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Resumen

Hemos expuesto un sistema microfisiológico (MPS) con organoides intestinales y hepáticos al paracetamol (APAP). Este artículo describe los métodos para la producción de organoides y las evaluaciones de propiedades farmacocinéticas y toxicológicas APAP en el MPS. También describe los análisis de funcionalidad tisular necesarios para validar los resultados.

Resumen

Se espera que los sistemas microfisiológicos (MPS) que cultivan organoides humanos recientemente introducidos funcionen mejor que los animales en la fase de pruebas preclínicas del proceso de desarrollo de fármacos porque son genéticamente humanos y recapitulan la interacción entre los tejidos. En este estudio, la barrera intestinal humana (emulada por un co-cultivo de células Caco-2 y HT-29) y el equivalente hepático (emulado por esferoides hechos de células HepaRG diferenciadas y células estelares hepáticas humanas) se integraron en un dispositivo microfluídico chip de dos órganos (2-OC) para evaluar algunas propiedades farmacocinéticas (PK) y toxicológicas de paracetamol (APAP). El MPS tenía tres conjuntos: Intestina sólo 2-OC, Hígado sólo 2-OC, e Intestino/Hígado 2-OC con el mismo medio perfundiendo ambos organoides. Para las evaluaciones PK, dosificamos el APAP en los medios en los puntos de tiempo preestablecidos después de administrarlo ya sea sobre la barrera intestinal (emulando la vía oral) o en el medio (emulando la vía intravenosa), a 12 m y 2 M respectivamente. Las muestras de medios se analizaron mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC) en fase inversa. Los organoides se analizaron para la expresión génica, para los valores TEER, para la expresión y la actividad de las proteínas, y luego se recogieron, fijaron y sometieron a un conjunto de evaluaciones morfológicas. La técnica de MTT tuvo un buen desempeño en la evaluación de la viabilidad organoides, pero los análisis de alto contenido (HCA) fueron capaces de detectar eventos tóxicos muy tempranos en respuesta al tratamiento APAP. Verificamos que el flujo de medios no afecta significativamente la absorción APAP mientras que mejora significativamente la funcionalidad equivalente del hígado. La absorción intestinal humana APAP y el metabolismo hepático podrían emularse en el MPS. La asociación entre los datos MPS y el modelado en silicio tiene un gran potencial para mejorar la previsibilidad de los métodos in vitro y proporcionar una mayor precisión que los modelos animales en estudios farmacocinéticos y toxicológicos.

Introducción

Debido a las diferencias genómicas y proteómicas, los modelos animales tienen un valor predictivo limitado para varios resultados humanos. Además, son lentos, caros y éticamente cuestionables1. MPS es una tecnología relativamente nueva que tiene como objetivo mejorar el poder predictivo y reducir los costos y el tiempo invertido con las pruebas preclínicas. Son dispositivos microfluídicos que cultivan organoides (unidades funcionales de órganos miméticos artificiales) bajo un flujo de medios que promueve la comunicación organoide-organoides. Los organoides hechos de células humanas aumentan larelevanciatraslacional 2,3,4. Se espera que el MPS funcione mejor que las pruebas en animales porque son genéticamente humanos y recapitulan la interacción entre los tejidos. Cuando es completamente funcional, el MPS proporcionará resultados más significativos, a mayor velocidad y menores costos y riesgos4. Muchos grupos están desarrollando MPS para varios propósitos, especialmente modelos de enfermedades para probar la eficacia de los medicamentos.

El nivel de exposición es uno de los parámetros más críticos para evaluar la eficacia y toxicidad de los medicamentos5,6,7,8,9,10,11,12. MPS permite la integración organoidea que emula la exposición sistémica y se espera que funcione mejor que el cultivo tradicional de tejido humano 2D. Esta tecnología puede mejorar significativamente la predicción de la absorción intestinal compuesta y el metabolismo hepático4.

Un MPS que integra el modelo humano equivalente del intestino y el hígado es un buen punto de partida, teniendo en cuenta el papel central de estos dos órganos en la biodisponibilidad de fármacos y la exposición sistémica13,14,15. APAP es un fármaco atractivo para el estudio de un MPS sin un equivalente renal porque su metabolización se realiza principalmente por el hígado16,17.

El 2-OC es un dispositivo microfluídico de dos cámaras adecuado para el cultivo de dos tejidos/organoides equivalentes humanos diferentes interconectados por microcanales16. Con el fin de emular una administración oral/intravenosa humana in vitro de un medicamento y evaluar los efectos de la conversación cruzada entre los equivalentes del intestino y del hígado en la farmacocinética APAP, además de la funcionalidad y viabilidad de los organoides, se realizaron tres conjuntos MPS diferentes: (1) un "Empentí 2-OC MPS" compuesto por un equivalente intestinal basado en un inserto de cultivo que contiene una cocultura de células Caco-2 + HT-29, integrada en el dispositivo 2-OC; (2) un "Liver 2-OC MPS" compuesto por esferoides hepáticos hechos de HepaRG + HHSteC (Células Estelares Hepáticas Humanas) integrados en el dispositivo 2-OC; y (3) un "Empo del Hígado 2-OC MPS" compuesto por el equivalente del intestino en un compartimiento del dispositivo que se comunica con el equivalente hepático en el otro por el flujo de medios a través de los canales microfluídicos.

