Aislamiento y diferenciación de los mioblastos primarios de los explantes musculares esqueléticos de ratón

Resumen

Los mióblastos están proliferando en células precursoras que se diferencian para formar miotubos polinucleados y, finalmente, miofibers musculares esqueléticos. Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento eficiente y el cultivo de mioblastos primarios de los músculos esqueléticos adultos jóvenes. El método permite estudios moleculares, genéticos y metabólicos de las células musculares en el cultivo.

Resumen

Los mioblastos primarios son precursores proliferantes indiferenciados del músculo esquelético. Pueden ser cultivados y estudiados como precursores musculares o inducidos para diferenciarse en etapas posteriores del desarrollo muscular. El protocolo proporcionado aquí describe un método robusto para el aislamiento y el cultivo de una población altamente proliferativa de células mioblastecas de explantes musculares esqueléticos de ratón adulto joven. Estas células son útiles para el estudio de las propiedades metabólicas del músculo esquelético de diferentes modelos de ratón, así como en otras aplicaciones aguas abajo como la transfección con ADN exógeno o la transducción con vectores de expresión viral. El nivel de diferenciación y perfil metabólico de estas células depende de la duración de la exposición y de la composición de los medios utilizados para inducir la diferenciación de mioblastos. Estos métodos proporcionan un sistema robusto para el estudio del metabolismo de las células musculares de la ratón ex vivo. Es importante destacar que, a diferencia de los modelos in vivo, los métodos descritos aquí proporcionan una población celular que se puede ampliar y estudiar con altos niveles de reproducibilidad.

Introducción

Aunque a menudo se cita como una indicación de la salud metabólica general, múltiples estudios han demostrado que el índice de masa corporal (IMC) en adultos mayores no se asocia consistentemente con un mayor riesgo de mortalidad. Hasta la fecha, el único factor que ha demostrado ser consistente con la reducción de la mortalidad en esta población es el aumento de la masa muscular¹. El tejido muscular representa una de las mayores fuentes de células sensibles a la insulina en el cuerpo, y por lo tanto es crítico en el mantenimiento de la homeostasis metabólica general². La activación del tejido muscular esquelético a través del ejercicio se asocia con aumentos tanto en la sensibilidad local a la insulina como en la salud metabólica general³. Mientras que los modelos in vivo son esenciales para estudiar la fisiología muscular y el impacto de la función muscular en el metabolismo integrado, los cultivos primarios de miotubos proporcionan un sistema manejable que reduce la complejidad de los estudios en animales.

Los mióblastos derivados de los músculos postnatales se pueden utilizar para estudiar el impacto de numerosas condiciones de tratamiento y crecimiento de una manera altamente reproducible. Esto ha sido reconocido durante mucho tiempo y se han descrito varios métodos para el aislamiento y el cultivo de mioblastos^4,5,6,7,8,9. Algunos de estos métodos utilizan músculos neonatales y producen un número relativamente bajo de mioblastos^5,8,que requieren varios animales para estudios a mayor escala. Además, los métodos más utilizados para el cultivo de mioblastos utilizan "pre-plating" para enriquecer los mioblastos, que son menos adherentes que otros tipos de células. Hemos encontrado que el método de enriquecimiento alternativo descrito aquí es mucho más eficiente y reproducible para enriquecer una población de mioblastos altamente proliferativos. En resumen, este protocolo permite el aislamiento de mioblastos altamente proliferativos de explantes musculares adultos jóvenes, a través del crecimiento en los medios de cultivo. Los mióblastos se pueden cosechar repetidamente, durante varios días, expandirse rápidamente e inducirse a diferenciarse en miotubos. Este protocolo genera reproduciblemente un gran número de células de mioblasto sano que se diferencian sólidamente en miotubos de espasmos espontáneamente. Nos ha permitido estudiar el metabolismo y los ritmos circadianos en miotubos primarios de ratones de una variedad de genotipos. Por último, incluimos métodos para preparar miotubos para el estudio del metabolismo oxidativo, utilizando mediciones de las tasas de consumo de oxígeno en placas de 96 pocillos.

Protocolo

Este protocolo sigue las pautas de cuidado animal de Scripps Research.

