Generación de un modelo de rata de insuficiencia hepática aguda mediante la combinación de 70% de hepatectomía parcial y paracetamol

Resumen

El modelo animal de insuficiencia hepática aguda desarrollado en el estudio actual presenta una alternativa factible para el estudio de posibles terapias. El modelo actual emplea el efecto combinado de la lesión hepática física y inducida por fármacos y proporciona un período de tiempo adecuado para estudiar el potencial de las nuevas terapias.

Resumen

La insuficiencia hepática aguda (ALF) es una condición clínica causada por varias etiologías que resulta en la pérdida de funciones metabólicas, bioquímicas, sintetizadoras y desintoxicantes del hígado. En la mayoría de los casos de daño hepático irreversible, el trasplante de hígado ortotrópico (OLT) sigue siendo el único tratamiento disponible. Para estudiar el potencial terapéutico de un tratamiento para la ALF, sus pruebas previas en un modelo animal de ALF son esenciales. En el estudio actual, se desarrolló un modelo de ALF en ratas combinando un 70% de hepatectomía parcial (PHx) e inyecciones de paracetamol (APAP) que proporciona una ventana terapéutica de 48 h. La mediana y los lóbulos laterales izquierdos del hígado fueron retirados para extirpar el 70% de la masa hepática y a APAP se le administró 24 h postquirúrgicamente durante 2 días. Se encontró que la supervivencia en animales inducidos por ELA disminuyó gravemente. El desarrollo de ALF fue confirmado por niveles séricos alterados de las enzimas alanina amino transferasa (ALT), aspartato amino transferasa (AST), fosfatasa alcalina (ALP); cambios en el tiempo de protrombina (PT); y evaluación de la relación internacional normalizada (INR). El estudio del perfil de expresión génica por qPCR reveló un aumento en los niveles de expresión de genes implicados en la apoptosis, inflamación y en la progresión de la lesión hepática. La evaluación histológica observó la degeneración difusa de hepatocitos y la infiltración de células inmunitarias. La reversibilidad de la ALF se confirmó mediante la restauración de la supervivencia y los niveles séricos de ALT, AST y ALP después del trasplante intraesplénico de hepatocitos de ratas sanas singénicas. Este modelo presenta una alternativa fiable a los modelos animales ALF disponibles para estudiar la fisiopatología de ALF, así como para evaluar el potencial de una novedosa terapia para ALF. El uso de dos enfoques diferentes también permite estudiar el efecto combinado de la lesión hepática física y no inducida por drogas. La reproducibilidad y viabilidad del procedimiento actual es una ventaja añadida del modelo.

Introducción

La insuficiencia hepática aguda (ALF) es definida por la Asociación Americana para el Estudio de Enfermedades Hepáticas como un rápido desarrollo de lesión hepática aguda sin ningún signo previo de daño y se caracteriza por un deterioro grave de las funciones sintéticas, metabólicas y desintoxicantes del hígado¹. LA ALF difiere de la insuficiencia hepática crónica cuando la insuficiencia se produce como resultado de una lesión hepática causada durante un largo período de tiempo y de insuficiencia hepática crónica aguda (ACLF), donde el daño hepático abrupto tiene lugar como resultado de enfermedades hepáticas crónicas^2,3,4. La única cura disponible para la ALF es el trasplante de hígado ortotópico (OLT), o puede ocurrir la muerte. Debido a la escasez de donantes hepáticos, la tasa de mortalidad en pacientes que sufren de ALF es muy alta.