Todos los ensayos se realizaron en condiciones estáticas (sin flujo) y dinámicas (con flujo) debido al impacto de los estímulos mecánicos (compresión, estiramiento y cizallamiento) en la viabilidad y funcionalidades de la célula18,19,20. El presente artículo describe el protocolo para la emulación de administración oral/intravenosa APAP y los respectivos análisis de absorción/metabolismo y toxicológicos en el MPS 2-OC que contiene modelos equivalentes de intestino humano y hígado.

Protocolo

1. Producción de equivalentes de tejido para el cultivo en el 2-OC

  1. Producción equivalente a barrera del intestino delgado
    1. Mantener las células de Caco-2 y HT-29 utilizando el medio equivalente intestinal: DMEM suplementado con 10% de FBS, 1% de penicilina y estreptomicina, y 1% de aminoácidos no esenciales, que se nombra como "DMEM S" en este manuscrito.
    2. Retire el medio, lave dos veces con 1 DPBS y agregue 8 ml de 0,25% de trippsina/EDTA para disociar las células de Caco-2 cultivadas en matraces de cultivo celular (175 cm2). Incubar durante 5 min a 37oC y detener la reacción añadiendo al menos el doble volumen de inhibidor de la trippsina. Realizar el mismo procedimiento para las células HT-29, ajustando los volúmenes de reactivos ya que se necesita una cantidad menor de estas células y se mantienen en matraces más pequeños (75 cm2).
    3. Centrifugar a 250 x g durante 5 min, retirar el sobrenadante de ambos tubos, y resuspender los gránulos celulares en 10 ml de DMEM S. Contar las células, asegurando una viabilidad celular superior al 80%. Integrar asépticamente inserciones de cultivo celular en una placa de 24 pocillos previamente llena con 400 l de DMEM S por pozo en el lado basolateral (que representa el torrente sanguíneo humano).
    4. Co-cultivar células Caco-2 y HT-29 en una proporción de 9:121. Utilice 2.25 x 105 Células Caco-2 y 2.5 x 104 HT-29 a cada equivalente intestinal en un volumen final de 200 l de DMEM S. Ajustar los números de celda y el volumen de acuerdo con el número deseado de organoides. Mezcle con cuidado.
    5. Pipetear 200 l de solución celular en el lado apical de cada plaquita (que representa el lado humano del lumen intestinal), sembrando 250.000 células por plaquita. Co-cultivar las células en las inserciones durante tres semanas22. Cambiar el medio al menos tres veces a la semana, aspirando desde los lados apical y basolateral con una pipeta Pasteur estéril, teniendo cuidado de no dañar la barrera celular intacta.
      NOTA: Proceda con la aspiración en el lado apical, para no tocar la barrera celular (aspirar apoyando la pipeta Pasteur en el borde de plástico de la plaquita de celda).
    6. Compruebe la formación de monocapa ajustada midiendo el TEER (resistencia eléctrica transepitelial) cada tres días utilizando un voltímetro23,de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      1. Realice un espacio en blanco, midiendo la resistencia a través de un inserto de cultivo celular sin celdas, pero con el mismo medio celular y en la misma placa de celda.
      2. Calcular la resistencia tisular restando la resistencia en blanco de la resistencia equivalente al tejido, y multiplicar por la superficie efectiva de la membrana del filtro (0,6 cm2). Una buena resistencia a la barrera intestinal está en un rango de 150 a 400 Ω cm2.
        NOTA: Después de 21 días las células deben estar completamente diferenciadas y la barrera intestinal formada, por lo que los equivalentes intestinales están listos para ser integrados en MPS.
  2. Producción de equivalentes hepáticos
    1. Mantener las células hepaRG utilizando el medio equivalente al hígado, que es el medio E de William complementado con 10% de suero bovino fetal, 2 mM de L-glutamina, 100 unidades/ml de penicilina, 100 g/ml de estreptomicina, 5 g/ml de insulina humana y 5 x10 -5 Mcor hidroloneona, y se denomina "Williams E S" en este manuscrito. Renovar los medios de HepaRG cada 2-3 días y mantener el cultivo celular durante dos semanas para iniciar la diferenciación en hepatocitos y colangiocitos.
    2. Después de las dos primeras semanas, agregue 2% DMSO al medio de HepaRG durante dos semanas adicionales para completar la diferenciación celular24,25. Cultivar HHSTeC en Stellate Cell Media (SteC CM), utilizando matraces de cultivo celular recubiertos de poli-L-lisina, cambiando los medios cada dos o tres días.
    3. Retire el medio, lave dos veces con 1 DPBS y añada 8 ml de 0,05% de trippsina/EDTA, para disociar las células hepaRG cultivadas en matraz de cultivo celular (175 cm2). Incubar de 5 a 10 min a 37oC y detener la reacción añadiendo al menos el doble del volumen del inhibidor de la trippsina. Realizar lo mismo para HHSTeC, adaptando el volumen del reactivo ya que se necesita una cantidad menor de estas celdas y se pueden mantener en matraces más pequeños (75 cm2).
    4. Centrifugar ambos a 250 x g durante 5 min, retire el sobrenadante y resuspendir los pellets celulares en el medio Williams E S. Contar las células, asegurando una viabilidad celular superior al 80%.
    5. Generar los esferoides hepáticos combinando células HepaRG y HHSTeC en una proporción de 24:1, respectivamente, en Williams E S medio16. Añadir 4,8 x 104 HepaRG diferenciados y 0,2 x 104 HHSTeC para componer cada esferoide hepático de 50.000 células, en un volumen de 80 l. Ajustar los números de celda y el volumen de acuerdo con el número deseado de esferoides. Mezcle con cuidado.
    6. Usando una pipeta multicanal, dispensar 80 l de la piscina de células combinadas en cada pocóter de 384 microplacas esferoides, que tiene geometría redonda bien inferior.
      NOTA: Después de cuatro días, se forman esferoides de unos 300 m.
    7. Usando puntas de diámetro ancho, transfiera los esferoides hepáticos a placas de 6 pozos de ultra-baja fijación, lo que permite el conteo "uno por uno" requerido.

