JoVE Logo
Autores
Contáctenos

Iniciar sesión

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí, demostramos cómo configurar un antímetro de voltios barato con frecuencia de salida programable que se puede utilizar con electrodos de palillo disponibles comercialmente para mediciones de resistencia eléctrica transepitelial/endotelial.

Resumen

La resistencia eléctrica transepitelial/endotelial (TEER) se ha utilizado desde la década de 1980 para determinar la confluencia y permeabilidad de los sistemas de modelos de barrera in vitro. En la mayoría de los casos, los electrodos de palillo se utilizan para determinar la impedancia eléctrica entre el compartimento superior e inferior de un sistema de inserción de filtro de cultivo celular que contiene monocapas celulares. La membrana del filtro permite que las células se adhieran, polaricen e interactúen mediante la construcción de uniones estrechas. Esta técnica se ha descrito con una variedad de diferentes líneas celulares (por ejemplo, células de la barrera hematoencefálica, barrera del líquido hematoencefálico, o tracto gastrointestinal y pulmonar). Los dispositivos de medición TEER se pueden obtener fácilmente de diferentes proveedores de equipos de laboratorio. Sin embargo, hay soluciones más rentables y personalizables imaginables si un voltímetro adecuado se autoensambla. El objetivo general de esta publicación es configurar un dispositivo fiable con frecuencia de salida programable que se pueda utilizar con electrodos de palillo disponibles comercialmente para la medición TEER.

Introducción

Las células epiteliales y endoteliales funcionan como límites celulares, separando los lados apical y basolateral del cuerpo. Si están conectados a través de uniones estrechas, la difusión pasiva de sustancias a través de los espacios paracelulares está restringida1,lo que resulta en la formación de una barrera selectivamente permeable. Se han desarrolladovarios sistemas de barrera artificial 2 utilizando células endoteliales microvasculares (HBMEC, barrera hematoencefálica3,4,5,6,7), plexo coroideo células epiteliales (HIBCPP/PCPEC, barrera de líquido cefalorraquídeo8,9,10,11,12,13,14), Células de adenocarcinoma colorrectal (Caco-2, modelos gastrointestinales15),o líneas de células de las vías respiratorias/alveolares (modelos pulmonares16,17). Estos sistemas suelen consistir en células cultivadas en monocapa sobre membranas permeables (es decir, sistemas de inserción de filtros) para permitir el acceso a los lados apical y basolateral. Es importante que la integridad del sistema modelo coincida con las condiciones in vivo. Por lo tanto, se han desarrollado varias técnicas para analizar la función de barrera midiendo la difusión paracelular de compuestos trazadores a través de la capa celular. Estas sustancias incluyen sacarosa radioetiquetada, albúmina con etiqueta de tinte, inulina etiquetada por FITC o dextrans2con etiqueta de tinte. Sin embargo, los dedos químicos pueden hacer que las células sean inutilizables para más experimentos. Para monitorizar los sistemas de barrera de forma no invasiva, se puede utilizar la medición de la resistencia eléctrica transepitelial/transendotelial (TEER) a través de una monocapa celular2,18,19. Debido a que los sistemas de electrodos bipolares están influenciados por la impedancia de polarización de electrodos en la interfaz electrodo-electrolito, las mediciones tetrapolares se utilizan generalmente para superar esta limitación20. La técnica de subsistencia es una sensación de cuatro terminales (4T) que fue descrita por primera vez en 1861 por William Thomson (Lord Kelvin)21. En resumen, la corriente es inyectada por un par de electrodos portadores de corriente, mientras que un segundo par de electrodos de detección de voltaje se utiliza para medir la caída de tensión20. Hoy en día, los llamados electrodos de palillo consisten en un par de electrodos dobles, cada uno de los cuales contiene un pellet de plata/cloruro de plata para medir la tensión y un electrodo de plata para pasar corriente2. La impedancia eléctrica se mide entre el compartimento apical y el compartimento basolateral con la capa celular en el medio (Figura 1). Una señal de onda cuadrada a una frecuencia de típicamente 12,5 Hz se aplica en los electrodos exteriores y se mide la corriente alterna resultante (AC). Además, la caída potencial a través de la capa celular se mide por el segundo par de electrodos (interno). La impedancia eléctrica se calcula de acuerdo con la ley de Ohm. Los valores de TEER se normalizan multiplicando la impedancia y el área de la superficie de la capa celular y se expresan típicamente como á cm2.

