solution
MS222	Sigma-Aldrich	A5040-25G	MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light
Ultrasound gel	SignaGel, Parker laboratories INC.	15-60	Electrode Gel
Equipment
Air pump	TetraTec APS 50, 10l-60l		Can be bought in the pet shops
BTX Tweezertrodes Electrodes	Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus	45-0486	1 mm diameter
Electroporation device	BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus	45-0662
Injection device	FemtoJet 4i, Eppendorf	5252000013
Standard Wall Borosillicate Glass Capillary	Warner Instruments	64-0766	Model No: G100-4
Microloader tips	Eppendorf	5242956003
Micro-knife	Fine Science Tools	10056-12
Joystick micromanipulator	Narishige Japan	MN - 151
Needle holder	FemtoJet 4i, Eppendorf	5252000013	Needle holder comes together with the injection device
Needle pulling device	Narishige Japan	Model No: PC-10	The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100
Petri dishes	Greiner Bio-One International	633161