2. Integración de los equivalentes de intestino e hígado en un MPS de 2 OC

  1. Conjunto de MPS de 2-OC del intestino para ensayo de absorción
    1. Pipetear 500 l de DMEM S en el compartimento más grande de 2-OC y 300 l en el más pequeño. Aspirar los medios basolaterales y apicales de cada barrera intestinal equivalente en las placas de 24 pozos. Usando fórceps estériles, integre una plaquita por circuito 2-OC, específicamente en el compartimiento más grande. Aplicar 200 l del medio intestinal en el lado apical.
      NOTA: Evite la formación de burbujas al integrar los organoides en el MPS.
    2. Conecte el MPS a la unidad de control, que debe estar conectada a un suministro de aire presurizado. Ajuste los parámetros: una presión de, aproximadamente, ±300 bar y una frecuencia de bombeo de 0,3 Hz. Iniciar el flujo 24 h antes de la administración de la sustancia de ensayo. Al día siguiente, realice el tratamiento APAP.
  2. Ensamblaje de MPS de hígado 2-OC para ensayo de metabolismo
    1. Pipetear 650 l de Williams E S en el gran compartimiento y 350 l en el compartimiento más pequeño, que recibirá los esferoides. En las placas de 6 pozos de fijación ultrabajo, cuente los esferoides con puntas de diámetro ancho. Cada equivalente hepático se compone de veinte esferoides26. Integre veinte equivalentes hepáticos por circuito, utilizando puntas de diámetro ancho, lo que permite la transferencia de organoides solamente, en el compartimiento más pequeño de un 2-OC.
    2. Conecte el MPS a la unidad de control, que debe estar conectada a un suministro de aire presurizado. Ajuste los parámetros: una presión de, aproximadamente, ±300 bar y una frecuencia de bombeo de 0,3 Hz. Iniciar el flujo 24 h antes de la administración de la sustancia de ensayo. Al día siguiente, realice el tratamiento APAP.
  3. Conjunto de MPS de 2 OC del intestino/hígado para el ensayo de absorción y metabolismo
    1. Combinar los dos medios (intest del intestino y del hígado) en una proporción de 1:4, lo que significa 200 l de DMEM S en el lado apical intestinal y 800 l de Williams E S en el lado basolateral. Integrar los equivalentes de intestino e hígado, simultáneamente, en el 2-OC.
    2. Conecte el MPS a la unidad de control, que debe estar conectada a un suministro de aire presurizado. Ajuste los parámetros: una presión de, aproximadamente, ±300 bar y una frecuencia de bombeo de 0,3 Hz. Iniciar el flujo 24 h antes de la administración de la sustancia de ensayo. Al día siguiente, realice el tratamiento APAP.
      NOTA: Para todos los experimentos, realice cada punto de tiempo en triplicado, lo que significa tres circuitos separados de 2 OC (es decir, 1 y 1/2 2 dispositivos DE 2 OC). El volumen total de cada circuito 2-OC es de 1 ml.

3. Preparación para paracetamol (APAP)

  1. Prepare la solución de stock APAP, disolviendo APAP en etanol absoluto. El día del experimento, diluir APAP en el medio respectivo (solución APAP), a una concentración de 12 m para la "administración oral" y de 2 M para la "administración intravenosa".
  2. Asegúrese de que la concentración final de etanol en la solución de control y tratamiento del vehículo sea del 0,5% para ambas administraciones. Para el control positivo (100 mM APAP), la concentración de etanol es del 2%.

