Establecimiento de coculturas basadas en células únicas de manera determinista con un chip microfluídico

Resumen

Este informe describe un método microfluídico basado en chips para establecer un experimento de cultivo de una sola célula en el que se puede lograr un emparejamiento de alta eficiencia y un análisis microscópico de varias células individuales.

Resumen

Los ensayos de cocultivo celular se han utilizado ampliamente para estudiar las interacciones de células celulares entre diferentes tipos de células para comprender mejor la biología de las enfermedades, incluido el cáncer. Sin embargo, es difícil aclarar el complejo mecanismo de interacciones intercelulares en poblaciones celulares altamente heterogéneas utilizando sistemas de cocultivo convencionales porque la heterogeneidad de la subpoblación celular está oscurecida por los valores medios; los sistemas de cocultivo convencionales sólo se pueden utilizar para describir la señal de población, pero son incapaces de rastrear el comportamiento de las células individuales. Además, los métodos experimentales convencionales de una sola célula tienen baja eficiencia en la manipulación celular debido a la distribución de Poisson. Los dispositivos microfabricados son una tecnología emergente para estudios de una sola célula porque pueden manipular con precisión células individuales a un alto rendimiento y pueden reducir el consumo de muestras y reactivos. Aquí, describimos el concepto y la aplicación de un chip microfluídico para múltiples cocultivos de una sola célula. El chip puede capturar de manera eficiente varios tipos de células individuales en una cámara de cultivo (46%) y tiene un espacio de cultivo suficiente útil para estudiar el comportamiento de las células (por ejemplo, migración, proliferación, etc.) bajo la interacción célula-célula a nivel de una sola célula. Las células endoteliales linfáticas y el carcinoma de células escamosas orales se utilizaron para realizar un experimento de cocultivo de una sola célula en la plataforma microfluídica para estudios de interacción de células únicas en vivo.

Introducción

Se necesita una captura eficiente de diferentes tipos de celdas individuales y proporcionar suficiente espacio de cultivo para experimentos de cocultivo de una sola célula de varios tipos de celdas individuales¹. Limitar la dilución es el método más utilizado para preparar las células individuales para tales experimentos, debido al bajo costo del equipo requerido. Sin embargo, debido a la limitación de distribución de Poisson, la probabilidad máxima de adquisición de una sola célula es de solo 37%, lo que hace que la operación experimental sea laboriosa y requiera mucho tiempo^2. Por el contrario, el uso de la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) puede superar la limitación de distribución de Poisson para preparar de manera alta células individuales³. Sin embargo, es posible que algunos laboratorios no puedan acceder a FACS debido a los costosos costos de instrumentación y mantenimiento. Los dispositivos microfabricados se han desarrollado recientemente para el reventado de una sola célula^4,el emparejamiento de una sola célula⁵y las aplicaciones de cultivo de una sola célula. Estos dispositivos son ventajosos en función de su capacidad para manipular con precisión celdas individuales^6,realizar experimentos de alto rendimiento o reducir el consumo de muestras y reactivos. Sin embargo, realizar experimentos de cocultivo de una sola célula con varios tipos de células con los dispositivos microfluídicos actuales sigue siendo un desafío debido a la limitación de la distribución de Poisson^1,7,8,o la incapacidad de los dispositivos para capturar más de dos tipos de células individuales^4,5,6,9,10.

Por ejemplo, Yoon y otros informaron de un dispositivo microfluídico para el estudio de interacción célula-célula¹¹. Este dispositivo utiliza el método probabilístico para emparejar celdas en una cámara. Sin embargo, sólo puede lograr el emparejamiento de dos tipos de celda diferentes debido a restricciones geométricas en la estructura del dispositivo. Otro informe de Lee y otros demostró un método determinista para capturar y emparejar celdas individuales¹². Este dispositivo aumenta la eficiencia de emparejamiento por el método determinista, pero está limitado por el tiempo de operación prolongado necesario para emparejar celdas. Específicamente, la segunda captura de célula sin capacidad sólo se puede realizar después de que la primera celda capturada se une a la superficie después de 24 h. Zhao et al. informaron de un dispositivo microfluídico basado en gotas para capturar dos tipos de una sola celda^13. Podemos encontrar que el dispositivo microfluídico basado en gotas todavía se limita a la distribución de Poisson y sólo se puede utilizar en células no conectadas, y no es posible cambiar la solución de cultivo durante el proceso de cultivo.