Para estudiar el potencial de los enfoques terapéuticos alternativos y para entender mejor la fisiopatología de la ALF, se necesitan modelos animales que puedan reflejar la ALF que ocurre en los seres humanos. Muchos de los modelos animales ALF ya disponibles tienen varias deficiencias. Los efectos del paracetamol (APAP) son difíciles de reproducir, pero tienen las similitudes más cercanas en términos de parámetros temporales, clínicos, bioquímicos y patológicos. APAP- modelos animales inducidos con frecuencia encuentran problemas debido a la presencia de metahemoglobinemia causada por la oxidación de la hemoglobina por APAP y sus intermedios^5,6,7. Otro problema es la falta de reproducibilidad reflejada por respuestas de dosis impredecibles y el momento de la muerte. Los modelos animales ALF producidos con cloruro de tetra carbono (CCl₄) tienen una reproducibilidad deficiente^8,9,10,11. Los modelos animales ALF inducidos por Concavalina A (Con A) y lipoplysaccharide (LPS) no reflejan el patrón clínico de la enfermedad humana, aunque tienen ventajas en el estudio de los mecanismos celulares implicados en enfermedades hepáticas autoinmunes y en el estudio de la sepsis respectivamente^12,13,14,15. Del mismo modo, la tioacetamida (TAA) también requiere biotransformación a un metabolito activo sulfóxido de tioacetamida y muestra la variación de la especie^16,17,18,19. D-galactosamine (D-Gal) produce algunos cambios bioquímicos, metabólicos y fisiológicos similares a ALF pero no es capaz de reflejar toda la condición patológica de ALF^20,21,22,23. Ha habido muy pocos intentos de combinar dos o más de estos métodos para desarrollar un modelo de ALF que sea capaz de reflejar el síndrome de ALF de una mejor manera¹³. Por lo tanto, se requieren más estudios para desarrollar un modelo que pueda reflejar los parámetros de la enfermedad, tenga mejor reproducibilidad y proporcione suficiente tiempo para estudiar los efectos de una intervención terapéutica.

En el estudio actual, se ha creado un modelo alternativo de ALF en ratas combinando los efectos de la hepatectomía parcial (PHx) y dosis más bajas de un reactivo hepatotóxico. APAP tiene un papel bien establecido en la causa de lesiones hepáticas^5,24,25. Es un analgésico ampliamente utilizado y es tóxico para el hígado a dosis supraterapéuticas mediante la formación de metabolitos tóxicos. La APAP es la causa de muchas muertes en los países desarrollados. La lesión física causada por la hepatectomía parcial inicia la activación de varios procesos involucrados en la inflamación, así como la regeneración hepática. La inyección del agente hepatotóxico APAP causa un ambiente hostil en el hígado, evitando la proliferación de hepatocitos. Esto reduce el período de estrés en el animal, que cuando se combina con dosis más pequeñas de hepatotoxina, conduce a una mejor reproducibilidad del procedimiento. Por lo tanto, utilizando este modelo, se ha estudiado un efecto combinatorio de dos tipos de lesiones hepáticas. Para caracterizar el modelo animal desarrollado de ALF, se han estudiado parámetros fisiológicos y bioquímicos. La reversibilidad exitosa de la ALF se confirmó mediante el trasplante de hepatocitos de ratas sanas singénes.

Protocolo

El procedimiento descrito a continuación ha sido aprobado por el Comité Institucional de ética animal del Instituto Nacional de Inmunología, Nueva Delhi. El número de referencia de serie de la aprobación es IAEC-355/14.

1. Preparación

1. Prepárese para el procedimiento quirúrgico como se describió anteriormente por Das B et al.²⁶.
2. Utilice ratas Wistar endogámicas de 6 a 8 semanas de edad con un peso corporal de 200–250 g.
3. Alimentar a los animales en condiciones estándar de cuidado animal y alimentarlos con comida de rata y libitum antes y después del procedimiento.
4. Al realizar 70% PHx, utilice una mezcla de cóctel estándar de clorhidrato de ketamina (100 mg/kg de peso corporal) y xilazina (10 mg/kg de peso corporal), que se inyecta por vía intraperitoneal.
   NOTA: El tipo de anestésico utilizado puede tener efectos postoperatorios sobre la mortalidad y la morbilidad.
5. Durante el trasplante de células, utilice la anestesia inhalante Isoflurano (2-cloro-2-(difluorometoxi)-1,1,1-trifluoro-etano) para reducir el tiempo de recuperación del animal después de la cirugía de trasplante.
6. Inducir y mantener la anestesia inhalacional utilizando un sistema de anestesia personalizado. Mantenga el flujo de oxígeno a 4 L/min. Para el uso de inducción isoflurano al 4% y para el uso de mantenimiento 2–3% durante el procedimiento quirúrgico.

2. Procedimientos preoperatorios

1. Anestetizar la rata inyectando la mezcla de ketamina-xilazina descrita en el paso 3.1 por vía intraperitoneal. Confirme la anestesia completa pellizcando el dedo del dedo del la nariz del animal. Los procedimientos adicionales se llevan a cabo sólo cuando no hay reflejo del pedal.
2. Para prevenir la desecación corneal, aplique una gota ocular a base de metilcelulosa carboxial en ambos ojos.
3. Sujeta randelel el animal anestesiado a un tablero quirúrgico con cinta blanca. Coloque el animal con el lado abdominal hacia arriba, asegurándose de que la boca esté en el lado distal de la persona que realiza la operación.
4. Retire el vello de la zona quirúrgica abdominal superior derecha con una cortadora eléctrica.
5. Desinfectar el sitio quirúrgico mediante tres exfoliantes alternos de yodo de povidona y 70% de etanol utilizando almohadillas de algodón esterilizadas en movimiento circular.