1. Recolección y procesamiento de explantes de tejido muscular

1. El día anterior a la disección, esterilizar todos los equipos de disección (fórceps, cuchillas de afeitar y tijeras) y preparar todos los medios necesarios: solución salina tamponada de fosfato (PBS), MB Deplating (12,5 ml de DMEM, 12,5 ml de HAMS F12, 20 ml de bovina fetal inactivada por calor suero (FBS), 5 ml de suplemento medio de líquido amniótico) y Solución de recubrimiento (24 ml de DMEM, 24 ml de HAMS F12, 1,7 ml de colágeno, 1 ml de matrigel).
2. El día de la disección, cubra un plato de 6 cm con solución de recubrimiento para cada músculo a diseccionar. Añadir 2 ml de solución de recubrimiento a la superficie de cada plato, agitar suavemente para crear una capa uniforme en la superficie, e incubar las placas con solución a 4 oC durante 1 h.
3. Retire la solución de recubrimiento de las placas y vuelva a la solución de stock.
   NOTA: La solución de recubrimiento se puede reutilizar durante un máximo de seis meses y debe almacenarse a 4 oC.
4. Enjuague las placas dos veces con 2 ml de PBS para eliminar el colágeno y el matrigel sin ataduras.
5. Colocar las placas en una incubadora de cultivo de tejido de 37oC durante las disecciones.
6. Preparar una cámara húmeda colocando 2-3 hojas de papel absorbente grueso en una bolsa de plástico o un plato estéril de 15 cm y utilizar una pipeta para mojar la superficie del papel con agua estéril.
7. Coloque la cámara bajo luz UV durante 5 minutos para esterilizar.
8. Diseccionar los músculos deseados de un ratón de 4 a 8 semanas de edad. Para esterilizar el tejido muscular, enjuague suavemente en PBS que contenga 40 g/ml de gentamicina.
   NOTA: Para los músculos del cuádriceps y gastrocnemio, placa un músculo por placa. Para soleus, plantaris y EDL, combina los músculos de ambas piernas en un solo plato.
9. Utilice fórceps estériles para transferir el músculo a un plato estéril de 10 cm sin recubrimiento De Lica. Añadir 0,5-1,0 ml de medios de chapado sobre el músculo de tal manera que el tejido esté húmedo pero no flotante(Figura 1A).
10. Utilice un bisturí estéril o una cuchilla de afeitar para cortar suavemente el músculo en pequeños fragmentos (aproximadamente 1-3 mm³).
    NOTA: Es importante minimizar el manejo del tejido muscular para obtener mejores resultados.
11. Utilice fórceps o una pipeta para transferir los fragmentos musculares a la superficie de una placa pre-revestida de 6 cm. Superponga muy suavemente 0,8 ml de soporte de chapado sobre el tejido. Debe haber suficientes medios para mantener las piezas de tejido hidratadas pero no flotantes(Figura 1B).
12. Colocar los platos de 6 cm que contienen los fragmentos musculares dentro de la cámara húmeda y volver a una incubadora (37 oC, 5% CO₂) durante 48 h(Figura 1C).
    NOTA: Es vital que los fragmentos musculares se adhieran a la superficie de la placa para permitir el crecimiento del mioblasto. No mueva las placas/cámara durante al menos 48 h.
13. Después de 48 h, compruebe cuidadosamente las placas para asegurarse de que los fragmentos musculares se han adherido. Superposición con 2 mL de Plating Media, teniendo cuidado de no desalojar los fragmentos.
    NOTA: Si hay contaminación o escombros visibles en las placas, lave cuidadosamente las piezas musculares. Placa 2 ml de solución de PBS/gentamicina en el borde de la placa y punta suavemente para lavar sobre el tejido muscular. Retire el PBS y repita el paso de lavado. Después del segundo lavado, superponga 2 mL de Plating Media.
14. Conservar las placas en la incubadora de 37oC durante un máximo de 3 días adicionales (5 días a partir de la disección original) antes de cosechar mioblastos. Compruebe cada dos días si hay crecimiento de mioblastos.
    NOTA: La aparición de células que emergen de explantas musculares será variable y heterogénea. Los mióblastos primarios aparecen como células pequeñas, redondas y brillantes. Sin embargo, no es necesario ni fiable identificarlos por su aparición en esta etapa(Figura 2).

2. Cosecha de mióblastos de cultivo

1. Preparar y precalentar Myoblast Media (17,5 mL de DMEM, 17,5 mL de HAMS F12, 10 mL de FBS, 5 mL de suplemento medio de líquido amniótico), trippsina y PBS/gentamicina. Recubrir un matraz T25 por grupo muscular que se cosecha con Solución de Recubrimiento y como se describe en el paso 1.2 (ver Tabla 1).
2. Retire los medios de recubrimiento y enjuague suavemente los explantes musculares con 2 ml de PBS/gentamicina. Retire rápidamente el PBS (enjuague una placa a la vez y no deje que la placa se quede en PBS en este paso).
3. Agregue suavemente 1 ml de PBS/gentamicina y coloque la placa en la incubadora de 37oC durante 1 min.
4. Utilice una pipeta P1000 para recoger PBS/células en un tubo centrífugo de 15 ml.
5. Añadir 1 ml de trippsina a la placa y volver a la incubadora de 37 oC durante 3 minutos. Toque suavemente las placas para desalojar los mióblastos. Recoja la trippsina/células y combínelo con la colección PBS. Añadir 8 ml de Myoblast Media al tubo centrífugo e invertir suavemente para mezclar.
6. Superponga suavemente 2 ml de solución de chapado en las placas musculares y vuelva a la incubadora de 37 oC.
7. Gire los tubos de centrífuga que contienen células en una centrífuga durante 3 min a 200 x g.
8. Aspirar el sobrenadante a 1 ml, teniendo cuidado de evitar el pellet celular. Agregue suavemente Myoblast Media (ver Tabla 1) y transfiera las células al matraz pre-recubierto y colóquelas en la incubadora de 37oC. Esta es la cosecha P0. Si se observa bajo un microscopio, puede haber muy pocas células(Figura 3).
9. Repita la cosecha descrita anteriormente cada dos días hasta tres veces. Después de la tercera cosecha, deseche los explantes.

3. Expansión y enriquecimiento de los mioblastos proliferantes

NOTA: La cosecha P0 será heterogénea (60% mioblastos). Los siguientes 2 pasajes utilizan PBS para cosechar selectivamente mioblastos. Muchas de las células más adherentes se dejarán atrás y los mioblastos que proliferan rápidamente serán 95% puros dentro de 2 pasajes. Una vez establecidos los mioblastos, deben mantenerse a baja densidad para evitar la diferenciación espontánea.

1. Para cada matraz T25 de células confluentes de 40-50% de la sección 2, cubra un matraz T75 con 5 ml de solución de recubrimiento y colóquelo a 4 oC durante 1-4 h.
2. Retire la solución de recubrimiento de los matraces y vuelva a la solución de stock. Enjuague los matraces dos veces con 2 ml de PBS/gentamicina y colóquelos en la incubadora de 37oC.
3. Aspirar los medios de los matraces P0 myoblast T25. Enjuague las células brevemente con 2 ml de PBS/gentamicina tibia. Aspirar PBS desde el matraz.
   NOTA: El propósito de este paso (3.3) es reducir la posibilidad de contaminación bacteriana. Si se realiza rápida y suavemente, no debe resultar en la pérdida de mioblastos. Se puede omitir para maximizar la preservación del mioblasto si se desea.
4. Pipetear 2 ml de PBS caliente (no trippsina) en cada matraz que contenga mioblastos. Coloque los matraces con PBS en la incubadora de 37 oC durante 3 min.
   NOTA: Los mióblastos deben desprenderse fácilmente de los matraces con PBS. El uso de PBS en lugar de la trippsina en este paso es fundamental para reducir la contaminación de la población de mióblasts con otros tipos de células.
5. Retire las células de la incubadora de 37 oC y toque firmemente el lado de los matraces para desalojar las células. Compruebe bajo un microscopio de luz si hay mioblastos flotantes.
6. Coloque los matraces en posición vertical en una capucha de cultivo de tejido y enjuague la parte inferior de los matraces con 10 ml de Myoblast Media 2-3 veces para asegurarse de que todas las células se desalojan.
7. Recoger la mezcla celular/media en un tubo centrífugo de 15 ml. Centrífuga durante 3 min a 200 x g.
8. Aspirar el medio a alrededor de 1 mL, teniendo cuidado de evitar el pellet celular. Agregue suavemente un volumen adecuado de Myoblast Media al tubo centrífugo y mezcle suavemente.
9. Distribuya la mezcla de células en los nuevos matraces T75. Agregue 10 ml de Myoblast Media a cada nuevo matraz T75. Agitar suavemente los matraces horizontalmente para distribuir las células y colocarlas en la incubadora de 37oC durante la noche.
10. Dos días más tarde, pasa una vez más con PBS, dividiendo cada matraz T75 en tres matraces T75.
    NOTA: No permita que los mióblastos se conviertan en más de 50%-60% de confluentes, ya que esto haría que comenzaran a diferenciary y perder capacidad de prolifatere.
11. Para pasajes adicionales, utilice trippsina. Pasar dos veces con rendimientos de PBS >95% mioblastos; los intentos de mejorar aún más la pureza tienden a dar lugar a una diferenciación más pobre.