4. Administración de sustancias de ensayo y muestreo de medios

  1. Administración "oral" de APAP y muestreo de medios
    1. Aspirar los medios basolaterales y apicales de cada equivalente de barrera intestinal en la pipeta de 2-OC. 500 l del medio de cultivo apropiado en el compartimento grande en el lado basolateral organoid y 300 l en el pequeño compartimiento.
    2. Compruebe si hay burbujas y proceda con el tratamiento equivalente a la barrera intestinal con la sustancia de ensayo en el lado apical, emulando la administración oral. Emular la administración "oral" de APAP añadiendo 200 l de una solución APAP de 12 m en el lado apical de las inserciones de cultivo intestinal, que representa el "lado lumen" intestinal (Figura 1B). Conecte el MPS a la unidad de control.
    3. Recoger el volumen total de los lados apical y basolateral en los siguientes puntos de tiempo: 0 h, 5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 3 h, 6 h, 12 h, y 24 h15,27. Realizar todos los experimentos en triplicado, en condiciones estáticas y dinámicas, y recoger cada muestra, de cada triplicado, en un microtubo separado. Analice las muestras utilizando HPLC/UV.
      NOTA: Separe las muestras apicales y basolaterales.
  2. ApAP Administración "intravenosa" y muestreo de medios
    1. Emular la vía "intravenosa" mediante la administración de 2 M de solución APAP directamente en el compartimiento hepático. Aspirar todo el contenido medio de 2 OC. Pipeta de 650 l de Williams E S que contiene la sustancia de ensayo en el compartimento grande y 350 l del mismo soporte en el compartimiento más pequeño que contiene los 20 esferoides. Recoger todos los volúmenes en los siguientes puntos de tiempo: 0 h, 30 min, 1 h, 2 h, 3 h, 6 h, 12 h y 24 h27,28.
    2. Realizar todos los experimentos en triplicado, en condiciones estáticas y dinámicas. Recoger cada muestra, de cada triplicado, en un microtubo separado. Analice las muestras utilizando HPLC/UV.

5. Condiciones de instrumentación y cromatografía

  1. Análisis HPLC
    1. Establezca todos los parámetros relevantes para el análisis HPLC de acuerdo con la Tabla 1.
    2. Filtrar la fase móvil a través de un filtro de membrana de 0,45 m al vacío. Filtrar las muestras a través de un filtro de jeringa PVDF de 0,22 m de tamaño de poro (diámetro 13 mm) y almacenarlas en un vial. Inicie la medición.
  2. Soluciones de stock, estándares de calibración y muestras de control de calidad (QC)
    1. Preparar 10 mM de soluciones de stock APAP en tampón de acetato de amonio (100 mM, pH 6.8) y diluir aún más con medios de cultivo celular DMEM S y Williams E S diluidos con tampón de acetato de amonio (1:1, v/v) para lograr las soluciones de trabajo que van de 0,25 a 100,00 M.
    2. Incluya un conjunto de muestras de calibración en triplicado, así como muestras de control de calidad a cuatro niveles en triplicado. Prepare estas normas por dilución en serie.
    3. Cree curvas de calibración de áreas pico APAP frente a las concentraciones estándar nominales APAP. Determine el ajuste de regresión lineal para cada curva de calibración. Evalúe la bondad de ajuste de varios modelos de calibración mediante inspección visual, coeficiente de correlación, precisión intra e inter-ejecutar y valores de precisión.
    4. Inyectar muestras en blanco de medios DMEM S y Williams E S diluidos en tampón de acetato de amonio (1:1, v/v) en sextuplicado. Preparar triplicados de muestras de control de calidad en medios DMEM S y Williams E S diluidos con tampón de acetato de amonio (1:1, v/v) para las concentraciones APAP de 0,50 (LOQ), 4,50, 45,00 y 90,00 m.
    5. Asegúrese de que las muestras de control de calidad se preparan a partir de una nueva solución de stock, diferente de la utilizada para generar una curva estándar. Utilice muestras de control de calidad para investigar las variaciones intra e intercote.
  3. Procedimientos de validación
    1. Realice la validación del método bioanalítico siguiendo los procedimientos notificados anteriormente29,30. Llevar a cabo las ejecuciones cromatográficas en cinco o seis ocasiones separadas, considerando los medios de cultivo celular Williams E S y DMEM S, respectivamente.
    2. Asegúrese de que los puntos de calibración que oscilan entre 0,25 y 100,00 m de APAP, en medios de cultivo celular DMEM S o Williams E S diluidos en tampón de acetato de amonio (1:1, v/v), se tracen en función de las áreas pico de APAP (eje y) frente a las concentraciones nominales respectivas (eje x). Compare las pendientes de estas curvas de calibración estándar con pendientes de curva de calibración preparadas en tampón de acetato de amonio. Asegúrese de que todas las curvas de calibración tengan un valor de correlación de al menos 0,998.
    3. Determine la precisión y precisión (intra e inter-run) para el analito en la matriz suplente utilizando réplicas en cuatro niveles diferentes LLOQ, bajo, medio y control de alta calidad en cinco o seis días diferentes. Realizar mediciones de precisión y precisión intrarmada el mismo día en medios de cultivo celular DMEM S o Williams E S diluidos en tampón de acetato de amonio (1:1, v/v) que contiene 0,50, 4,50, 45,00 y 90,00 concentraciones de AP de MAP (n.o 3).
    4. Evalúe cada conjunto de muestras de control de calidad que contienen las concentraciones APAP a partir de curvas de calibración obtenidas recientemente. Probar la selectividad de los ensayos por el grado de separación del compuesto de interés y posibles otros picos cromatográficos causados por componentes que interfieren.
  4. Límite inferior de cuantificación (LLOQ) y límite de detección (LOD)
    1. Determine el límite inferior de cuantificación (LLOQ) en función de la desviación estándar de la respuesta y el enfoque de pendiente. Calcular utilizando la fórmula 10o/S, donde α es la desviación estándar de la intercepción y y S es la pendiente de línea recta obtenida mediante el trazado de las curvas de calibración29,30. Estimar el límite de detección (LOD) teniendo en cuenta 3,3 veces la desviación estándar del espacio en blanco, dividido por la pendiente de la curva de calibración29,30.