Anteriormente, hemos desarrollado un microfluido "chip de cierre hidrodinámico" que utiliza fuerzas hidrodinámicas deterministas para capturar múltiples tipos de una sola célula en la cámara de cultivo y posteriormente puede realizar experimentos de cocultivo celular para analizar comportamiento de migración de celda sindividual en las interacciones de células^{celulares 14}. El chip de cierre hidrodinámico comprende un conjunto de unidades de matriz que cada una contiene un canal de derivación de serpentina, un sitio de captura y una cámara de cultivo. Mediante el uso de la diferencia en la resistencia al flujo entre el canal de derivación de serpentina y la cámara de cultivo, y un procedimiento de operación especialmente diseñado, diferentes tipos de células individuales se pueden capturar repetidamente en la cámara de cultivo. En particular, el amplio espacio de la cámara de cultivo no sólo puede evitar que la célula se enjuague durante la captura de células, sino que también proporcione suficiente espacio para que las células se propaguen, proliferen y migren, lo que permite observar interacciones en vivo de una sola célula. En este artículo, nos centramos en la producción de este dispositivo y los pasos detallados del protocolo.

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Protocolo

1. Fabricación de un molde de oblea por litografía suave

NOTA: Los datos del patrón de máscara están disponibles en nuestra publicación anterior¹⁴.

1. Deshidratar una oblea de silicio de 4 pulgadas en un horno de 120 oC durante 15 min.
2. Capa de giro 4 g de SU-8 2 fotorresistente negativo sobre una oblea de silicio de 4 pulgadas a 1.000 rpm durante 30 s para crear una capa de 5 m de espesor (capa #1).
3. La capa de horneado suave #1 en una placa de cocción de 65 oC durante 1 min y luego transfiera la capa #1 a una placa de cocción de 95 oC durante 3 minutos.
4. Enfríe la capa #1 a temperatura ambiente, colóquela en el soporte del alineador de máscara semiautomático y alinee con la capa #1 fotomáscara cromada (capa de sitio de captura).
5. Exponga la capa #1 con luz UV de 365 nm a una dosis de 150 mJ/cm².
6. Retire la capa #1 del alineador y después de hornear en una placa de cocción de 65 oC durante 1 min. Transfiera la capa #1 a una placa de cocción de 95 oC durante 1 min.
7. Capa fría #1 a temperatura ambiente. Sumergir en una solución de acetato de éter monometil propilenglicol para lavar el fotorresistente sin recruzar durante 2 min. Seque suavemente con gas nitrógeno para revelar una capa #1 marca de alineación.
8. Cubrir la capa #1 la marca de alineación por una cinta adhesiva, capa de espín 4 g de SU-8 10 fotorresistente negativo en la capa #1 a 1.230 rpm durante 30 s para crear una capa de 25 m de espesor #2.
9. Retire la cinta, la capa de horneado suave #2 en una placa de cocción de 65 oC durante 3 minutos y, a continuación, transfiera la capa #2 a una placa de cocción de 95 oC durante 7 minutos.
10. Enfríe la capa #2 a la temperatura ambiente, coloque la capa #2 sobre el soporte del alineador de máscara semiautomático y alinee la capa #2 fotomáscara cromada (capa de canal de derivación) con la capa #1 la marca de alineación.
11. Exponga la capa #2 con luz UV de 365 nm a una dosis de 200 mJ/cm².
12. Retire la capa #2 del alineador y después de hornear en una placa de cocción de 65 oC durante 1 min y transfiera la capa #2 a una placa de cocción de 95 oC durante 3 minutos.
13. Enfríe la capa #2 a temperatura ambiente y cubra la capa #1 la marca de alineación por cinta adhesiva. Capa de giro 4 g de fotorresistente negativo SU-8 2050 sobre la capa #2 a 1.630 rpm durante 30 s para crear una capa de 100 m de espesor #3.
14. Retire la cinta, la capa de horneado suave #3 en una placa de cocción de 65 oC durante 5 minutos y, a continuación, transfiera la capa #3 a una placa de cocción de 95 oC durante 20 minutos.
15. Enfríe la capa #3 a la temperatura ambiente, coloque la capa #3 sobre el soporte del alineador de máscara semiautomático y alinee la capa #3 fotomáscara cromada (capa de cámara de cultivo) con la capa #1 la marca de alineación.
16. Exponga la capa #3 con luz UV de 365 nm a una dosis de 240 mJ/cm².
17. Retire la capa #3 del alineador y después de hornear en una placa de cocción de 65 oC durante 5 minutos #3.
18. Capa fresca #3 a temperatura ambiente. Sumergir en una solución de acetato de acetato de monometil de propilenglicol para lavar el fotorresistente sin recruzar durante 10 minutos, y secar suavemente con gas nitrógeno.