3. Hepatectomía parcial (PHx) para extirpar el 70% de la masa del hígado

NOTA: Realice todo el procedimiento quirúrgico bajo un ambiente estéril en una campana de flujo laminar. Utilice únicamente instrumentos quirúrgicos estériles para minimizar el riesgo de infección postquirúrgica. La extirpación del 70% de la masa hepática, denominada 70% de hepatectomía parcial (70% PHx), se realizó según lo descrito por C. Mitchell y H. Willenbring, 2008²⁷.

1. Antes del inicio de la cirugía, confirme la anestesia completa del animal pellizcando su dedo del dedo del tiempo. Los procedimientos adicionales se llevan a cabo sólo cuando no hay reflejo del pedal.
2. Marque la piel que se va a cortar justo debajo del esternón, perpendicular al xifoide y paralela a la caja torácica.
3. Coloque una hoja de cortina estéril con una abertura de alrededor de 3 cm x 1 cm sobre la piel marcada.
4. Realice una incisión transversal de alrededor de 2-3 cm a lo largo de la línea marcada con un bisturí. Use la cuchilla quirúrgica No. 22. Retire suavemente la unión de la piel a la capa muscular subyacente en las proximidades de la zona incisa utilizando puntas de algodón humedecidas estériles.
5. A continuación, haga una incisión transversal a través de la capa peritoneal justo debajo del proceso de xifoide.
6. Con la ayuda de dos puntas de algodón humedecido salina, exponga el lóbulo izquierdo del hígado aplicando una presión suave sobre el tórax. Coloque una punta de algodón en la región diafragmática de la porción incisa y la otra punta de algodón debajo de la región incisa para levantar el lóbulo hepático.
7. Deslice un lazo de hilo de nylon estéril de 8-10 cm de largo (tamaño 4–0, 0.15 mm de diámetro) alrededor del lóbulo hepático expuesto. Lleve el lazo a la base del lóbulo cerca del hilum con la ayuda de fórceps microdissecting o cogollos de algodón humedecidos.
8. Con la ayuda del portaagujas de microcirugía y las microcótelas, ate los dos extremos del lazo, colocando el nudo lo más cerca posible de la base del lóbulo para restringir el vaso sanguíneo y reducir el sangrado después de retirar el lóbulo hepático. Ate dos nudos adicionales en el otro lado.
9. Tenga en cuenta no atar el nudo demasiado cerca de los vasos sanguíneos cercanos, lo que puede causar obstrucción venosa (estenosis).
10. Use tijeras de microcirugía para cortar el lóbulo atado justo por encima del nudo, que deja una masa de tejido decolorada llamada muñón isquémico en lugar del lóbulo.
    NOTA: El hígado de rata, al igual que los de los ratones, se divide en cuatro lóbulos distintos: el lóbulo medio, el lóbulo lateral derecho, el lóbulo lateral izquierdo y el lóbulo caudado, que representan alrededor del 40%, 20%, 30% y 7% de la masa hepática total, respectivamente. Cualquier combinación de estos lóbulos se puede eliminar para exprimir 70% masa hepática. En el estudio actual, se eliminaron el lóbulo mediano y los lóbulos laterales izquierdos.
11. Localice cuidadosamente el lóbulo mediano sin dañar el muñón restante del lóbulo lateral izquierdo. Tire suavemente de la cavidad abdominal, y en la base del lóbulo atar un hilo de nylon de 8-10 cm de largo (tamaño 4-0) nudo como se mencionó anteriormente. Ate dos nudos adicionales en el otro lado. Con cuidado, exiéntese y retire el lóbulo mediano atado tomando todas las precauciones mencionadas.
12. Después de retirar los lóbulos, sutura el peritoneo usando una sutura cromática absorbible 4-0 con puntadas continuas seguidas de sutura de piel con una sutura interrumpida.
13. Aplique yodo povidona en la piel que rodea las suturas para prevenir la infección.
14. Retire la hoja de cortina y retire el animal de la placa de cirugía.

