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  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

El protocolo describe el cultivo de biopelículas entre reinos consistentes en Candida albicans y Streptococcus mutans y presenta un método basado en microscopía confocal para el monitoreo del pH extracelular dentro de estas biopelículas.

Resumen

Las biopelículas entre reinos que consisten en células fúngicas y bacterianas están involucradas en una variedad de enfermedades bucales, como infecciones endodónticas, periodontitis, infecciones mucosas y, sobre todo, caries en la primera infancia. En todas estas condiciones, el pH en la matriz de biopelícula afecta las interacciones microbio-huésped y, por lo tanto, la progresión de la enfermedad. El presente protocolo describe un método basado en microscopía confocal para monitorear la dinámica de pH dentro de biopelículas entre reinos que comprenden Candida albicans y Streptococcus mutans. El espectro de doble emisión dependiente del pH y las propiedades de tinción de la sonda ratiométrica C-SNIF-4 se explotan para determinar las caídas de pH en áreas extracelulares de las biopelículas. El uso de la ratiometría de pH con la sonda requiere una elección meticulosa de parámetros de imagen, una calibración exhaustiva del tinte y un procesamiento posterior cuidadoso y basado en umbrales de los datos de la imagen. Cuando se utiliza correctamente, la técnica permite la evaluación rápida del pH extracelular en diferentes áreas de una biopelícula y, por lo tanto, el seguimiento de los gradientes de pH horizontales y verticales a lo largo del tiempo. Mientras que el uso de microscopía confocal limita el perfilado Z a biopelículas delgadas de 75 m o menos, el uso de ratiometría de pH es ideal para el estudio no invasivo de un factor de virulencia importante en biopelículas entre reinos.

Introducción

Las biopelículas entre reinos que comprenden especies fúngicas y bacterianas están involucradas en varias condiciones patológicas en la cavidad oral. Candida spp. se han aislado con frecuencia de infecciones endodónticas1 y de lesiones periodontales2,3. En las infecciones mucosas, se ha demostrado que las especies estreptocócicas del grupo de mitis mejoran la formación de biopelículas fúngicas, la invasión de tejidos y la diseminación tanto en los modelos in vitro como murinos4,5,6,7. Lo más interesante es que el transporte oral de Candida spp. ha demostrado estar asociado con la prevalencia de caries en niñosde 8años. Como se muestra en los modelos de roedores, una relación simbiótica entre Streptococcus mutans y Candidas albicans aumenta la producción de polisacáridos extracelulares y conduce a la formación de biopelículas más gruesas y cariogénicas9,10.

En todas las condiciones antes mencionadas, la caries de la primera infancia en particular, el pH de biopelícula es importante para la progresión de la enfermedad, y el papel eminente de la matriz de biopelículas para el desarrollo de microambientes acidogénicos11 requiere metodologías que permitan estudiar los cambios de pH dentro de las biopelículas entre reinos. Se han desarrollado enfoques simples y precisos basados en microscopía confocal para controlar el pH dentro de las biopelículas bacterianas12 y13 fúngicas. Con el tinte ratiométrico C-SNARF-4 y el postprocesamiento de imágenes basado en umbrales, el pH extracelular se puede determinar en tiempo real en las tres dimensiones de un biofilm14. En comparación con otras técnicas publicadas para el monitoreo de pH basado en microscopía en biopelículas, la ratiometría de pH con C-SNARF-4 es simple y barata, ya que no requiere la síntesis de partículas o compuestos que incluyan un tinte de referencia15 o el uso de la excitación de dos fotones16. El uso de un solo tinte evita problemas con la compartimentación de la sonda, el sangrado fluorescente y el blanqueo selectivo16,17,18, al tiempo que permite una diferenciación fiable entre el pH intra y extracelular. Finalmente, la incubación con el tinte se realiza después del crecimiento del biofilm, lo que permite estudiar tanto biopelículas cultivadas en laboratorio como in situ.

El objetivo del presente trabajo es ampliar el uso de la ratiometría de pH y proporcionar un método para estudiar los cambios de pH en las biopelículas entre reinos. Como prueba de concepto, el método se utiliza para monitorear el pH en biopelículas de dos especies compuestas por S. mutans y C. albicans expuestos a la glucosa.

Protocolo

El protocolo para la recolección de saliva fue revisado y aprobado por el Comité de ética del condado de Aarhus (M-20100032).

1. Cultivo de Biopelículas entre reinos

  1. Cultivar S. mutans DSM 20523 y C. albicans NCPF 3179 en placas de agar en sangre a 37 oC en condiciones aeróbicas.
  2. Transfiera colonias individuales de cada organismo a tubos de ensayo llenos de 5 ml de infusión cardíaca cerebral (BHI). Crecer durante 18 h en condiciones aeróbicas a 37oC.
  3. Centrifugar los cultivos nocturnos a 1.200 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante, resuspenda las células en salina fisiológica y ajuste la DO550 nm a 0,5 para C. albicans (107 células/ml) y S. mutans (108 celdas/ml). Diluir la suspensión de S. mutans 1:10 con solución salina fisiológica estéril (107 células/ml).
  4. Pipetear 50 l de solución salival estéril, preparada según el método de Jong et al.19, en los pozos de una placa óptica inferior de 96 pocillos para microscopía. Incubar durante 30 min a 37oC. Lavar los pozos 3 veces con 100 ml de solución salina fisiológica estéril. Vacíe los pozos.
  5. Añadir 100 l de suspensión de C. albicans a cada poca. Incubar a 37oC durante 90 min. Lavar 3x con solución salina fisiológica estéril.
    NOTA:No vacíe los pozos completamente durante el lavado. Deje un depósito de 20 l para evitar fuerzas de cizallamiento excesivas.
  6. Añadir 100 ml de suero bovino fetal inactivado por calor (inactivado a 56 oC durante 30 min) a cada pocal. Incubar a 37oC durante 2 h. Lavar 3x con solución salina fisiológica estéril. Vacíe los pozos, dejando un depósito de 20 l.
  7. Añadir 100 l de suspensión de S. mutans (preparado en el paso 1.3) a cada poca. Añadir 150 s l de BHI que contenga 5% de sacarosa. Incubar a 37oC durante 24 h o más. Cuando se cultivan biopelículas más antiguas, cambie el medio diario a BHI fresco. Al final de la fase de crecimiento del biofilm entre reinos, lavar 5 veces con solución salina fisiológica estéril.

2. Imágenes de pH ratiométrica

NOTA:Las imágenes de pH de la relación de datos deben realizarse inmediatamente después de que se haya completado el crecimiento del biofilm.

  1. Para obtener imágenes de pH ratiométricas, utilice un microscopio de exploración láser confocal invertido con una lente de inmersión de agua o aceite de 63x, una línea láser de 543 nm y un sistema de imágenes espectrales (es decir, detector META) para permitir la toma de imágenes de señales fluorescentes superpuestas. Utilice una incubadora para calentar la etapa del microscopio a 35 oC.
  2. Ajuste el detector para asegurar la detección de fluorescencia verde de 576 a 608 nm y la detección simultánea de fluorescencia roja de 629 a 661 nm. Elija una potencia láser y ganancia apropiadas para evitar la sobreexposición y la subexposición.
    NOTA: La exposición de las imágenes se ve mejor en imágenes de paletas con coloración falsa.
  3. Establezca el tamaño del agujero en 1 unidad ventilada o una rebanada óptica de 0,8 m. Establezca el tamaño de la imagen en 512 x 512 píxeles y la velocidad de escaneado en 2. Elija un promedio de línea de 2, utilizando la opción media.
    NOTA:Al comienzo de una serie de experimentos, compruebe que la configuración del microscopio elegida proporciona un claro contraste entre las células bacterianas, las paredes celulares de hongos, la matriz de biopelícula y el citoplasma de hongos.
  4. Preparar 100 ml de solución salina fisiológica estéril que contenga 0,4% (p/v) de glucosa, valorada a pH 7. Preparar una solución en stock de C-SNARF-4 (1 mM en sulfóxido de dimetil). Añadir el tinte a una concentración final de 30 m.
    ADVERTENCIA: Use guantes de nitrilo al manipular el tinte ratiométrico.
  5. Vacíe uno de los pozos con una biopelícula entre reinos, dejando un depósito de 20 l. Añadir la solución salina estéril que contiene glucosa y el tinte ratiométrico. Coloque la placa de 96 pocillos en la etapa del microscopio y comience a tomar imágenes de la biopelícula.
  6. Adquirir imágenes individuales o pilas Z en diferentes lugares de la biopelícula. Marque la posición X-Y en el software del microscopio para seguir los cambios de pH en campos de visión particulares a lo largo del tiempo. A intervalos regulares, tome imágenes con el láser apagado para corregir el desplazamiento del detector.
  7. Repita los pasos 2.4–2.6 para el análisis de cada biopelícula cultivada en un pozo diferente.

3. Calibración del tinte ratiométrico

NOTA: La calibración del tinte y el ajuste de una curva de calibración se pueden realizar en un día diferente a la imagen de pH ratiométrica.

  1. Preparar una serie de 50 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES) tampón valorado a pH 4.0-7.8 en pasos de 0,2 unidades de pH a 35 oC. Pipetear 150 l de cada solución tampón en los pocillos de una placa óptica de 96 pocillos para microscopía.
  2. Añadir el tinte a los pozos llenos de tampón de la placa de 96 pocillos a una concentración final de 30 m. Deje equilibrar durante 5 min.
  3. Caliente la etapa del microscopio a 35 oC. Elija la misma configuración del microscopio que para las imágenes de pH ratiométricas. Coloque la placa de 96 pocillos en la etapa del microscopio. Concéntrese en la parte inferior de los pozos. Adquiera dos imágenes (canal verde y rojo) para todas las soluciones de búfer, 5 m por encima de la parte inferior del pozo. A intervalos regulares, tome imágenes con el láser apagado para corregir el desplazamiento del detector.
  4. Realice el experimento de calibración en triplicado.
  5. Exporte todas las imágenes como archivos TIF. Impórtelos en software de análisis de imágenes dedicado (es decir, ImageJ20). Restar las imágenes tomadas con el láser apagado de las imágenes respectivas de las soluciones de búfer haciendo clic en Proceso . Calculadora de imágenes ? Restar).
    NOTA: Si es necesario, recorte las imágenes para eliminar los artefactos en los bordes de la imagen mediante la realización de la selección rectangular con La imagen . Recortar.
  6. Divida las imágenes del canal verde a través de las imágenes del canal rojo y calcule las intensidades medias de fluorescencia en las imágenes resultantes haciendo clic en Analizar . Histograma.
  7. A partir de los experimentos triplicados, trazar las proporciones medias verde/roja contra el pH. Utilice un software dedicado para ajustar una función a los datos de calibración (es decir, MyCurveFit).

4. Análisis de imágenes digitales

NOTA:El análisis de imágenes digitales se puede realizar en cualquier momento después de la calibración del tinte y la imagen de pH ratiométrica.

  1. Almacene las imágenes de biofilm de canal verde y rojo en carpetas separadas y cambie el nombre de ambas series de archivos con números secuenciales (por ejemplo, GREEN_0001). Importe las imágenes en un software de análisis de imágenes dedicado (es decir, ImageJ). Haga clic en Analizar (Analizar) Histograma para determinar la intensidad media de la fluorescencia en las imágenes tomadas con el láser apagado y restar el valor de las imágenes de biopelícula haciendo clic en Proceso . Matemáticas ? Restar.
  2. Importe la serie de 2 imágenes en un software de análisis de imágenes dedicado (es decir, daime21). Realizar una segmentación basada en umbrales de las imágenes de canal rojo (Segmento ? Segmentación automática ? Umbral personalizado). Establezca el umbral "bajo" por encima de la intensidad de fluorescencia del citoplasma fúngico y el umbral "alto" por debajo de la intensidad de las paredes celulares de los hongos y las bacterias.
    NOTA:Cuando se han elegido los umbrales adecuados, solo se reconocen como objetos las áreas extracelulares.
  3. Transfiera la capa de objetos de la serie de imágenes segmentadas a la serie de imágenes de canal verde. Para ello, haga clic en Segmentar (Segment) Transferir capa de objetos.
    NOTA: Si el contraste entre las áreas extracelulares y el citoplasma fúngico es demasiado débil en los canales de color individuales, añada la serie de imágenes de canal verde a la serie de canales rojos antes de la segmentación haciendo clic en Editar . Calculadora de imágenes ? Adición. Realice la segmentación como se describe en 4.2 y transfiera la capa de objetos de la serie de imágenes segmentadas a la serie de imágenes de canal verde y rojo.
  4. Emplear el editor de objetos para eliminar píxeles que no sean de objeto en la serie de imágenes de canal rojo y verde (Visualizador . Editor de objetos ? En todas las imágenes ? Eliminar píxeles que no sean de objeto). Ahora las imágenes de biopelículas se borran de las células bacterianas y fúngicas. Exporte la serie de imágenes procesadas como archivos TIF.
  5. Importe ambas series de imágenes a ImageJ. ImageJ asigna una intensidad de 0 a todos los píxeles que no son de objeto. Elimine esos píxeles dividiendo la serie de imágenes rojas (R1) por sí mismo( Calculadora de imágenes ? Imagen 1: R1; Operación: Dividir; Imagen 2: R1) y multiplicando la serie de imágenes resultante (R2) con la serie de imágenes rojas originales (Proceso ? Calculadora de imágenes ? Imagen 1: R1; Operación: Multiplicar; Imagen 2: R2). Se crea una tercera serie de imágenes (R3), idéntica a R1, excepto por el hecho de que NaN se asigna a todos los píxeles con una intensidad de 0 en R1. Proceda de la misma manera con la serie de imágenes verdes.
  6. Utilice el filtro 'Media' (Proceso ? Filtros ? Significación de la Radio de radio ? 1 píxel) en la serie de imágenes de canal rojo y verde para compensar el ruido del detector. Dividir la serie de imágenes de canal verde por la serie de imágenes de canal rojo (Proceso ? Calculadora de imágenes ? Imagen 1: G3; Operación: Dividir; Imagen 2: R3). La serie de imágenes resultante (G3/R3) muestra la relación verde/roja para todos los píxeles de objeto.
  7. Calcular la relación media para cada imagen (Analizar ? Histograma). Aplicar coloración falsa para una mejor representación visual de las proporciones en las imágenes (Imagen ? Tablas de búsqueda). Convierta las relaciones verde/roja en valores de pH empleando la función ajustada por debajo de 3.6.

Resultados

Después de 24 h y 48 h, robustas biopelículas entre reinos desarrolladas en las placas de pozo. C. albicans mostró diferentes grados de crecimiento filamentoso, y S. mutans formó racimos densos de hasta 35 m de altura. Células y cadenas de S. mutans agrupadas alrededor de hifas fúngicas, y grandes espacios intercelulares indicaron la presencia de una matriz voluminosa(Figura S1).

La calibración del tinte ratiométrico produce una curva sigmoid...

Discusión

Diferentes protocolos para el cultivo de biopelículas entre reinos con C. albicans y Streptococcus spp. han sido descritos previamente9,22,23,24,25. Sin embargo, la configuración actual se centra en condiciones de crecimiento simples, un cronograma compatible con días laborables regulares, una composición equilibrada de especies ...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Anette Aakjor Thomsen y Javier E. García son reconocidos por su excelente soporte técnico. Los autores agradecen a Rubens Spin-Neto sus fructíferas discusiones sobre el análisis de imágenes.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Blood agar platesStatens Serum Institut677
Brain heart infusionOxoidCM1135
Brain heart infusion + 5 % sucroseBDH laboratory supplies10274
Candida albicansNational Collection of Pathogenic FungiNCPF 3179
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270
daime: digital image analysis in microbial ecologyUniversität WienN/AFreeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime
Dimethyl sulfoxideLife TechnologiesD12345
Fetal bovine serumGibco Life technologies10270
GS-6R refrigerated centrifugeBeckmanN/A
ImageJNational Institutes of HealthN/AFreeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij
JavaOracleN/AFreeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download
µ-Plate 96 Well BlackIbidi89626
MyCurveFitMyAssays Ltd.N/A
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) bufferBioworld700728
PHM210 pH-meterRadiometer Analytical
Plan-Apochromat 63x oil immersion objectiveZeissN/ANA=1.4
SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic AcidLife TechnologiesS23920
Sterile physiological salineVWR6404
Streptococcus mutansDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenDSM 20523
Vis-spectrophotometer V-3000PCVWRN/A
XL IncubatorPeCONN/A
Zeiss LSM 510 METAZeissN/A

Referencias

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