2. Preparación del dispositivo PDMS para la captura de varias células individuales

1. Colocar el molde de oblea y la placa de pesaje que contiene 100 ml de triclorosilano en un desecador (solo para la silanización) y aplicar un vacío (-85 kPa) durante 15 minutos.
   NOTA: Silanize la superficie de la oblea con triclorosilano para crear propiedades de superficie hidrófobas antes de la fundición PDMS para que pueda ser pelada sin esfuerzo desde el molde PDMS de oblea.
2. Detenga la aspiradora y, a continuación, silanize el molde de oblea en el desecador (sólo para la silanización) a 37 oC durante al menos 1 h.
3. Combine la base de PDMS y el agente de curado PDMS en una proporción de 10:1. Vierta un total de 20 g de PDMS mezclados en el molde de obleas en un plato de 15 cm.
4. Coloque el plato de 15 cm en un desecador y aplique vacío (-85 kPa) durante 1,5 min. A continuación, retire el plato de 15 cm del desecador. Mantener durante 20 minutos a temperatura ambiente. Por último, elimine las burbujas de aire residuales en PDMS con gas nitrógeno.
5. Colocar el plato de 15 cm en un horno a 65oC durante 2-4 h para curar PDMS.
6. Retire la réplica PDMS del molde de oblea y, a continuación, golpee una entrada de 1,5 mm y una salida de 0,5 mm en el PDMS utilizando un diámetro interior de 1,5 mm y un punzonador de diámetro interior de 0,5 mm(figura 1C).
7. Limpie la réplica de PDMS y la superficie de la corredera con cinta extraíble y, a continuación, trate la superficie con plasma de oxígeno (100 W durante 14 s).
8. Alinee manualmente las réplicas de PDMS con la diapositiva y póngalas en contacto entre sí.
9. Coloque la diapositiva PDMS en un horno de 65 oC durante 1 día.
   NOTA: Se logra la unión permanente entre la diapositiva y la réplica de PDMS para formar el dispositivo.
10. Sumerja el dispositivo PDMS en un recipiente lleno de solución salina tamponada de fosfato y colóquelo en un desecador. A continuación, aplique vacío (-85 kPa) durante 15 minutos para eliminar las burbujas de aire.
11. Coloque el dispositivo PDMS en una campana de cultivo celular y esterilice el dispositivo con luz UV (longitud de onda de luz: 254 nm) durante 30 min.
12. Sustituya el búfer del dispositivo PDMS por un medio (medio basal DMEM-F12 que contenga un 1% de antibióticos y un 10% de suero bovino fetal) e incubar el dispositivo PDMS a 4oC durante 1 día. Esto evita que las celdas se adhieran a la superficie de PDMS.