4. Cuidado postoperatorio en animales

1. Inyecte por vía intraperitoneal al animal con una dosis de 12 mg de antibiótico cefotaxime en 1 ml de solución de glucosa al 5% con una jeringa de 1 ml para protegerlo del riesgo de infección postoperatoria.
2. Administrar una inyección subcutánea de meloxicam analgésico (1 mg/kg de peso corporal) para aliviar el dolor después de la cirugía y seguirlo por dos dosis más, manteniendo el régimen como una dosis por día.
3. Aloje los animales operados en condiciones estándar de ciclo claro/oscuro de 12 h y monitoree a intervalos regulares.

5. Inyección de drogas en animales parcialmente hepatizados para inducir insuficiencia hepática

1. Después de 24 h después de la cirugía, cuando los animales se han recuperado con éxito de 70% PHx, medir el peso corporal del animal seguido de las inyecciones.
2. Inyectar 750 mg/kg de peso corporal de APAP por vía intraperitoneal en animales parcialmente hepatizados 24 h después del 70% de PHx después de la recuperación exitosa de los animales del procedimiento quirúrgico. Repita la dosis de nuevo después de las 24 h.
   NOTA: Dos dosis de APAP se administran por vía intraperitoneal al animal (es decir, 24 h y 48 h después del procedimiento de 70% de PHx, respectivamente).
3. En cada momento después de la inyección de APAP, medir el peso corporal del animal en recuperación.
   NOTA: APAP (biocetamol) se inyecta en animales como una solución de 150 mg/ml en alcohol bencílico al 2%.

6. Trasplante de hepatocitos sanos en modelos animales ALF

NOTA: Para estudiar la reversibilidad de la ALF en ratas, trasplantar hepatocitos de ratas singénicos sanos por vía intrasílica en los animales inducidos por alF junto con la^1a dosis de APAP. En el estudio actual, para proporcionar tiempo suficiente a las células trasplantadas para el rastreo y el injerto, el trasplante se realizó justo después de dar la^1a dosis de APAP. Los hepatocitos de rata están aislados por un protocolo publicado por Berry and Friends et al.²⁸ y posteriormente adaptado en varios otros estudios^29,30,31 con algunas modificaciones. Para el trasplante intraesplénico de células en el modelo animal de ALF, siga los pasos mencionados a continuación.

1. Coloque la rata en una cámara de poli (metil metacrilato) para la inducción de la anestesia con 4% de isoflurano y 4 L/min de flujo de oxígeno para una rata de 250–350 g de peso corporal. Compruebe la profundidad de la anestesia por la falta de reflejos del pedal al pellizcar la dedo del dedo del dedo del la página del animal.
2. Coloque la rata anestesia en el tablero quirúrgico de tal forma que su parte lateral izquierda esté mirando hacia arriba. Mantenga la anestesia en 2–3% de inhalación de isoflurano a través de una boquilla adecuada.
3. Afeitar la piel en la región lateral izquierda y esterilizarla mediante solución de yodo povidona.
4. Haga una incisión transversal en la región aficioada de la piel.
5. Haga un corte de 1-2 cm en la capa peritoneal para exponer el bazo.
6. Saca suavemente el bazo de la cavidad peritoneal y levántalo con la ayuda de dos puntas de algodón humedecidas.
7. Mantenga las células (normalmente 10⁷ por animal) que se trasplantan suspendidas en medios de IMDM de 50 ml en una jeringa de insulina de 1 ml con una aguja de 29 G.
8. Perforar suavemente la aguja en la corteza del bazo y liberar la suspensión celular en el bazo dentro de 2-3 min.
9. Después de completar el trasplante de células, saque cuidadosamente la aguja y coloque el área de la punción de la aguja con una punta de algodón humedecida para evitar la fuga de la suspensión celular del sitio.
10. Cierre el peritoneo y la piel por una sutura absorbible de 4-0 con sutura continua y discontinua respectivamente.
11. Aplicar solución de yodo povidona en la piel en el lugar de las suturas para prevenir la infección en el sitio operado.
12. Inyectar por vía intraperitoneal 1 ml de volumen de 12 mg/ml de solución antibiótica (p. ej., cefotaxime) e inyectar por vía subcutánea analgésico (p. ej., meloxicam) 1 mg/kg de peso corporal al animal como parte del cuidado postoperatorio. Mueva al animal a una jaula de recuperación cálida.
13. Mantenga al animal operado aislado en condiciones normales de 12 h de ciclo claro/oscuro hasta que las heridas quirúrgicas estén completamente curadas. Esto puede tardar de 3 a 4 días.

7. Caracterización del desarrollo de ALF

1. Euantamar a los animales por sobredosis de la solución de ketamina-xilazina 2 h después de la^2a dosis de tratamiento APAP y recoger muestras de sangre y tejidos.
2. Recoger suero de la sangre para estudios bioquímicos³².
3. Procesar muestras de tejido hepático para estudios histológicos y de expresión génica^33,34,35.

Resultados

Porcentaje de supervivencia en modelos animales de ALF
La dosis óptima de APAP para causar ALF en combinación con 70% PHx se estandarizó como 750 mg/kg de peso corporal. El régimen de tratamiento comenzó 24 h después del 70% de PHx, cuando los animales se habían recuperado completamente de la cirugía, y consistía en dos dosis de APAP a intervalos de 24 h. Se observó mortalidad a una tasa del 80% después de la administración de la segunda dosis de APAP, 48 h después de la cirugía. El porc...

Discusión

El desarrollo de un modelo animal adecuado para la ALF es primordial para una mejor comprensión de la patogénesis y la progresión de la ALF. Un modelo animal ALF bien caracterizado también ofrece la oportunidad para el desarrollo y ensayo de nuevos enfoques terapéuticos contra ALF. Se han hecho muchos intentos para desarrollar un modelo clínicamente relevante de ALF^6,12,21,23,<...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetaminophen (Biocetamol)	EG Pharmaceuticals		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Alkaline Phosphatase Kit (DEA)	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Automated analyser	Tulip, Alto Santracruz, India	Screen Maaster 3000	Biochemical analyser for liver functional test
Betadine (Povidon-Iodine Solution)	Win-Medicare; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Biological safety cabinet (Class I)	Kartos international; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Bright Field Microscope	Olympus, Japan	LX51
Cefotaxime (Taxim®)	AlKem; India		cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement)
Cell Strainer	Sigma; US	CLS431752
Collagenase Type I	Gibco by Life Technologies	17100-017
Cotton Buds	Pure Swabs Pvt Ltd; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Drape Sheet	JSD Surgicals, Delhi, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
DPX Mountant	Sigma; US	6522
Eosin Y solution, alcoholic	Sigma; US	HT110132
Forceps	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Gas Anesthesia System	Ugo Basile; Italy	211000
Glucose	Himedia, India	GRM077
Hair removing cream (Veet®)	Reckitt Benckiser, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Hematoxylin Solution, Mayer's	Sigma; US	MHS16
Heparin sodium salt	Himedia; India	RM554
Hyaluronidase From Sheep Testes	Sigma; US	H6254
I.V. Cannula (Plusflon)	Mediplus, India	Ref 1732411420
Insulin Syringes	BD; US	REF 303060
Isoflurane (Forane®)	Asecia Queenborough	No B506	Inhalation Anaesthetic
Ketamine (Ketamax®)	Troikaa Pharmaceuticals Ltd.		Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement)
Meloxicam (Melonex®)	Intas Pharmaceuticals Ltd; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Micro needle holders straight & curved	Mercian; England	BS-13-8
Micro needle holders straight & curved	Mercian; England	BS-13-8
Microtome	Histo-Line Laboratories, Italy	MRS3500
Nylon Thread	Mighty; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Paraformaldehyde	Himedia; India	GRM 3660
Percoll®	GE Healthcare	17-0891-01
Refresh Tears/Eyemist Gel	Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India	P3060	No specific Catalog Number
RPMI	Himedia; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Scalpel	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Scissors	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
SGOT (ASAT) KIT	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
SGPT (ALAT) KIT	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Shandon Cryotome E Cryostat	Thermo Electron Corporation; US		No specific Catalog Number
Sucrose	Sigma; US	S0389
Surgical Blade No. 22	La Medcare, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Surgical Board	Locally made		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Surgical White Tape	3M India; India	1530-1	Micropore Surgical Tape
Sutures	Ethicon, Johnson & Johnson, India	NW 5047
Syringes (1ml, 26 G)	Dispo Van; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Trimmer (Clipper)	Philips	NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005
Weighing Machine	Braun		No specific Catalog Number (Local Procurement)
William's E Media	Himedia; India	AT125
Xylazine (Xylaxin®)	Indian Immunologicals Limited		Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant