Caracterización de los efectos de los inhibidores migratorios en la invasión de esferoides de tumores 3D por microscopía confocal de alta resolución

Resumen

Los efectos de los inhibidores migratorios en la migración de células cancerosas de glioma en ensayos de invasión tridimensionales (3D) utilizando un inhibidor de la histona deacetilasa (HDAC) se caracterizan por una microscopía confocal de alta resolución.

Resumen

El descubrimiento y desarrollo de fármacos en la investigación del cáncer se basa cada vez más en pantallas de drogas en un formato 3D. Se están descubriendo nuevos inhibidores dirigidos al potencial migratorio e invasivo de las células cancerosas, y en consecuencia a la propagación metastásica de la enfermedad, y se consideran tratamientos complementarios en cánceres altamente invasivos como los gliomas. Por lo tanto, se requiere generar datos que permitan el análisis detallado de las células en un entorno 3D después de la adición de un medicamento. La metodología descrita aquí, combinando ensayos de invasión esferoide con captura de imágenes de alta resolución y análisis de datos mediante microscopía de escaneo láser confocal (CLSM), permitió la caracterización detallada de los efectos del potencial inhibidor antimigratorio MI-192 en células de glioma. Los esferoides se generaron a partir de líneas celulares para ensayos de invasión en placas de 96 pocillos de bajo adherente y luego se prepararon para el análisis de CLSM. El flujo de trabajo descrito se prefirió sobre otras técnicas de generación de esferoides de uso común debido a la facilidad y la reproducibilidad. Esto, combinado con la resolución de imagen mejorada alcanzada por microscopía confocal en comparación con los enfoques convencionales de campo ancho, permitió la identificación y el análisis de cambios morfológicos distintos en las células migratorias en un entorno 3D tratamiento con el fármaco migratorio MI-192.

Introducción

Las tecnologías de esferoides tridimensionales para el descubrimiento de fármacos preclínicos y el desarrollo de fármacos potenciales contra el cáncer se están favoreciendo cada vez más con las pantallas de fármacos convencionales; por lo tanto, hay más desarrollo de medicamentos migratorios —prevención de migración e invasión—. Los fundamentos de estos desarrollos en el tratamiento del cáncer son claros: los ensayos de esferoides 3D representan un enfoque más realista para la detección de posibles fármacos contra el cáncer, ya que imitan la arquitectura de tumores 3D más fielmente que las culturas monocapa celular, recapitular las interacciones droga-tumor (cinética) con mayor precisión, y permitir la caracterización de la actividad farmacológica en un entorno relacionado con el tumor. Además, el aumento de la resistencia a los medicamentos quimiotóxicos en muchos tipos de cáncer y las altas tasas de mortalidad entre los pacientes con cáncer debido a la metástasis potenciada por la capacidad de las células cancerosas para migrar a sitios tumorales distantes apoya la inclusión de agentes quimioterápicos el potencial migratorio de las células cancerosas como tratamiento adyuvante en futuros ensayos clínicos de cáncer¹. Este es particularmente el caso en cánceres altamente invasivos, como los glioblastomas de alto grado (GBM). El manejo de GBM incluye cirugía, radioterapia y quimioterapia. Sin embargo, incluso con el tratamiento combinado, la mayoría de los pacientes recaen dentro de 1 año del diagnóstico inicial con una mediana de supervivencia de 11-15 meses^2,3. En los últimos años se han realizado enormes avances en el campo de la tecnología 3D: sistemas rotativos, estructuras microfabricadas y andamios 3D, y otros ensayos individuales se están mejorando continuamente para permitir realizar pruebas rutinarias a gran escala^{4, 5,6,7}. Sin embargo, los resultados obtenidos de estos ensayos deben analizarse de manera significativa porque la interpretación de datos a menudo se ve obstaculizada por los intentos de analizar datos generados por 3D con sistemas de análisis de imágenes 2D.

A pesar de ser preferible en términos de velocidad de adquisición de imagen y reducción de la fototoxicidad, la mayoría de los sistemas de campo ancho siguen estando limitados por la resolución^8. Por lo tanto, aparte de las lecturas de datos relacionadas con la eficacia de los medicamentos, los efectos detallados de la acción del fármaco en las estructuras celulares 3D de las células migratorias se pierden inevitablemente si se imágen utilizando un sistema de campo amplio. Por el contrario, la microscopía de escaneo láser confocal (CLSM) captura imágenes de alta calidad seccionadas ópticamente que se pueden reconstruir y renderizar en 3D después de la adquisición utilizando software informático. Por lo tanto, CLSM es fácilmente aplicable a las estructuras celulares 3D complejas de imágenes, lo que permite el interrogatorio de los efectos de los inhibidores antimigrastres en las estructuras 3D y análisis en profundidad de los mecanismos de migración celular. Esto sin duda guiará el desarrollo futuro de fármacos migratorios. Aquí, se describe un flujo de trabajo combinado de generación de esferoides, tratamiento de fármacos, protocolo de tinción y caracterización mediante microscopía confocal de alta resolución.

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Protocolo

1. Generación de esferoides celulares

Día 1

1. Prepare el medio de cultivo estándar según lo requiera la línea celular bajo investigación.
2. Llevar a cabo todos los pasos asociados al cultivo de tejido en una campana de cultivo de tejido utilizando técnicas de manejo estéril.
3. Triptiza y cuenta las células cancerosas. Utilice 20 ml de suspensión celular por placa. Mantenga las suspensiones celulares en tubos universales estériles claramente etiquetados.
4. Agregue un número predeterminado de celdas a cada pocal. Tanto el número inicial de células como el tamaño final de los esferoides requeridos depende de la tasa de proliferación de la línea celular que se está investigando.
   NOTA: Para las líneas celulares de glioma establecidas como U251 y KNS42^9,10, 5 x 10³ células/ml producirán un esferoide microscópicamente visible (200 u 800 m) después de 4 días de incubación.
5. Resuspenda las células en tubos universales mediante una inversión suave para evitar el aglutinamiento celular. Pipetear 200 l de la suspensión celular en cada pocal de una placa de 96 pocillos. Si no se requieren todos los pozos, es aconsejable añadir 200 éL de 1x PBS a cada pozo vacío para evitar la evaporación.
6. Incubar las células en una incubadora de forma normal a 37 oC.
   NOTA: Las líneas celulares como las líneas celulares del cáncer de glioma formarán esferoides dentro de 24 h. Permitir que se forme la arquitectura celular 3D incubando el esferoide durante 72 h.

Día 2

7. Compruebe las células mediante microscopía de campo brillante después de 24 h. Dependiendo de la línea celular, las células pueden haber formado un esferoide detectable en la parte inferior del pozo.
   NOTA: Las líneas celulares de cáncer de glioma establecidas forman fácilmente esferoides dentro de las 24 h. Las líneas celulares de cáncer de glioma derivadas del paciente pueden tardar hasta 1-2 semanas.

2. Ensayo de invasión de colágeno

Día 3

1. Colocar colágeno, medio de cultivo 5x, 1 M NaOH y un tubo de 20 ml sobre hielo.
2. Añadir con cuidado y lentamente 10,4 ml de colágeno frío en un tubo de cultivo refrigerado. Evite las burbujas. Esta cantidad de colágeno es suficiente para una placa de 96 pocillos. La ampliación es posible, pero se recomienda preparar un tubo de 20 ml por placa a la vez.
3. Añadir suavemente 1,52 ml de medio de cultivo 5x estéril frío. Evite las burbujas.
4. Justo antes de su uso, agregue suavemente 72 ml de frío estéril 1 M NaOH. Mantenga la solución en hielo.
5. Mezcle suavemente pipeteando. Evite las burbujas. La mezcla eficiente conduce a un cambio de color (de rojo a rojo anaranjado (pH 7.4) en el medio. Deje la mezcla sobre hielo hasta su uso.
6. Paso crucial: Retire 190 ml de sobrenadante de la placa de 96 pocillos preparada en el día 1. Tenga mucho cuidado de no molestar a los esferoides que se formaron en la parte inferior del pozo. Utilice la pipeta en un ángulo hacia el lado, no el centro, del pozo.
7. Agregue suavemente 100 s de la mezcla de colágeno a cada poca. Para evitar cualquier perturbación esferoide, pipetee la mezcla por el lado del pozo. Evite las burbujas. Mantenga cualquier mezcla de colágeno restante en el tubo de 20 ml a temperatura ambiente para evaluar la polimerización.
8. Incubar la placa en la incubadora durante al menos 10 minutos para permitir que el colágeno se polimerice. Como pauta, si el colágeno sobrante se ha puesto, convirtiéndose en semisólido y similar a una esponja, los esferoides están listos para ser tratados con inhibidor.
9. Añadir los fármacos o inhibidores a la concentración 2x al medio de cultivo. Añadir el medio suavemente a cada pocal (100 ml por pozo). Una vez más, pipetear el medio por el lado del pozo para evitar la perturbación de los esferoides.
10. Observe e ilumine cada esferoide mediante microscopía de campo brillante a veces T a 0 h, 24 h, 48 h y 72 h para evaluar la actividad del fármaco. A continuación, devuelva la placa a la incubadora.
    NOTA: Dependiendo del comportamiento invasivo de la línea celular, la migración lejos del núcleo esferoide original se puede observar a partir de las 24 horas en adelante.

3. Preparación de esferoides integrados de colágeno y células migratorias para microscopía confocal

1. Coloque la placa en una capucha de cultivo de tejido y retire suavemente el sobrenadante (200 l). Una vez más, tenga cuidado de no molestar al esferoide y evitar tocar el colágeno, ya que esto puede interferir con el tapón de colágeno.
2. Sustituya el sobrenadante por 100 s de 1pbS. Repita este paso de lavado 3x.
3. Retire el lavado final y sustitúyalo con un 4% de formaldehído en 1PBS (100 ml por poca).
   PRECAUCION: El formaldehído es un carcinógeno potencial. Manipule con cuidado de acuerdo con las pautas de salud y seguridad.
4. Coloque la placa de 96 pocillos en un banco de laboratorio, cubra con papel de aluminio y déjela durante 24 horas a temperatura ambiente.
5. Retire cuidadosamente el formaldehído y sustitúylo por 1pbS. Repita este 1x lavado PBS 3x.
6. Preparar 0.1% Triton X-100 en 1x PBS. Retire el lavado de 1x PBS y sustitúyalo por 100 ml de la solución Triton X-100. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Mientras tanto, prepare la solución de bloqueo con 1 x PBS y 0.05% leche desnatada en polvo y mezcle bien.
7. Retire Triton X-100 y lave 3x con 1pbS. Añadir 100 sL de solución de bloqueo a cada poca y incubar durante 15 min.
8. Diluir el anticuerpo primario requerido en el tampón de bloqueo a la concentración predeterminada. Aquí, utilice anticuerpo anti-ratón IgG acetilado de tubulina (1:100).
9. Centrifugar la mezcla tampón de bloqueo de anticuerpos primaria durante 5 min a 15.682 x g. Retire con cuidado la solución de bloqueo y agregue el sobrenadante (25 x 50 l) a cada poca. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 h.
10. Retire la solución de anticuerpos y lave 3 veces con 1 pbS (100 ml por poca).
11. Diluir el anticuerpo secundario en el tampón de bloqueo a la concentración recomendada o predeterminada, además de las manchas fluorescentes adicionales. Aquí, utilice 1:500 anti-ratón fluoróforo-488 anticuerpo conjugado, faloidin-594 (1:500) para la tinción de la actina, y la mancha de ADN (DAPI).
12. Una vez más, centrifugar la solución de anticuerpos secundarios durante 5 min a 13.000 rpm.
13. Retire la solución de bloqueo de cada pocal y añada 25 x 50 l de la mezcla secundaria de anticuerpos/phalloidin/DAPI. Incubar en la oscuridad durante 1,5 h a temperatura ambiente.
14. Retire la solución secundaria de anticuerpos y lave 3 veces con 1 pbS (100 ml por poca).
15. Levante con cuidado tapones de colágeno individuales mediante succión con una pipeta de plástico (200 l) en el centro de un portaobjetos de vidrio liso de alta calidad.
16. Agregue una gota de un mountante adecuado al tapón de colágeno, asegurándose de que el enchufe esté completamente cubierto. Evite las burbujas.
17. Aplicar el cubreobjetos del espesor óptimo para el objetivo del microscopio que se utilizará para la toma de imágenes y permitir que se ajuste durante la noche. Guarde los portaobjetos a temperatura ambiente en la oscuridad.

4. Microscopía de fluorescencia

1. Capture imágenes fluorescentes utilizando un microscopio confocal adecuado.

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Resultados

La tecnología de esferoides tridimensionales está avanzando en la comprensión de las interacciones entre fármacos y tumores porque es más representativa del entorno específico del cáncer. La generación de esferoides se puede lograr de varias maneras; en este protocolo se utilizaron placas de baja adherencia de 96 pocillos. Después de probar varios productos de diferentes fabricantes, las placas utilizadas aquí fueron elegidas porque constantemente tuvieron el mejor desempeño en...

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Discusión

Se describe una forma novedosa de crear esferoides de células cancerosas para la identificación de la actividad de los medicamentos migratorios mediante microscopía confocal de alta resolución. El uso de placas de bajo adherente sobre otras técnicas, como las gotas colgantes^15,ha facilitado un medio de generación de esferoides reproducibles y uniformes para su uso en los ensayos de migración e invasión de colágeno. Los puntos críticos de este protocolo son la eliminación del medio de cr...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagen I, rat tail, 100 mg	Corning	354236	for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 (e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4 °C, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.
Coverslips	various	various	for microscopy imaging
DMEM powder	Sigma	D5648	needed at 5x concentration for collagen solution for glioma invasion assay;  this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5x solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 μm) before use.
Foetal calf serum	Sigma	F7524-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines
Glass slides	various	various	for microscopy imaging
High glucose DMEM	Gibco	41965062	needed for cell culture of glioma cell lines
Inhibitor	Tocris	various	various - according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.
Mountant	various	various	for microscopic imaging
NaOH (1 M)	various	various	NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.
Paraformaldehyde	various	various	for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay
Pastettes (graduated pipette, 3 mL)	various	various	for invasion assay, solution removal
PBS, sterile for tissue culture	Sigma	D1408-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining
Pen/strep (antibiotics)	Sigma	P4333	needed for cell culture of glioma cell lines
Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin	various	various	there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration
Sodium pyruvate	Sigma	P5280	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration
Trypsin	Sigma	T4049	for trypsinisation
Ultra low attachment plates	Sigma/Nunc	CLS7007-24EA	for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids
Stripettes (serological pipettes, sterile, 5 mL and 10 mL)	various e.g. Costar	CLS4488-50; CLS4487-50	for tissue culture and collagen preparation
Various multichannel (50 - 250 μL) and single channel pipettes (10 μL, 50 μL, 200 μL 1 mL)	various	various	for cell and spheroid handling
Widefield microscopy	various	various	for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)
Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective	Zeiss	quote from manufacturer	Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.