Hay sistemas en los que las células y los electrodos están dispuestos de una manera más sofisticada, pero también se basan en el principio de medición 4T y se pueden utilizar con los mismos dispositivos de medición. Los sistemas EndOhm, por ejemplo, en los que se inserta el filtro, contienen una cámara y una tapa con un par de electrodos concéntricos con la misma estructura que el electrodo de palillo. La forma de los electrodos permite un flujo de densidad de corriente más uniforme a través de la membrana, reduciendo así la variación entre las lecturas. Aún más complejo (pero también más preciso) es una cámara Ussing, donde una capa celular separa dos cámaras llenas con la solución de Ringer22. La cámara en sí puede ser gaseado con oxígeno, CO2,o N2, y agitado o complementado con sustancias experimentales. A medida que se produce el transporte iónico a través de la capa celular, una diferencia potencial se puede medir mediante dos electrodos de detección de voltaje cerca del tejido. Esta tensión se cancela mediante dos electrodos portadores de corriente colocados junto a la capa de celda. La corriente medida dará entonces el transporte iónico neto y la resistencia transepitelial, que refleja la integridad de la barrera, se puede determinar22. La medición TEER también se puede aplicar en sistemas de cuerpo en un chip que representan los modelos de tejido barrera23,24. Estos sistemas imitan las condiciones in vivo de las células y a menudo consisten en varios tipos de células, apiladas una encima de la otra en capas.

El siguiente protocolo explica cómo configurar un voltímetro rentable y fiable con frecuencia de salida programable que no produce diferencias estadísticamente significativas en TEER en comparación con los sistemas de medición disponibles en el mercado.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

1. Montaje de un antímetro de voltios básico para la medición TEER

  1. Prepare un cargador USB estándar como la fuente de alimentación D.C. de 5 V, un cable de extensión USB, un microcontrolador que se utilizará como un generador de onda cuadrada programable, dos multímetros estándar que son capaces de medir la corriente alterna y el voltaje como cuadrado medio de la raíz ( True-RMS), cuatro cables con enchufes de plátano, un cable de extensión de teléfono con un conector hembra RJ14 que incluye seis pines con el interior de cuatro cableados (6P4C), dos cables cortos, un terminal de brillo, un prerresistencia de 120 k, casquillos de extremo de alambre y asas de soldadura. Las herramientas necesarias son un stripper de aislamiento, una herramienta de engarce y un soldador.
  2. En primer lugar, conecte la extensión USB a la placa del microcontrolador.
  3. Desmonte el aislamiento final de dos cables cortos. Soldar un lado por cable directamente a los pines 0 y 2 del microcontrolador o a las asas de soldadura, que a su vez se sujetan en los pines respectivos. Engarzar los otros extremos hasta las férulas del extremo del alambre y conéctelos a un terminal de brillo como se muestra en la Figura 1.
  4. Conecte los enchufes del plátano a los multímetros. Tira y engarza el otro extremo de cada uno de los cuatro cables.
  5. Cortar el cable de extensión del teléfono en dos piezas y desmontar y engarzar los conductores del lado que contiene el conector hembra. Compruebe la continuidad de los conductores y pasadores.
  6. El primer multímetro se utilizará para medir la corriente en aA (tenga en cuenta que el modo AC tiene que ser configurado explícitamente). Conéctelo en una serie con un prerresistencia de 120 ko a los pines cinco y seis del conector RJ14, correspondiente al par de electrodos exteriores del electrodo de palillo.
  7. Finalmente, conecte el segundo multímetro, que se utilizará para medir la caída de tensión transepitelial en mV, a través del terminal de brillo a los pines tres y cuatro del conector RJ14, correspondiente al par de electrodos internos del electrodo de palillo.
  8. Si lo desea, monte la instalación en un chasis.

2. Programación del microcontrolador

  1. Modifique el código fuente proporcionado (archivo de codificación suplementario 1) según sea necesario. En la forma dada, los pines 0 y 2 alternarán entre el suelo y +5 V con 40 ms de medio tiempo de oscilación. Por lo tanto, se generará una señal de onda cuadrada con una amplitud de 5 V y una frecuencia de aproximadamente 12,5 Hz. Los valores reales pueden diferir debido a la inexactitud del emisor de tiempo del microcontrolador.
  2. Conecte el microcontrolador a un ordenador de sobremesa a través de un puerto USB y cargue el código fuente con el software correspondiente25.

3. Registro de osciloscopios de tensión (opcional)

  1. Los pines de derivación de cinco y seis del conector RJ14 con una resistencia de prueba de 1 k y se conectan a un osciloscopio.
  2. Compruebe la frecuencia, el voltaje máximo y la forma de onda. Digitalice y exporte los datos.
  3. Si lo desea, registre los oscilogramas desde un dispositivo de referencia (EVOM) y el voltímetro automontado para su comparación.
    NOTA: En este caso, los datos se registraron con un alcance de almacenamiento digital HM 208. Al ser un osciloscopio digital muy básico, la imagen podía digitalizarse internamente (congelada) pero tenía que ser trazada usando una grabadora analógica PM 8143 X-Y. La imagen fue escaneada posteriormente.

4. Cultivo celular y medición teRE

  1. Células de Pajoma del Plexo Humano de semillas (HIBCPP) en insertos de filtro de cultivo celular con un tamaño de poro de 3 m en DMEM/F12 (ver Tabla de Materiales)que contiene 10% de suero de becerro fetal9. Cultivar las células a 37 oC en una atmósfera saturada de agua que contenga 5% co2 como se describe en la cena y otros9.
  2. Cuando los filtros alcancen una impedancia de 70 cm2,cambie a DMEM/F12 sin suero y defina el punto de tiempo como Día 0.
  3. Conecte el electrodo al puerto RJ14 del voltímetro automontado y conecte la fuente de alimentación USB. Ajuste los multímetros al modo de voltaje de CA (mV) y al modo de corriente de CA (A), respectivamente.
    1. Alternativamente, conecte el electrodo a un dispositivo de referencia disponible comercialmente y enciéndalo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  4. Esterilice el electrodo en 80% de etanol durante 10 min y equilibre en el medio apropiado durante otros 10 minutos.
  5. Coloque el electrodo en ambos compartimentos de un sistema de inserción de filtro de cultivo celular (la parte más larga del electrodo en el compartimiento inferior y la parte más corta en el compartimento superior) que contenga una capa de celda HIBCPP hasta que los valores de medición permanezcan constantes.
  6. Para un dispositivo de referencia, anote la impedancia directamente o calcule la impedancia de acuerdo con la ley de Ohm (R - U / I) para el voltímetro automontado. Tenga en cuenta que el ángulo del electrodo afecta a las mediciones.
  7. Repita la medición TEER (pasos 3 a 6) desde el día 0 hasta el día 4.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Para comparar el funcionamiento de un voltímetro autoensamblado con su contraparte disponible comercialmente, se registró un oscilograma de voltaje de ambos dispositivos.

Como se muestra en la Figura 2A, el instrumento de referencia generó una señal de onda cuadrada con una amplitud de 80 mV y un tiempo de oscilación de 80 ms, que corresponde a una frecuencia de 12,5 Hz, cuando se opera en ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discusión

Antes de que un voltímetro hecho a sí mismo se pueda utilizar en una rutina diaria, es esencial comprobar el dispositivo para el correcto funcionamiento. En nuestro caso, se programó un medio tiempo de oscilación de 40 ms (12,5 Hz), pero el tiempo de oscilación efectivo resultó ser 60 ms (16,7 Hz). Esta imprecisión del emisor de tiempo del microcontrolador no tuvo ningún impacto detectable en las mediciones TEER. Podría ser mejor determinar la frecuencia real usando el ajuste de frecuencia de uno de los multíme...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Divulgaciones

Los autores no tienen intereses financieros en competencia u otros conflictos de intereses.

Agradecimientos

Los autores quieren agradecer a Herman Liggesmeyer y Marvin Bende por su asesoramiento experto en electrotecnia e informática.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
120 kOhm resistorGeneral (generic) equipment
Banana plug cablesGeneral (generic) equipment
CablesGeneral (generic) equipment
Chopstick electrodeMerck MillicellMERSSTX01
Chopstick electrode (alternative)WPI World Precision InstrumentsSTX2
Crimping toolGeneral tool
Digispark / ATtiny85AZ-Delivery Vertriebs GmbHDigispark Rev.3 Kickstarter
DMEM:F12Gibco (Thermo Fisher)31330038
Fetal calf serum (FCS)/Fetal Bovine Serum (FBS)Life Technologies10270106
Filter inserts 3µm translucentGreiner Bioone662631
HIBCPPHiroshi Ishikawa / Horst Schroten
Insulation stripperGeneral tool
Luster terminalGeneral (generic) equipment
OscilloscopeHAMEGDigital Storage Scope HM 208
PlotterPHILIPSPM 8143 X-Y recorder
Software Arduinohttps://www.arduino.ccArduino 1.8.9
Soldering ironGeneral tool
Soldering lugsGeneral (generic) equipment
Telephone cable with RJ14 (6P4C) connectorGeneral (generic) equipment
Test resistorMerck MillicellMERSSTX04
True-RMS multimetersVOLTCRAFTVC185
USB chargerGeneral (generic) equipment
USB extension cordGeneral (generic) equipment
Voltohmmeter for TEER measurementWPI World Precision InstrumentsEVOM
Voltohmmeter for TEER measurement (alternative)Merck MillicellERS
Wire end ferrulesGeneral (generic) equipment

