Ensayo basado en puntos claros para el análisis de la fototaxis larval de Drosophila

Resumen

Este protocolo introduce un ensayo de punto ligero para investigar el comportamiento fototáctico larvario de Drosophila. En este ensayo, se genera un punto de luz como estimulación de la luz, y el proceso de evitación de la luz larval es registrado por un sistema de imágenes basado en luz infrarroja.

Resumen

Las larvas de Drosophila melanogaster muestran un comportamiento evidente que evita la luz durante la etapa de forrajeo. Drosophila fototaxis larval se puede utilizar como modelo para estudiar el comportamiento de evitación animal. Este protocolo introduce un ensayo de punto de luz para investigar el comportamiento fototáctico larvario. La configuración experimental incluye dos partes principales: un sistema de estimulación visual que genera el punto de luz y un sistema de imágenes basado en luz infrarroja que registra el proceso de evitación de la luz larval. Este ensayo permite el seguimiento del comportamiento de la larva antes de entrar, durante el encuentro y después de salir del punto de luz. Los detalles del movimiento larvario, incluyendo la desaceleración, la pausa, la fundición de la cabeza y el torneado, se pueden capturar y analizar utilizando este método.

Introducción

Las larvas de Drosophila melanogaster muestran un comportamiento evidente que evita la luz durante la etapa de forrajeo. Drosophila larval phototaxis ha estado bajo investigación, especialmente en los últimos 50 años^{1,2,3,4,5,6,7 ,8}. En los últimos años, a pesar de que 1) muchas neuronas que median la evitación de la luz larval han sido identificadas^{4,5,9,10,11,12} y 2) el conectomotor completo del sistema visual larvaria a la resolución de las sinapsis se ha establecido¹³, los mecanismos neuronales subyacentes a la fototaxis larvaria siguen siendo en gran medida poco claros.

Se han utilizado varios ensayos conductuales para estudiar la fototaxis larvarios. Se pueden dividir en gran medida en dos clases: una que involucra gradientes de luz espacial y la otra que implica gradientes de luz temporales. Para ensayos de gradiente de luz espacial, la arena se divide en el mismo número de secciones en luz y oscuridad. La arena se puede dividir en mitades claras y oscuras^2,4 o cuadrantes claros y oscuros^14,15, o incluso se puede separar en cuadrados alternativos de luz y oscuridad como en un tablero de ajedrez^7. Por lo general, las placas de agar se utilizan para el ensayo de gradiente de luz espacial, pero los tubos que se dividen en secciones alternas de luz y oscuridad también se pueden utilizar^10,14.

En la versión anterior de ensayos, la iluminación ligera generalmente se origina desde debajo de las larvas. Sin embargo, la iluminación en versiones más recientes se origina en gran medida desde arriba, ya que los ojos larvarios (por ejemplo, los órganos de Bolwig que son sensibles a intensidades de luz bajas o medias¹⁶⁾están contenidos en el esqueleto cefalofaríngeo opaco con aberturas hacia el frente superior. Esto hace que las larvas sean más sensibles a la luz desde las direcciones frontales superiores que desde abajo detrás de las direcciones^7. Para los ensayos de gradiente de luz temporal, la intensidad de la luz es espacialmente uniforme en la arena, pero la intensidad cambia con el tiempo. Además de la luz de onda cuadrada temporal (es decir, luz intermitente encendida/apagada o fuerte/débil^3,7), la luz que varía temporalmente que se ajusta a una rampa lineal en intensidad también se utiliza⁸ para medir la sensibilidad de las larvas a una temporalmente cambiante estímulo de la luz.

Un tercer tipo de ensayo de fototaxis es la navegación de paisaje de luz direccional, que implica la iluminación desde arriba en un ángulo de 45o⁷. Antes del trabajo de Kane et al.⁷, sólo se calcularon parámetros gruesos como el número de larvas en las regiones claras y oscuras, la frecuencia de giro y la longitud del sendero en ensayos de fototaxis larvarios. Desde el trabajo de este mismo grupo, con el análisis de registro de vídeo de alta resolución temporal para fototaxis larvarios, dinámica detallada del movimiento larvario durante la fototaxis (es decir, velocidades instantáneas de diferentes partes del cuerpo larvario, dirección de rumbo, ángulo de giro y la velocidad angular correspondiente) se han analizado⁷. Por lo tanto, más detalles del comportamiento de la fototaxis larval han sido capaces de ser descubiertos. En estos ensayos, las larvas se prueban en grupos para que no se excluyan los efectos de grupo.

Este protocolo introduce un ensayo de punto de luz para la investigación de las respuestas conductuales larvales a la estimulación lupita individual. La configuración experimental principal consiste en un sistema de estimulación visual y un sistema de imágenes basado en luz infrarroja. En el sistema de estimulación visual, una fuente de luz LED genera un punto de luz redondo de 2 cm de diámetro en una placa de agar, donde se prueba la larva. La intensidad de la luz se puede ajustar mediante un controlador LED. El sistema de imágenes incluye una cámara infrarroja que captura el comportamiento de la larva, además de tres LED infrarrojos de 850 nm que proporcionan iluminación para la cámara. La lente de la cámara está cubierta por un filtro de paso de banda de 850 nm para impedir que la luz del sistema de estimulación visual entre en la cámara, mientras que la luz infrarroja puede entrar en la cámara. Por lo tanto, se previene la interferencia de la estimulación visual en la toma de imágenes. En este ensayo, se registran y analizan los detalles de comportamiento de las respuestas rápidas de las larvas individuales dentro de un período que incluye antes, durante y después de entrar en la luz.

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Protocolo

1. Preparación de larvas de Drosophila

1. Preparar un medio estándar que consista en harina de maíz hervida (73 g), agar (5,6 g), harina de soja (10 g), levadura (17,3 g), jarabe (76 ml) y agua (1000 ml).
2. Levante todas las moscas a 25 oC en un medio estándar en una habitación con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h.

2. Preparación de placas de agar

1. Prepare una solución de agar del 1,0%. Pesar 3 g de agar en un vaso de precipitados de 500 ml con una balanza, luego añadir 300 ml de agua destilada. Coloque un papel de papel de aluminio sobre el disyuntor para evitar que el agua se evapore. Calienta el vaso de precipitados en un microondas para hervir.
2. Saque el vaso de precipitados y revuelva bien con una varilla de vidrio, luego caliente en un horno de microondas para hervir. Repita hasta que el líquido esté completamente transparente y fluido.
   NOTA: La solución final de agar caliente debe estar libre de burbujas de aire; de lo contrario, verter el agar en la placa dará lugar a una superficie desigual y abotonada de la placa de agar, lo que afectará las pruebas posteriores de comportamiento larvario. La concentración de la solución de agar no debe ser demasiado alta o baja. Si la concentración es demasiado alta, la reflexión difusa de la luz en la placa de agar será fuerte y manchará el límite de luz/oscuridad. Si la concentración es demasiado baja, las larvas dejarán rastros en la placa. Ambos errores obstaculizarán el procesamiento de vídeo más adelante en el protcol.
3. Vierta lentamente la solución de agar caliente en una placa Petri (diámetro 15 cm) hasta que la parte inferior esté uniformemente cubierta con una capa de agar (4 mm de espesor) y enfríe a temperatura ambiente (RT) hasta que la solución de agar se solidifique.
4. La placa de agar se debe utilizar cuando esté recién preparada. Si no es así, vierta una capa de agua sobre la superficie y guárdela en el refrigerador a 4 oC para su uso posterior.

3. Configuración del sistema de estimulación visual

1. Seleccione la fuente de luz LED: luz azul LED colimada a 470 nm o luz blanca cálida.
   NOTA: La fuente de luz se puede reemplazar con luz LED de cualquier otra longitud de onda. En este experimento, el LED de luz azul se utiliza como ejemplo.
2. Enrolle una gruesa pieza de papel de aluminio o cartón negro (asegurar la opacidad) para formar un cilindro abierto de 12 cm de longitud con un diámetro similar al del LED de luz azul con un diámetro de 3 cm. Deje que el extremo superior del cilindro cubra el extremo frontal del LED de luz azul. Cubra el extremo inferior con un cartón negro con un pequeño agujero redondo (0,5 cm de diámetro) en el centro. Esto constituye la configuración del sistema de fuente de luz.
3. Fije la fuente de luz preparada en el marco de hierro con un clip, asegurándose de que la luz LED se proyecta hacia abajo hacia el escritorio. Incline ligeramente el cilindro. El ángulo entre el plano del cilindro y el plano vertical es de unos 10o (consulte la figura 1). Conecte la luz LED azul de 470 nm al enchufe "LED1" del controlador LED de alta potencia. Encienda el controlador, gire la perilla en la esquina superior derecha del controlador para seleccionar el canal 470 nmy, a continuación, haga clic en LED. A continuación, cuando la pantalla muestre "A", aparecerá un punto de luz azul en el escritorio.
   NOTA: Si el cilindro pierde luz además del pequeño orificio redondo, se recomienda utilizar cinta negra en las piezas con fugas para asegurarse de que solo el orificio puede pasar luz.
4. Haga clic en Aceptar y gire la perilla para ajustar la intensidad de la luz. Gire la perilla a una intensidad de luz más alta de 50 mA. Mida y registre el espectro de la luz con un espectrómetro.
5. Mueva la posición de la fuente de luz hacia arriba y hacia abajo para ajustar el diámetro del punto de luz a 2 cm. El escritorio debe ser negro para un mejor efecto de contraste.
6. Gire la perilla para elegir la intensidad de la luz de acuerdo con las necesidades experimentales. Utilice una consola de medidor de potencia compacta con un sensor de potencia de fotodiodo estándar para medir la potencia de luz máxima y mínima en el lugar, grabarla, medir tres veces y tomar el valor promedio.
   NOTA: Se recomienda utilizar un sensor de potencia de fotodiodo para medir la intensidad de la luz para la luz de una longitud de onda específica y utilizar un sensor de potencia térmica para medir la intensidad de la luz blanca.
7. Calcule la intensidad de la luz en el punto de luz dividiendo la potencia de luz medida por el área del sensor.
   NOTA: Por ejemplo, si la potencia de luz medida en el paso 2.6 es de 20 pW y el área del sensor es de 0,81 mm², la intensidad de la luz es de 24,69 pW/mm² (dividiendo 20 pW por 0,81 mm²).

4. Configuración del sistema de imágenes

1. Sujete una cámara web de alta resolución con un clip de hierro, a unos 10 cm por encima del punto de luz en el escritorio(Figura 1).
2. Ajuste la orientación de la lente de la cámara hacia el escritorio. Conecte la cámara a un ordenador a través de una interfaz USB.
3. Coloque una placa de agar en el escritorio justo debajo de la cámara.
4. Abra el software "Amcap9.22" en el equipo con Windows 7, y el punto de luz se mostrará automáticamente en la ventana de AMcap. Mueva la cámara ligeramente a la izquierda o a la derecha para asegurarse de que el punto de luz esté cerca del centro de la ventana. Asegúrese de que la cámara no bloquee la trayectoria de la luz. El punto de luz debe ser completo y redondo.
   NOTA: El software se puede encontrar en http://amcap.en.softonic.com/.
5. Fije un filtro de paso de banda de 850 nm a 3 nm con un clip de 5-7 mm justo debajo de la cámara.
   NOTA: El diámetro del filtro es de unos 2,5 cm, y la lente de la cámara es de menos de 1 cm de diámetro, por lo que el filtro puede cubrir el campo visual de la cámara. Con el filtro debajo de la cámara, el punto de luz no debe verse en la ventana de AMcap.
6. Coloque tres LED de generación de luz infrarroja (longitud de onda central a 850 nm) uniformemente alrededor de la placa de agar. Cada LED debe estar a unos 5 cm del borde de la placa de agar, y la cara de la lente del LED debe estar en un ángulo de 70o hacia abajo hacia la placa de agar. Conecte los LED a la alimentación a través del convertidor de CA a CC.
   NOTA: Es mejor fijar las posiciones y ángulos de los LED de luz infrarroja para garantizar la consistencia del brillo del campo en varios ensayos experimentales y facilitar el procesamiento de vídeo posterior.
7. Coloque una placa negra entre el ordenador y el dispositivo. Establezca el brillo de la pantalla del ordenador para evitar que la luz de la pantalla del ordenador afecte al experimento.
   NOTA: Mantenga el entorno oscuro al medir la longitud de onda o la intensidad de la luz.

5. Ajuste de los parámetros de la imagen

1. En el menú del software aMcap, elija Options (Opciones) Dispositivo de vídeo (Video Device) Capturar formatoy establecer el tamaño de píxel del vídeo capturado en 800 x 600 y la velocidad de fotogramas en 60 fps.
2. Retire el filtro de debajo de la cámara, coloque una regla debajo de la cámara y ajuste el enfoque de la cámara para que la línea de escala sea clara y paralela al ancho del campo de visión de vídeo.
3. Haga clic en Capturar (Capture) Configurar ? Captura de vídeo para seleccionar la ruta de guardado, haga clic en Iniciar grabación, registre la distancia real correspondiente a 600 píxeles y calcule la proporción de cada píxel con la distancia real.

6. Grabación de vídeo del comportamiento de evitación de la luz

1. Mantener una temperatura de 25,5 oC a través de todos los experimentos. Controle la temperatura ambiente con un aire acondicionado si es necesario. Mantenga la humedad constantemente en el 60% con un humidificador.
2. Tome un breve video de la posición del punto de luz llamada "lightarea1". A continuación, mueva el filtro de 850 nm a 3 nm hacia atrás para cubrir la lente de la cámara.
   NOTA: Al registrar el comportamiento larvario, la lente de la cámara está cubierta por el filtro de 850 nm a 3 nm para que el punto de luz no se muestre en el vídeo. El punto de luz se puede reconstruir en vídeos con larvas más tarde con Matlab. No cambie la posición de la cámara y evite cambiar la relación de cada píxel con la distancia real medida en el paso 4.3.
3. Encienda una luz (es decir, una luz de la habitación) lejos del dispositivo experimental. Baja la luz lo más bajo posible, siempre y cuando las larvas se puedan ver claramente con los ojos. Saque las larvas del medio de cultivo con una cuchara, escoja suavemente una larva de tercera estrella y lávela con agua destilada. Tenga cuidado de lavar la larva de una en una para evitar interferencias por el hambre. Un solo experimento requiere al menos 20 larvas.
4. Transfiera la larva al centro de la placa de agar colocada debajo de la cámara durante el paso 3.3. Retire suavemente el exceso de agua de la larva con un cepillo o utilice papel hinchado para eliminar el agua de la larva para evitar el reflejo de la luz debajo de la lente. Apague la luz de la habitación y permita que la larva se aclimate durante 2 minutos en el ambiente oscuro.
5. Encienda la luz LED para generar luz infrarroja y cepille suavemente la larva al centro de la placa. Cuando la larva comience a arrastrarse recto, gire la placa para hacer que la larva se dirija hacia el punto de luz. Asegúrese de que se rastrea directamente desde el principio, o de lo contrario puede que no obtenga acceso al punto de luz.
6. Haga clic en Capturar (Capture) Configurar ? Captura de vídeo para seleccionar la ruta de guardado y, a continuación, haga clic en Iniciar grabación para grabar. Deje que la larva se arrastre hacia el punto de luz, entre en el punto de luz, luego deje el punto de luz hasta que esté casi fuera del campo de visión. Haga clic en Detener grabación. Si la larva se aleja del punto de luz antes de acercarse, haga clic directamente en Detener grabación.
7. Aleje el filtro de la cámara. Tome un breve vídeo de la posición del punto de luz llamado "lightarea2" y compárelo con "lightarea1" para asegurarse de que la posición del punto de luz no se cambia. Si se observa un cambio de posición obvio, deseche los datos.

7. Análisis de datos

1. Utilice SOS¹⁷ para extraer parámetros de movimiento y contorno corporal animal de vídeos utilizando métodos de procesamiento de imágenes como se describió anteriormente¹⁷.
   NOTA: Se utilizaron parámetros como headSpeed (velocidad de la cabeza larval), velocidad de cola (velocidad de la cola larval), midSpeed (velocidad del punto medio larvario de la línea del esqueleto) y cmSpeed (velocidad del centroide larvario) para medir la velocidad de movimiento larvario. Parámetros como headTheta (el ángulo entre las líneas de punta media y media cola) y headOmega (la velocidad cambiante de headTheta) se utilizaron para medir la flexión del cuerpo larvario y la velocidad angular de flexión.

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Resultados

De acuerdo con el protocolo, el ensayo de punto de luz se utilizó para investigar el comportamiento de evitación de la luz de la larva de tercera estrella que se elevó a 25 oC en un medio estándar en una habitación con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h. Una sola larva w¹¹¹⁸ fue probada usando el ensayo de punto de luz a 25,5 oC. La intensidad lumínica media del punto de luz generado por un LED de 460 nm fue de 0,59 W/cm^2. Todo el proceso de entrada y salida larval del punto de l...

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Discusión

Este protocolo presenta el ensayo de punto ligero para probar la capacidad de las larvas de Drosophila para escapar de la luz. Este ensayo permite el seguimiento del comportamiento de las larvas antes de entrar, durante el encuentro y después de salir de un punto de luz. Los detalles del movimiento larvario pueden ser capturados y analizados. El ensayo de punto de luz es muy simple y posee una fuerte practicidad. El costo de todo el dispositivo no es alto. En el experimento, la luz LED se utiliza como fuente de...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED	Thorlabs, USA	PM100A	Compatible Sensors: Photodiode and Thermal Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz Bandwidtha: DC-100 kHz Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V
AC to DC converter	Thorlabs, USA	S120VC	Aperture Size: Ø9.5 mm Wavelength Range: 200-1100 nm Power Range: 50 nW-50 mW Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) Linearity: ±0.5% Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm)
band-pass filter	Thorlabs, USA	DC2100	LED Current Range: 0-2 A LED Current Resolution: 1 mA LED Current Accuracy: ±20 mA LED Forward Voltage: 24 V Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave Modulation: Arbitrary
Collimated LED blue light	ELP, China	USBFHD01M	Max. Resolution: 1920X1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710
Compact power meter console	Ocean Optics, USA	USB2000+(RAD)	Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Weight: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) Wavelength range: 200-850 nm Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical) Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) Dark noise: 50 RMS counts Grating: 2 (250 – 800 nm) Slit: SLIT-50 Detector collection lens: L2 Order-sorting: OFLV-200-850 Optical resolution: ~2.0 nm FWHM Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber
High-Power LED Driver	Minhongshi, China	MHS-48XY	Working voltage: DC12V Central wavelength: 850nm
high-resolution web camera	Thorlabs, USA	MWWHL4	Color: Warm White Correlated Color Temperature: 3000 K Test Current for Typical LED Power: 1000 mA Maximum Current (CW): 1000 mA Bandwidth (FWHM): N/A Electrical Power: 3000 mW Viewing Angle (Full Angle): 120? Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: >50 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group
LED Warm White	Mega-9, China	BP850/22K	Ø25.4(+0~-0.1) mm Bandwidth: 22±3nm Peak transmittance:80% Central wavelength: 850nm±3nm
Spectrometer	Noel Danjou	Amcap9.22	AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.
Standard photodiode power sensor	Super Dragon, China	YGY-122000	Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Output: DC 12V 2A
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	M470L3-C1	Color: Blue Nominal Wavelengtha: 470 nm Bandwidth (FWHM): 25 nm Maximum Current (CW): 1000 mA Forward Voltage: 3.2 V Electrical Power (Max): 3200 mW Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: 100 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	S401C	Wavelength range: 190 nm-20 μm Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb) Input aperture size: Ø10 mm Active detector area: 10 mm x 10 mm Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) Linearity: ±0.5%