3. Preparación de una suspensión de una sola célula

NOTA: Los tipos de células incluyen células endoteliales linfáticas humanas (LEC), células humanas OSCC TW2.6 que expresan el ARNS específico de WNT5B (WNT5B sh4) y el control vectorial (pLKO-GFP) que se obtuvieron de nuestro estudio anterior¹⁵. Consulte nuestra publicación anterior para conocer los pasos detallados del cultivo.

1. Retire el medio de cultivo cuando las células alcancen un 70-80% de confluencia. Luego lave suavemente las células con 5 ml de PBS estéril tres veces.
2. Añadir 1 ml de medio DMEM-F12 que contenga 1 tinte fluorescente M en células WNT5B sh4 y pLKO-GFP (utilice el medio MV2 para LEC) y luego incubar las células durante 30 minutos a temperatura ambiente.
   NOTA: Los LEC se tiñieron con el diacetato de clorometilfluoresceína verde (CMFDA) Tinte, las células WNT5B sh4 se teñieron con azul 7-amino-4-clorometilcoumarina (CMAC) Las células de tinte y pLKO-GFP se tejieron con tinte fluorescente Dil rojo.
3. Lave suavemente las células con 5 ml de PBS estéril tres veces.
4. Retire el PBS y agregue 2 mL de 0.25% Trypsin-EDTA (0.05% Trypsin-EDTA para LECs).
5. Incubar las células durante 4 minutos a temperatura ambiente y luego toque suavemente el plato de cultivo de tejido para promover el desprendimiento de células.
6. Añadir 4 ml de dMEM-F12 medio para dispersar las células WNT5B sh4 y pLKO-GFP (para leC sutilizan 3 ml de medio MV2 y 1 ml de solución neutralizadora de trippsina). A continuación, transfiera las células a un tubo de 15 ml y centrífuga a 300 x g durante 3 minutos.
7. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 1 ml de medio DMEM-F12 suavemente. Cuente el número de celdas vivas en un hemocofómetro utilizando el método de exclusión estándar Trypan Blue¹⁶. Prepare 1 ml de suspensión celular a 3 x 10⁵ células/ml de concentración en medio DMEM-F12, y luego mantenga las células en hielo para evitar la agregación celular.
   NOTA: Para mejorar la eficiencia de captura de una sola célula, se requiere una preparación cuidadosa de la suspensión de una sola célula con una sola disociación.

4. Captura múltiple de una sola célula y triple cultivo de una sola célula

1. Conecte un tubo de politetrafluoroethene (PTFE) entre la salida del dispositivo y la bomba de la jeringa. Retire el medio y agregue 1 l de suspensión celular a una concentración de 3 x 10⁵ celdas/ml en la entrada del dispositivo PDMS.
2. Cargue la suspensión de la célula en el dispositivo mediante una bomba de jeringa a un caudal de 0,3 l/min(figura 2A). La dirección del flujo es desde la entrada hasta la salida.
   NOTA: Cargue inmediatamente después de agregar la suspensión celular en la entrada para evitar la sedimentación celular.
3. Añadir 1 l de medio DMEM-F12 a la entrada del dispositivo PDMS después del paso 4.2.Cargue el medio DMEM-F12 en el dispositivo mediante una bomba de jeringa a un caudal de 0,3 l/min(figura 2B). La dirección del flujo fluyó de la entrada a la salida.
4. Cargar 0,3 l de medio DMEM-F12 en el dispositivo mediante una bomba de jeringa a un caudal de 10 l/min(figura 2C). La dirección del flujo fluyó desde la salida hasta la entrada.
5. Repita los pasos 4.1 a 4.4 para cargar otros tipos de celda en el dispositivo.
6. Después de completar la captura celular, utilice un microscopio con lente 4x para crear imágenes de cada cámara de cultivo.
   NOTA: Las emisiones de fluorescencia de las células se utilizaron para identificar y contar el número de células individuales en cada cámara de cultivo.
7. Retire el tubo de PTFE y selle la entrada y la salida con cinta de poliolefina para crear un sistema de cultivo cerrado.
8. Mueva el dispositivo PDMS a una placa de cultivo de 10 cm y agregue 10 ml de PBS estéril alrededor del dispositivo PDMS para evitar la evaporación del medio del dispositivo.
9. Transfiera el plato de cultivo a una incubadora (37oC, 5% CO₂ y 95% de humedad) para un cultivo triple de una sola célula.
10. Observar y fotografiar microscópicamente el crecimiento celular cada 12 h.