Referencias

  1. Matter, K., Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods. 30, 228-234 (2003).
  2. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20, 107-126 (2015).
  3. Daniels, B. P., et al. Immortalized human cerebral microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of immune migration across the blood brain barrier. Journal of Neuroscience Methods. 212, 173-179 (2013).
  4. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 19, 1872-1874 (2005).
  5. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160(2014).
  6. Stins, M. F., Badger, J., Sik Kim, K. Bacterial invasion and transcytosis in transfected human brain microvascular endothelial cells. Microbial Pathogenesis. 30, 19-28 (2001).
  7. Muruganandam, A., Herx, L. M., Monette, R., Durkin, J. P., Stanimirovic, D. B. Development of immortalized human cerebromicrovascular endothelial cell line as an in vitro model of the human blood-brain barrier. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 11, 1187-1197 (1997).
  8. Ishiwata, I., et al. Establishment and characterization of a human malignant choroids plexus papilloma cell line (HIBCPP). Human Cell. 18, 67-72 (2005).
  9. Dinner, S., et al. A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side. Journal of Visualized Experiments. , (2016).
  10. Schwerk, C., et al. Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in a novel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. PLoS One. 7, e30069(2012).
  11. Tenenbaum, T., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cellular Microbiology. 11, 323-336 (2009).
  12. Gath, U., Hakvoort, A., Wegener, J., Decker, S., Galla, H. J. Porcine choroid plexus cells in culture: expression of polarized phenotype, maintenance of barrier properties and apical secretion of CSF-components. European Journal of Cell Biology. 74, 68-78 (1997).
  13. Haselbach, M., Wegener, J., Decker, S., Engelbertz, C., Galla, H. J. Porcine Choroid plexus epithelial cells in culture: regulation of barrier properties and transport processes. Microscopy Research and Technique. 52, 137-152 (2001).
  14. Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules. Molecular Pharmaceutics. 10, 1473-1491 (2013).
  15. Hilgendorf, C., et al. Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport. Journal of Pharmaceutical Sciences. 89, 63-75 (2000).
  16. Mathia, N. R., et al. Permeability characteristics of calu-3 human bronchial epithelial cells: in vitro-in vivo correlation to predict lung absorption in rats. Journal of Drug Targeting. 10, 31-40 (2002).
  17. Fuchs, S., et al. Differentiation of human alveolar epithelial cells in primary culture: morphological characterization and synthesis of caveolin-1 and surfactant protein-C. Cell and Tissue Research. 311, 31-45 (2003).
  18. Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current. The Journal of Cell Biology. 98, 1033-1041 (1984).
  19. Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).
  20. Yeste, J., et al. Geometric correction factor for transepithelial electrical resistance measurements in Transwell and microfluidic cell cultures. Journal of Physics D Applied Physics. 49 (37), 3754(2016).
  21. Northrup, E. VI: The Measurement of Low Resistance. Methods of Measuring Electrical Resistance. , McGraw-Hill. 100-131 (1912).
  22. Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. Journal of Cystic Fibrosis. 3 (Suppl 2), 123-126 (2004).
  23. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15, 145-150 (2013).
  24. Esch, M. B., et al. On chip porous polymer membranes for integration of gastrointestinal tract epithelium with microfluidic 'body-on-a-chip' devices. Biomedical Microdevices. 14, 895-906 (2012).
  25. Arduino IDE. Arduino Web Editor. , https://www.arduino.cc/en/Main/Software (2019).
  26. Benson, K., Cramer, S., Galla, H. J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 5(2013).
  27. Hufnagl, M. Time Resolved Transepithelial Impedance Spectroscopy Of Caco 2 Monolayers Relying on Lithographically Patterned Basolateral Electrode Cell Arrays. , University of Vienna. (2010).
  28. Guimerà, A., Gabriel, G., Parramon, D., Calderón, E., Villa, R. Portable 4 Wire Bioimpedance Meter with Bluetooth Link. World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering. International Federation of Medical and Biological Engineering Proceedings. Dössel, O., Schlegel, W. C. 25/7, Springer. Berlin, Heidelberg. (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reimpresiones y Permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos

Solicitar permiso

Explorar más artículos

Biolog aN mero 152Resistencia el ctrica transepitelialTEER4 terminales de sensaci nbarreravoltohmmetervoltammeter

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Contáctenos

RECOMIENDE A LA BIBLIOTECA

BOLETINES de JoVE

Investigación

Educación

Autores

Bibliotecarios

ACERCA DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados