Ensayo para la integridad de la barrera hematoencefálica en Drosophila melanogaster

Resumen

La integridad de la barrera hematoencefálica es fundamental para la función del sistema nervioso. En Drosophila melanogaster, la barrera hematoencefálica se forma por células gliales durante la embriogénesis tardía. Este protocolo describe los métodos para el ensayo para la formación y el mantenimiento de barreras hematoencefálicas en embriones D. melanogaster y larvas de tercera estrella.

Resumen

El desarrollo adecuado del sistema nervioso incluye la formación de la barrera hematoencefálica, la barrera de difusión que regula estrechamente el acceso al sistema nervioso y protege el tejido neural de toxinas y patógenos. Los defectos en la formación de esta barrera se han correlacionado con las neuropatías, y la descomposición de esta barrera se ha observado en muchas enfermedades neurodegenerativas. Por lo tanto, es fundamental identificar los genes que regulan la formación y el mantenimiento de la barrera hematoencefálica para identificar posibles dianas terapéuticas. Con el fin de entender las funciones exactas que estos genes juegan en el desarrollo neuronal, es necesario determinar los efectos de la expresión génica alterada en la integridad de la barrera hematoencefálica. Muchas de las moléculas que funcionan en el establecimiento de la barrera hematoencefálica se han encontrado para ser conservadas a través de especies eucariotas, incluyendo la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster. Las moscas de la fruta han demostrado ser un excelente sistema modelo para examinar los mecanismos moleculares que regulan el desarrollo y la función del sistema nervioso. Este protocolo describe un procedimiento paso a paso para el ensayo de la integridad de la barrera hematoencefálica durante las etapas embrionarias y larvales del desarrollo de D. melanogaster.

Introducción

Durante el desarrollo, la comunicación celular y las interacciones son fundamentales para el establecimiento de la estructura y función de tejidos y órganos. En algunos casos, estas interacciones células-células sellan los órganos del entorno circundante para asegurar el funcionamiento adecuado del órgano. Este es el caso del sistema nervioso, que está aislado por la barrera hematoencefálica (BBB). Disfunción del BBB en seres humanos se ha relacionado con trastornos neurológicos incluyendo epilepsia, y la descomposición de la barrera se ha observado en enfermedades neurodegenerativas incluyendo esclerosis múltiple y esclerosis lateral amiotrófica¹. En los mamíferos, el BBB está formado por uniones estrechas entre las células endoteliales^2,3. Otros animales, incluyendo la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, tienen un BBB compuesto de células gliales. Estas células gliales forman una barrera selectivamente permeable para controlar el movimiento de nutrientes, productos de desecho, toxinas y moléculas grandes dentro y fuera del sistema nervioso⁴. Esto permite el mantenimiento del gradiente electroquímico necesario para disparar potenciales de acción, permitiendo la movilidad y coordinación^4. En D. melanogaster, la glia protege el sistema nervioso de la hemolinfa⁵rica en potasio.

En el sistema nervioso central (SNC) y el sistema nervioso periférico (PNS) de D. melanogaster, dos capas glias externas, la glia subperineurial y la glia perineurial, así como una red externa de matriz extracelular, la lamela neural, forman la hemolinfa-cerebro y la barrera del nervio hemafifáfico⁶, conocido como el BBB a lo largo de este artículo. Durante el desarrollo la glia subperineurial se convierte nofoides y se agranda para rodear el sistema nervioso^{5,6,7,8,9,10,11} . La glia subperineurial forma uniones septato, que proporcionan la principal barrera de difusión entre la hemolinfa y el sistema nervioso^5,6,12. Estas uniones son molecularmente similares a las uniones similares a septatos que se encuentran en los paranodos de la glia mielinante en vertebrados, y realizan la misma función que las uniones estrechas en el BBB de los mamíferos^{13,14, 15 , 16 , 17}. La glia perineurial divide, crece y envuelve alrededor de la glia subperineurial para regular la difusión de metabolitos y moléculas grandes^6,10,18,19. La formación de BBB se completa en 18,5 h después de la puesta de huevos (AEL) a 25 oC^5,8. Estudios anteriores han identificado genes que son reguladores críticos de la formación BBB^20,21,22. Para comprender mejor las funciones exactas de estos genes, es importante examinar el efecto de la mutación de estos reguladores potenciales en la integridad de bBB. Si bien estudios anteriores han esbozado enfoques para decir la integridad de BBB en embriones y larvas, aún no se ha descrito un protocolo integral para este ensayo^5,7. Este protocolo paso a paso describe los métodos para decir la integridad de BBB durante las etapas embrionarias de D. melanogaster y la tercera etapa larval instar.

Protocolo

1. Recogida de muestras

1. Colección embryo
   1. En cada jaula de recolección de embriones, utilice un mínimo de 50 hembras vírgenes con 20 a 25 machos para las colecciones. Incubar estas moscas en una botella con alimentos de agar harina de maíz(Tabla de Materiales)durante 1 a 2 días antes de comenzar las colecciones²³.
      NOTA: Se pueden utilizar más moscas, pero la proporción de mujeres a hombres debe mantenerse en 2:1.
   2. Platos de agar jugo de manzana pre-caliente(Tabla 1) a 25oC durante la noche.
      NOTA: Esto es necesario para la puesta en escena adecuada de embriones. Si las placas se están secando rápidamente, agregue un recipiente con agua a la incubadora para aumentar la humedad de la cámara.
   3. Anestetiza las moscas del paso 1.1.1 con CO₂ y transfiere las moscas a una jaula de recolección. Coloque un plato de agar jugo de manzana precalentado con un pequeño frotis de pasta de levadura en el extremo abierto y asegúrelo a la jaula con la manga roja(Tabla de materiales). Con el fin de limpiar embriones más viejos, permita que las moscas pongan embriones/huevos en una placa de agar jugo de manzana durante 1 h a 25 oC.
   4. Retire la jaula de recogida de la incubadora. Invierta el lado de la malla de la jaula hacia abajo y toque las moscas hacia abajo hasta la parte inferior de la jaula. Sustituya el agar jugo de manzana por un nuevo plato de agar de jugo de manzana precalentado con un pequeño frotis de pasta de levadura. Deseche el primer plato.
   5. Dejar que las moscas pongan embriones/huevos en la nueva placa de agar jugo de manzana durante 1 h a 25 oC. Deseche esta placa después de la recolección de 1 h y continúe con el siguiente paso para recoger embriones inyectables.
   6. Para recoger embriones de etapa tardía 17 (20-21 h AEL), permita que las moscas del genotipo deseado de los pasos 1.1.1-1.1.5 se acosten sobre una nueva placa de agar de jugo de manzana precalentada con un pequeño frotis de pasta de levadura a 25 oC durante 1 h. Placa de edad para 19 h en una incubadora de 25 oC , por lo que los embriones serán de 20 a 21 h de edad en el momento de la toma de imágenes.
      NOTA: Este paso se puede repetir según se desee para múltiples rondas de recolección de muestras, inyección e imágenes.
   7. Recoger embriones de placas en un colador de células con malla de nylon de 70 m mediante la adición de solución salina tamponada de fosfato (PBS) con 0.1% tensioactivo no iónico (PBTx; Tabla 1) para cubrir la superficie de la placa y aflojar embriones de la superficie usando un pincel.
   8. Embriones dechorionatos recogidos en el colador celular en una solución de lejía al 50%(Tabla 1) en una placa Petri de 100 mm durante 5 min con agitación ocasional a temperatura ambiente. Enjuague los embriones 3 veces girando el colador celular en PBTx en una placa Petri, usando un plato fresco de PBTx cada vez.
   9. Si todos los embriones son del genotipo correcto, proceda directamente al paso 1.1.10. Si la generación de embriones del genotipo correcto requiere una cruz con moscas heterocigotas, seleccione embriones del genotipo correcto utilizando la presencia o ausencia de cromosomas equilibradores marcados fluorescentesmente. Utilice un estereomicroscopio con capacidades fluorescentes para la selección de genotipos.
      NOTA: Cromosomas equilibradores marcados con proteína fluorescente amarilla deformada; Kruppel-Gal4, proteína fluorescente verde UAS (GFP); y twist-Gal4, UAS-GFP funcionan bien para la selección del genotipo en la embriogénesis tardía(Tabla 2)^24,25,26.
   10. Utilizando una pipeta de vidrio, transfiera embriones en PBTx a una losa de gel de agarosa del 2% (Tabla 1). Retire el exceso de líquido con papel de filtro. Alinee los embriones de 6 a 8 en la losa de gel de agarosa del 2% con el lado posterior a la derecha y dorsal hacia arriba(Figura 1B).
       NOTA: El micropyle, el pequeño orificio a través del cual los espermatozoides entran en el óvulo, se encuentra en el extremo anterior del embrión. El extremo posterior es más redondeado. La tráquea aparece blanca y se encuentra dorsalmente en el embrión, permitiendo la distinción de los lados dorsal y ventral del embrión(Figura 1B).
   11. Prepare una diapositiva con una pieza de cinta adhesiva de doble cara. Presione firmemente la diapositiva en la parte superior de los embriones para transferirlos a la cinta de doble cara.
   12. Desecar embriones por incubación a temperatura ambiente por 25 min (no se utiliza desecante). Después de la desecación, cubrir los embriones con aceite de halocarbon.
       NOTA: Los períodos de desecación pueden variar dependiendo de la temperatura, la humedad y la ventilación en la habitación. El período de incubación debe utilizarse para configurar el aparato para inyección y el microscopio confocal para la toma de imágenes, tal como se describe en las secciones 2 y 3 de este protocolo.
2. Colección larval
   1. Establecer una cruz con 5 x 10 moscas hembra vírgenes del genotipo deseado y la mitad de machos del genotipo deseado en un vial con alimentos de harina de maíz-agar e incubar a 25 oC²³.
   2. Después de 5 a 7 días, dependiendo del genotipo, recoger las larvas de tercera estrella errantes del vial suavemente con fórceps. Enjuague las larvas en 1x PBS para eliminar los alimentos pegados a las larvas. Transfiera las larvas a una placa de agar jugo de manzana para el genotipado como se describe en el paso 1.1.9 si es necesario.
   3. Enrolle las larvas sobre un pañuelo usando un pincel para secarlas. Transfiera 6 a 8 larvas a un portaobjetos preparado con cinta adhesiva de doble cara con fórceps.

2. Preparación de agujas e inyección de especímenes

1. Tire de las agujas de un tirador de micropipeta antes del inicio de este protocolo. Asegure los tubos capilares en el tirador de la aguja y tire de acuerdo con la forma estándar de la aguja y los parámetros para las inyecciones de D. melanogaster (Tabla 3)²⁷. Almacene las agujas en un plato de Petri anclando en arcilla hasta su uso para inyección.
2. Cargue una aguja con 5 l de 10 kDa de dextran conjugado con cloruro ácido sulforhodamine 101(Tabla de materiales) utilizando una punta de pipeta de carga en gel de 20 l durante el período de desecación de 25 minutos para embriones (paso 1.1.12), o inmediatamente después de la transferencia de larvas al portaobjetos (paso 1.2.3).
3. Cargue la aguja en un soporte de aguja y colóquela en un micromanipulador fijado a una base de acero(Tabla de materiales).
   NOTA: La aguja debe ser casi paralela a la etapa del microscopio para la inyección de embriones y en ángulo ligeramente hacia abajo para las inyecciones de larvas.
4. Ajuste el aparato de inyección(Tabla de materiales)a 50 psi, 5 x 10 ms con un rango de 10.
   NOTA: Puede ser necesario modificar estos ajustes para el aparato de inyección en particular que se está utilizando.
5. Coloque la corredera en el escenario y el borde del cepillo de la aguja contra el borde de la cinta de doble cara en un ángulo de 45o para crear una punta en ángulo rota.
   NOTA: Para los embriones sólo es necesario romper la punta lo suficiente como para permitir el flujo del dextran de 10 kDa. Una aguja perfecta tiene una punta ligeramente inclinada y sólo una pequeña gota de tinte saldrá con cada inyección. Para las larvas, es necesario romper más la punta, pero con una punta en ángulo para penetrar en la pared del cuerpo larvario. Una gota más grande de tinte saldrá.
6. Bombee el pedal hasta que el tinte esté en la punta de la aguja.
7. Alinee la aguja de modo que sea paralela con el embrión o en ángulo ligeramente hacia abajo hacia la larva.
8. Mueva la aguja para perforar el extremo posterior de la muestra e inyecte la muestra bombeando el pedal. Inyectar 2 nL de tinte en embriones, y 220 nL de tinte en larvas.
   NOTA: El embrión o larva debe inundarse con tinte si la inyección es exitosa.
9. Tenga en cuenta el tiempo de inyección para fines de incubación. Incubar embriones durante 10 min a temperatura ambiente. Incubar larvas durante 30 min a temperatura ambiente.
10. Continúe por el portaobjetos para inyectar muestras adicionales, observando el tiempo de inyección de cada espécimen.
    NOTA: Dependiendo de la velocidad con la que se pueden realizar los pasos posteriores de disección e imágenes, se pueden inyectar 4 a 8 muestras a la vez.

3. Preparación de muestras para imágenes

1. Imágenes de embriones
   1. Después de la inyección, prepare embriones para la toma de imágenes. Aplique vaselina con un aplicador con punta de algodón en los lados derecho e izquierdo de las muestras en el portaobjetos como espaciador para evitar daños a los embriones al colocar la cubierta.
   2. Muestras de imagen utilizando un microscopio confocal a lo largo de la profundidad del embrión con un objetivo de 20x. Calcular el porcentaje de muestras totales con tinte observado en el cordón del nervio ventral (VNC) utilizando la siguiente ecuación: % de muestras con BBB comprometida - Número de muestras con acumulación de tinte en el VNC/número total de muestras ensayadas.
2. Disección e imágenes de larvas
   1. Prepare diapositivas para muestras larvales con anticipación. Monte dos cubiertas espaciadas aproximadamente 0,5 cm de distancia a la diapositiva con esmalte de uñas.
      NOTA: Los cubreobjetos funcionan como espaciadores para el cerebro, por lo que no se daña durante el proceso de montaje.
   2. Después de la incubación de 30 minutos, diseccionar las larvas en 1x PBS directamente en el portaobjetos que se utilizará en la toma de imágenes. Primero, usa un par de fórceps para agarrar la larva hasta la mitad del cuerpo larvario, y usa un segundo par de fórceps para separar las mitades anterior y posterior de la larva.
   3. A continuación, usa un par de fórceps para agarrar la región anterior en los ganchos de la boca, y usa un segundo par de fórceps para invertir la pared del cuerpo sobre la punta de los fórceps agarrando los ganchos de la boca. El cerebro y el VNC estarán expuestos.
   4. Separe el cerebro y el VNC de la pared del cuerpo separando los nervios y retire la pared del cuerpo de la diapositiva(Figura 1C,D). Retire los discos imaginables si lo desea.
   5. Cubra la muestra con 10 ml de glicerol al 80% y coloque un cubreobjetos encima de la muestra para obtener imágenes.
   6. Imagen a través de la profundidad del tejido del sistema nervioso utilizando un objetivo 20x. Calcular el porcentaje de muestras totales con tinte observado en el VNC.

Resultados

Los métodos descritos aquí permiten la visualización de la integridad del BBB en todo el SNC en embriones y larvas de D. melanogaster (Figura 1). Una vez completada la formación de BBB en la embriogénesis tardía, el BBB funciona para excluir moléculas grandes del cerebro y VNC⁵. Este protocolo aprovecha esta función para probar la formación BBB. Cuando se inyectaron embriones de tipo salvaje (Oregon R) en etapa tardía 17 (20-21 h de edad) con 10 kDa...

Discusión

Este protocolo proporciona una descripción completa de los pasos necesarios para el ensayo para la integridad de BBB durante las etapas larantes de D. melanogaster de D. melanogaster. Se han descrito enfoques similares en otros lugares para probar la integridad del BBB durante el desarrollo, así como en las etapas adultas^5,7,29,30. Sin embargo, las descripciones de los procedimientos...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran	ThermoFisher Scientific	D1863	Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL.
20 μL Gel-Loading Pipette Tips	Eppendorf	22351656
100% Ethanol (200 proof)	Pharmco-Aaper	11000200
Active Dry Yeast	Red Star
Agar	Fisher Scientific	BP1423
Agarose	Fisher Scientific	BP160-500
Air Compressor	DeWalt	D55140
Apple Juice	Mott's Natural Apple Juice
Bleach	Household Bleach		1-5% Hypochlorite
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100F-4
Bottle Plugs	Fisher Scientific	AS-277
Cell Strainers	BD Falcon	352350
Confocal Microscope	Olympus	FV1000	Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75)
Cotton-Tipped Applicator	Puritan	19-062614
Double-Sided Tape 1/2"	Scotch
Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 x .01 mm Tip	Roboz	RS-5015
Fly Food Bottles	Fisher Scientific	AS-355
Fly Food Vials	Fisher Scientific	AS-515
Foot Pedal	Treadlite II	T-91-S
Gel Caster	Bio-Rad	1704422
Gel Tray	Bio-Rad	1704436
Glass Pipette	VWR	14673-010
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-1
Granulated sugar			Purchased from grocery store.
Halocarbon Oil	Lab Scientific, Inc.	FLY-7000
Light Source	Schott	Ace I
Manipulator Stand	World Precision Instruments	M10
Micromanipulator	World Precision Instruments	KITE-R
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Needle Holder	World Precision Instruments	MPH310
Nightsea Filter Sets	Electron Microscopy Science	SFA-LFS-CY	For visualization of YFP
Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head	Electron Microscopy Science	SFA-RB	For visualization of GFP
Paintbrush	Simply Simmons	Chisel Blender #6
Pipetter	Fisher Scientific	13-683C
Pneumatic Pump	World Precision Instruments	PV830	This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative.
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-500
Potassium Phosphate Dibasic	Fisher Scientific	BP363-500
Small Embryo Collection Cages	Genesee Scientific	59-100
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-212
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	Fisher Scientific	BP332-500
Steel Base Plate	World Precision Instruments	5052
Stereomicroscope	Carl Zeiss	Stemi 2000	Used for tissue dissection.
Stereomicroscope with transmitted light source	Baytronix		Used for injection.
Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester)	Genesee Scientific	20-258
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500	Nonionic surfactant
Vial Plugs	Fisher Scientific	AS-273