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Resultados

El dispositivo tiene una estructura de tres capas como se muestra en la fotografía transversal de un dispositivo PDMS cortado(Figura 1A). La primera capa contiene un sitio de captura (6,0 m de ancho y 4,6 m de altura) que conecta la cámara de cultivo y el canal de derivación. La diferencia en la resistencia al flujo entre la cámara de cultivo y el canal de derivación hace que las celdas fluyan hacia la posición de captura y llenen la en...

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Discusión

Las interacciones intercelulares de varias células en el microambiente tumoral juegan un papel importante en la progresión del tumor^17. Para comprender el mecanismo de las interacciones célula-célula, los sistemas de cocultivo se utilizan como un método analítico común. Sin embargo, múltiples tipos de células y la heterogeneidad de las propias células han llevado a complejidad experimental y dificultades analíticas.

El chip de cierre hidrodinámico permite la...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape	3M Company	9795R
Antibiotics	Biowest	L0014-100	Glutamine-Penicillin-Streptomycin
AutoCAD software	Autodesk	AutoCAD LT 2011	Part No. 057C1-74A111-1001
CellTracke Blue CMAC Dye	Invitrogen	C2110
CellTracker Green CMFDA Dye	Invitrogen	C7025
Conventional oven	YEONG-SHIN company	ovp45
Desiccator	Bel-Art Products	F42020-0000	Space saver vacuum desiccator 190 mm white base
DiIC12(3) cell membrane dye	BD Biosciences	354218	Used as a cell tracker
DMEM-F12 medium	Gibco	11320-082
Endothelial Cell Growth Medium MV 2	PromoCell	C-22022
Fetal bovine serum Hyclone	Thermo	SH30071.03HI
Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml )	Hamilton	80630	100 µL, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2
Harris Uni-Core puncher	Ted Pella Inc.	15075	with 1.5mm inner-diameter
Harris Uni-Core puncher	Ted Pella Inc.	15071	with 0.5mm inner-diameter
Hotplate	YOTEC company	YS-300S
Msak aligner	Deya Optronic CO.	A1K-5-MDA
Oxygen plasma	NORDSON MARCH	AP-300
Plasma cleaner	Nordson	AP-300	Bench-Top Plasma Treatment System
Polydimethylsiloxane (PDMS) kit	Dow corning	Sylgard 184
Poly-tetrafluoroethene (PTFE)	Ever Sharp Technology, Inc.	TFT-23T	inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm
Removable tape	3M Company	Scotch Removable Tape 811
Silicon wafer	Eltech corperation	SPE0039
Spin coater	Synrex Co., Ltd.	SC-HMI 2" ~ 6"
Stereomicroscope	Leica Microsystems	Leica E24
SU-8 10 negative photoresist	MicroChem	Y131259
SU-8 2 negative photoresist	MicroChem	Y131240
SU-8 2050 negative photoresist	MicroChem	Y111072
SU-8 developer	Grand Chemical Companies	GP5002-000000-72GC	Propylene glycol monomethyl ether acetate
Syringe pump	Harvard Apparatus	703007
Trichlorosilane	Gelest, Inc	SIT8174.0	Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.
Trypsin Neutralizer Solution	Gibco	R-002-100