6. Equivalentes de tejido viabilidad/funcionalidad

  1. Mtt
    1. Realizar un ensayo de MTT para evaluar la viabilidad organoides en todos los puntos de tiempo del ensayo MPS. Como control negativo, utilice medios celulares más vehículo. Como control positivo, tratar los organoides con 100 mM APAP y 1% NaOH diluido en medio celular.
    2. Transfiera los 20 esferoides de cada réplica para pozos individuales en una placa de 96 pozos, y el cultivo celular inserta, que contiene los equivalentes intestinales, a 24 placas celulares de pozo, colocando un equivalente intestinal por pozo. Lave los equivalentes de tejido tres veces con 1x DPBS.
    3. Añadir 300 l de una solución de MTT de 1 mg/ml, diluida en el medio celular respectivo, por pozo. Incubar las placas durante 3 h en condiciones de cultivo celular estándar.
    4. Retire la solución MTT de cada pozo cuidadosamente pipeteando. Extraiga MTT formazan de los equivalentes del intestino y del hígado utilizando 200 l de isopropanol por pozo durante la noche a 4 oC.
      NOTA: Selle la tapa para evitar la evaporación.
    5. Transfiera 200 l de cada sobrenadante al pozo preidentificado respectivo en una placa de prueba micro de 96 pozos. Utilice isopropanol como blanco.
    6. Lea la absorbancia de formazan en un lector de placas a 570 nm. Calcular la capacidad relativa de las células para reducir MTT (%) utilizando la densidad óptica media de cada punto de tiempo, en comparación con el control negativo, considerado como 100% viabilidad celular.
  2. Citoquímica/Histología
    1. Fijar los equivalentes del intestino y del hígado, durante 25 minutos a temperatura ambiente, utilizando 4% (p/v) paraformaldehído en 0,1 M tampón fosfato-salina, pH 7.4. Lave los organoides 5 veces en el tampón de PBS durante 10 minutos cada vez. Mancha los equivalentes intestinales y hepáticos con tetrametilrhodamine isothiocyanate-phalloidin o Alexa Fluor 647 falhalloidin, 1:50 en PBS31.
    2. Transfiéralos al medio de congelación de OCT durante unos minutos para aclimatarse a RT antes de transferirlos al nitrógeno líquido hasta la congelación completa. Realizar criocciones de esferoides hepáticos de aproximadamente 10-12 m de espesor, utilizando un criostato.
    3. Monte las secciones de los tejidos en el medio de montaje con DAPI. Examínelos mediante microscopía de fluorescencia confocal.
    4. Congelar los organoides después de la fijación para realizar la tinción de hematoxilina y eosina de acuerdo con los protocolos establecidos. Monte las diapositivas con un medio de montaje después de cortar el tejido como se describió anteriormente y tome imágenes histológicas utilizando un microscopio óptico.
  3. Análisis de alto contenido
    1. Tinción mitocondrial y nuclear de las células
      1. Reconstituir el polvo liofilizado en DMSO para crear una solución de material de tinción mitocondrial de 1 mM (p. ej., MitoTracker Deep Red FM). Conservar la solución alícuota de stock a -20 oC protegida de la luz. Diluir la solución de la solución de tinción mitocondrial de 1 mM a la concentración final (200 nM) en un medio de cultivo de tejido precalentado (37 oC) sin suero.
      2. Quite el medio de cultivo celular. Añadir la solución de tinción mitocondrial para cubrir completamente la muestra e incubar las células durante 15-45 min a 37oC en una atmósfera humidificada con 5% de CO2.
      3. Retire cuidadosamente la solución de trabajo de tinción mitocondrial y reemplácela con un fijador de paraformaldehído al 2-4% en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente.
      4. Enjuague suavemente las células fijas con PBS durante 5 minutos. Repita el proceso de lavado dos veces.
      5. Preparar una solución de material de tinción de ácido nucleico de 10 mg/ml (16,23 M) disolviendo 100 mg de tinte Hoechst 33342 en 10 ml de agua ultrapura.
        NOTA: La solución en stock debe ser alícuota y almacenada protegida de la luz a -20 oC.
      6. Preparar una solución de trabajo de tinción de ácido nucleico de 0,2-2,0 g/ml en PBS e incubar las células fijadas con solución de trabajo de tinción de ácido nucleico durante 10 minutos a temperatura ambiente.
      7. Retire la solución de trabajo de tinción de ácido nucleico y enjuague las células suavemente con PBS durante 5 minutos tres veces. Las células deben mantenerse en PBS a 4 oC, protegidas de la luz.
    2. Análisis de tinción mitocondrial y nuclear
      1. Analizar las células utilizando un microscopio de fluorescencia con conjuntos de filtros apropiados para la mancha de ácido nucleico (Ex/ -Em: 361/497 nm) y la mancha mitocondrial (Ex/ -Em: 644/665 nm). Encontrar células por manchado positivo de ácido nucleico y cuantificar el número celular. Cuantificar la intensidad de la fluorescencia de la mancha mitocondrial en las mitocondrias.
  4. Mediciones morfométricas (cálculos de esferoides) en ImageJ
    1. Exporte imágenes de análisis de alto contenido (HCA) como archivos *.flex desde el software Columbus. Importe archivos .flex como escala de grises en ImageJ utilizando el plugin Bio-Formats32: Archivo > Importar > Bio-Formatos.
    2. En la ventana Opciones de importación, seleccione Visualización de Hyperstack y habilite Dividir canales en Dividir en ventanas independientes. Esta opción permitirá el acceso de todos los archivos de un canal determinado (por ejemplo, DAPI, mitotracker, etc.). No seleccione Usar pila virtual en Administración de memoria.
      NOTA: Es preferible utilizar el canal DAPI como "polvo" en las imágenes, ya que el medio de cultivo se reduce en la longitud de onda UV (por ejemplo, 405 nm).
    3. Ajuste el tamaño de píxel (Analizar > Establecer escala) si no se cargó según los valores incrustados en el archivo .flex. Aplique un filtro Desenfoque gaussiano para eliminar el exceso de ruido y evitar irregularidades en el contorno de la forma. Proceso > Filtros > Desenfoque gaussiano. Un alto valor de Sigma (radio) entre 2.0 y 3.0 es ideal para la mayoría de los casos. Si la pila tiene varias imágenes, aplíquelas a todas ellas (seleccione Sí en la ventana Pila de procesos).
    4. Genere una imagen binaria para separar el fondo y los organoides (objetos) utilizando un umbral. Haga clic en Imagen > Ajustar > Umbral. Utilice la máscara roja para ajustar los valores de acuerdo con la intensidad de la imagen, para ajustarse a la forma organoide, manteniendo la morfología intacta. Deshabilite el fondo oscuro si la imagen tiene un fondo blanco. Haga clic en Aplicar.
    5. En la ventana Convertir pila en binario, elija el método Umbral. Por lo general, Default o Triangle se prefieren en este tipo de procesamiento de imágenes. Mantenga el fondo como oscuro. Seleccione Calcular umbral para cada imagen si hay varias imágenes en la pila.
    6. Seleccione Proceso > Binario > Rellenar agujeros. Opcionalmente, elimine los agujeros del fondo. En Proceso > Binario > Opcións, seleccione Fondo negro y vuelva a ejecutar Agujeros de relleno. Deshabilite la opción Fondo negro antes de continuar con el paso siguiente.
    7. Separar objetos. Para los organoides, el método de cuenca hidrográfica es una buena opción. Haga clic en Procesar > Binario > Cuenca hidrográfica. Ejecute el análisis de formas.
      1. Seleccione Analizar > Definir medidas. Hay varias opciones disponibles (detalles en https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html). Para organoides, seleccione Area, Valor gris medio, Valor gris mínimo y máximo y Descriptores de forma. Si lo desea, seleccione Mostrar etiqueta para identificar objetos en la imagen y Notación científica. Haga clic en Aceptar.
      2. Seleccione Análisis > Analizar partículas. Elija los límites Tamaño y Circularidad. Mantenga 0-infinity y 0.00-1.00, respectivamente, para medir todos los objetos de la imagen. En Mostrar, elija Esquemas para que se identifiquen los objetos. Habilite Mostrar resultados para generar resultados; Excluir en aristas para excluir objetos que toquen bordes; Incluya agujeros para que los agujeros interiores eventuales en los objetos se consideren como parte de la forma principal.
    8. Repita Análisis de formas para cada pila de imágenes y los resultados se anexarán en una sola tabla. Exporte la tabla de resultados en Archivo > Guardar como... como archivo de valores separados por comas (.csv).
  5. PCR en tiempo real
    1. Extraer ARN de equivalentes tisulares utilizando una solución monofásica de fenol e isotiocianato de guanidina, siguiendo las instrucciones del fabricante.
    2. Realizar la síntesis de ADNc mediante transcripción inversa de 1 – 2 g de ARN total.
    3. Amplifique todos los objetivos utilizando imprimaciones específicas genéticamente (Tabla 5) para realizar PCR cuantitativo en tiempo real. Cada qRT-PCR contiene 30 ng de ARN transcrito atrás y 100 nM de cada imprimación.
    4. Siga las condiciones de la PCR: 50 oC durante 3 minutos (1 ciclo); 95 oC durante 5 minutos (1 ciclo); 95 oC durante 30 segundos, 59 oC durante 45 segundos y 72 oC durante 45 segundos (35 - 40 ciclos).
  6. Ensayo CYP
    1. Siga la sección 2.2 para el montaje del hígado 2-OC. Los grupos experimentales son el control sin células, los tratamientos APAP de 2 m para 12 h, 24 h y el control del vehículo. Siga las secciones 3.3 y 4.2 para la preparación y el tratamiento de APAP 2 m.
      NOTA: Para asegurarse de que todas las muestras estarán listas al mismo tiempo para el ensayo DEL CYP, inicie el tratamiento de 12 h 12 horas después de iniciar el tratamiento de 24 h. Tratar el control sin células de la actividad cyp con una solución de etanol al 0,5%, así como el control del vehículo.
    2. Descongelar la solución de material de sustrato luminogénico de 3 mM a temperatura ambiente y hacer una dilución de 1:1000 en E S. Protect de William de la luz.
    3. Recoger esferoides y transferir cada grupo experimental a un pozo de una placa de 96 pozos. Retirar el medio, lavar dos veces con 100 l de 1x DPBS y añadir 80 l de solución de sustrato de 3 m por pozo. Mantenga el control sin celda en el medio E S de William. Ahorre un pozo sin esferoides ni solución de sustrato para un control de fondo. Incubar durante 30-60 min a 37oC con 5% de CO2,protegido de la luz.
    4. Reactivo de detección de Luciferina liofilizada (LDR) equilibrado utilizando el búfer de reconstitución con esterasa. Mezclar arremolinando o invirtiendo. Guarde el volumen apropiado a temperatura ambiente hasta el siguiente paso.
      NOTA: El LDR reconstituido se puede almacenar a temperatura ambiente durante 24 horas o a 4 oC durante 1 semana sin pérdida de actividad. Para almacenamiento a largo plazo, almacene a –20 oC.
    5. Transfiera 25 l de sobrenadante de esferoides intactos en tres pozos diferentes de una microplaca blanca opaca de 96 pomos, después de la incubación. Añadir 25 l de LDR por pocóyo y homogeneizar.
    6. Incubar la placa blanca a temperatura ambiente durante 20 minutos. Lea la luminiscencia en un luminómetro. No utilice un fluorómetro.
    7. Calcule las señales netas restando los valores de luminiscencia de fondo (control sin celda) de los valores de prueba tratados y no tratados (control del vehículo). Calcule el cambio porcentual de la actividad del CYP3A4 dividiendo los valores netos tratados por los valores netos no tratados y multiplicándose por 100.
  7. Hinchazón occidental
    1. Transfiera los esferoides hepáticos a un microtubo identificado de 1,5 ml. Retire el medio y lávelo dos veces con 100 l de 1x DPBS.
    2. Lysate los esferoides hepáticos en 100 sl de la lelisis celular tampón RIPA a 4 oC durante 20 min. Centrífuga durante 15 min, 4oC y 11000 rpm. Transfiera el sobrenadante a otro microtubo identificado de 1,5 ml.
    3. Cuantificar la cantidad de proteína obtenida a través del método Bradford. Cargue entre 10 y 50 g de proteína del lesato celular cuantificado por pozo de un gel de poliacrilamida gradiente 3-15% y realice una SDS-PAGE.
    4. Transfiera la proteína cargada del gel a una membrana PVDF de 0,22 m a través del equipo del sistema semisequedo. Utilizar una solución de transferencia de 50 mM Tris-HCl y 192 mM de glicina. Ajuste los parámetros del equipo según el número de geles a transferir (1 a 2 a la vez).
    5. Bloquear interacciones inespecíficas en la membrana PVDF con una solución de leche desnatada del 3-5% en tampón TBS-T: Salina tamponada tris (50 mM Tris pH 7.6, 150 mM de cloruro de sodio) complementada con 0,1% de Tween 20. Mantenga la membrana bajo agitación suavemente constante durante 1 hora a temperatura ambiente.
    6. Lavar con TBS-T bajo agitación suavemente constante durante 3-5 minutos a temperatura ambiente. Repita este paso de lavado dos veces.
    7. Diluir los anticuerpos primarios de albúmina y vinculina a 1:1000 y 1:2000 respectivamente en TBS-T. Incubar la membrana con anticuerpos primarios durante la noche a 4oC, bajo agitación suavemente constante.
      NOTA: Siga siempre las instrucciones del fabricante para diluir los anticuerpos.
    8. Retire el anticuerpo primario y la membrana lave 3 veces (paso 6.7.6). Diluir el anticuerpo secundario IgG antiratón ECL a 1:5000 en TBS-T. Incubar la membrana con un anticuerpo secundario bajo agitación suavemente constante durante 2 horas a temperatura ambiente.
    9. Retire el anticuerpo secundario y lave la membrana (paso 6.7.6). Realice la detección de proteínas con ECL Western Blotting Substrate. Exponer las películas autoradiográficas durante 30 s a 30 min. Realizar la detección de inmunoblotting en triplicado.

Resultados

Para realizar las pruebas PK APAP en el MPS 2-OC, el primer paso es fabricar el intestino humano y equivalentes hepáticos (organoides). Se integran en el dispositivo microfluídico 2-OC (Figura 1A) 24 h antes de iniciar el ensayo PK APAP. Al día siguiente, el medio se cambia, y el modelo se expone a APAP. La Figura 1 ilustra los equivalentes del intestino y del hígado colocados dentro del dispositivo 2-OC (Figura 1B) y el curso d...

Discusión

La evaluación precisa y fiable de las propiedades farmacológicas de los nuevos fármacos de investigación es fundamental para reducir el riesgo en los siguientes pasos de desarrollo. El MPS es una tecnología relativamente nueva, que tiene como objetivo mejorar el poder predictivo y reducir los costos y el tiempo invertido con las pruebas preclínicas. Nuestro grupo está avanzando en la evaluación de las propiedades farmacocinéticas y toxicológicas que se necesitan principalmente para la optimización del plomo. T...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos al Dr. Christie Guguen-Guillouzo, al Dr. Philippe Gripon en la Unidad 522 INSERM y al Dr. Christian Trepo en la Unidad 271 INSERM por el uso del Material Biológico (células Hepa RG) y por ponernos a nuestra disposición con el fin de realizar la investigación académica.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1x DPBSThermo Fisher Scientific14190235No calcium, no magnesium
2-OCTissUse GmbHTwo-organ chip
384-well Spheroid MicroplateCorning3830Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment
4% ParaformaldehydeUse to fix cell
AcetaminophenSigma AldrichA7085Use to MPS assays
AcetonitrileTediaUsed to perform HPLC
Alexa Fluor 647 phalloidinThermo Fisher Scientificconfocal experiment
Ammonium acetateSigma AldrichUsed to perform HPLC
Caco-2 cellsSigma Aldrich86010202
Cacodylate buffer
Cell culture flasksSarstedt
Confocal Fluorescence microscopeLeicaDMI6000
CryostatLeicaCM1950
DMEM high glucoseThermo Fisher Scientific12800017Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids
DMSOSigma AldrichD4540Add 2% to HepaRG media
EthanolSynth
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific12657029
Freezing medium OCTTissue-TekTissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below.
Hematoxylin & Eosin
HepaRG cellsBiopredic InternationalHPR101Undifferentiated cells
HHSTeCScienCell Research Laboratories5300Cells and all culture supplements
Hoechst 33342HCA experiments
HT-29 cellsSigma Aldrich85061109
Human InsulinInvitrogen - Thermo Fisher Scientific12585014
HydrocortisoneSigma AldrichH0888
IsopropanolMerck278475
Karnovsky’s fixative
L-glutamineThermo Fisher ScientificA2916801
Luna C18 guard column SSPhenomenexUsed to perform HPLC
MicroscopeLeicaDMi4000
MicrotomeLeicaRM2245
Millicell 0.4 µm pore size insertsMerckPIHP01250
Millicell ERS-2 meterMerckMERS00002Used to TEER measurement
MitoTracker Deep RedHCA experiments
MTTThermo Fisher ScientificM6494
MX3000P systemAgilent Technologies
Neubauer chamberCounting cells
Operetta High Content Imaging SystemPerkin ElmerUsed to perform HCA
P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPAPromegaCat.# V9001
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15070063Cell culture
PermountThermo Fisher ScientificHistology
PrimersRT-qPCR
PVDF membraneBioRad
PVDF Syringe filter0.22 μm pore size
Reversed-phase Luna C18 columnPhenomenexUsed to perform HPLC
Shaker (IKA VXR Basic Vibrax)IKA Works GmbH & Co2819000Used for spheroids to improve MTT assay
Stellate Cell Media (STeC CM)ScienCell5301Add STeC CM supplements
SuperScriptIITM Reverse TranscriptaseThermo Fisher Scientific
SYBR Green PCR Master MixThermo Fisher Scientific
TRizol TM reagentThermo Fisher ScientificTrizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate.
Trypsin/EDTA solutionThermo Fisher ScientificR001100
Ultra-low-attachment platesCorningCLS3471-24EA6 wells
Vectashield plus DAPI mounting media
White Opaque 96-well MicroplatePerkinHelmer
Wide-bore tips
Williams EPan BiotechP04-29510Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin

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