4. Diferenciación de los mióblastos primarios a los miotubos

1. Placa P2 (o pasaje posterior) mioblastos en Myoblast Media en placas recubiertas (ver Tabla 1 para los volúmenes sugeridos de recubrimiento y chapado y números de celda). Dos o tres días más tarde, cuando las células estén al 70-80% de confluencia, cambie los medios a Medios de Diferenciación (24 ml de DMEM, 24 ml de HAMS F12, 1,5 ml de suero de caballo inactivado por calor, 0,5 ml de insulina-selenio-transferrina).
2. Cambiar los medios de diferenciación cada dos días durante la diferenciación de los mioblastos primarios en miotubos. La diferenciación se completa típicamente para el día 4-5 y estará marcada por células alargadas y fusionadas que se entrelacen espontáneamente. Realizar experimentos en miotubos diferenciados en un plazo de 6 días. Por lo general, las células se muestran cinco o seis días después de iniciar la diferenciación.

5. Medición de la tasa de consumo de oxígeno en mioblastos o miotubos en placas de 96 pocillos

1. Cubra placas de 96 pocillos con 25 ml de solución de recubrimiento por poca. Centrifugar las placas a 58 x g durante 1 min para eliminar las burbujas.
2. Incubar las placas en solución de recubrimiento durante 1-4 h a 4oC. Utilice la pipeta multicanal para retirar la solución de recubrimiento y lavar tres veces en 25 ml de PBS/gentamicina fría. Centrifugar al menos uno de estos lavados para asegurarse de que no haya burbujas atrapadas.
3. Añadir 40 s de medios de diferenciación a cada poca. Centrifugar el medio en la placa recubierta sin celdas durante 1 min a 58 x g para evitar burbujas y eliminar la tensión superficial para obtener una capa uniforme de medios.
4. Agregue las células suspendidas en 40 s adicionales de medios a cada poca. Girar de nuevo a 58 x g.
   NOTA: La consistencia en el chapado es importante para obtener mejores resultados y el número de células chapadas por pozo debe optimizarse para cada configuración experimental, y probablemente estará en el rango de 10.000-25.000 mioblastos chapados en medios de diferenciación por pozo de una placa de 96 pocillos.
5. Cambie suavemente los medios diariamente durante la diferenciación. No aspirar los medios, sino retirarlo con una pipeta, dejando un pequeño volumen detrás para evitar desalojar las células o exponerlas al aire. Por ejemplo, sustituya 50 s a la vez para tres repeticiones en lugar de los 80 s a la vez.
6. Utilice 8-15 pozos por condición. Puede ser necesario omitir algunos pozos si las células no forman una capa uniforme de miotubos.
   NOTA: Omita los pozos en los bordes de la placa porque son altamente susceptibles a la evaporación. Varíe la configuración de la placa para réplicas experimentales para evitar errores sistemáticos.
7. Realizar el ensayo deseado en miotubos diferenciados dentro de 1-2 días de la diferenciación completa (Día 4-6 desde el inicio de la diferenciación). Los instrumentos y reactivos recomendados para la medición de las tasas de consumo de oxígeno se enumeran en la Tabla de Materiales.

Resultados

Siguiendo la Sección 1 del protocolo proporcionado debe producir células primarias que emergen de los explantes que serán visibles bajo un microscopio de luz estándar(Figura 2). Se verá una población de células heterogéneas creciendo fuera y rodeando cada explantación de tejido muscular. Los mióblastos aparecerán como esferas pequeñas, redondas y brillantes. Siguiendo la Sección 2 del protocolo producirá cosechas tempranas de mioblastos a partir...

Discusión

El músculo esquelético es vital para el establecimiento y mantenimiento de la homeostasis metabólica^11. El estudio de la fisiología muscular se complica por la variabilidad interindividual, así como la dificultad para obtener muestras, especialmente en el caso de estudios en humanos. Se ha demostrado que los miotubos primarios cultivados recapitulan muchas características de la fisiología muscular, incluyendo la homeostasis de calcio^12,la regeneración del tejido mus...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coating Solution:
DMEM	Gibco	10569010	Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL
Collagen	Life Technologies	A1064401	1.7 mL
Matrigel	Fisher	CB40234A	1 mL
Plating Media:
DMEM	Gibco	10569010	Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 12.5 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 12.5 mL
Heat Inactivated FBS	Life Technologies	16000044	20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes
Amniomax	Life Technologies	12556023	5 mL
Myoblast Media:
DMEM	Gibco	10569010	Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 17.5 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 17.5 mL
Heat Inactivated FBS	Life Technologies	16000044	10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 min
Amniomax	Life Technologies	12556023	5 mL
Differentiation Media:
DMEM	Gibco	10569010	Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL
Heat Inactivated Horse Serum	Sigma	H1138	1.5 mL
Insulin-Selenium-Transferrin	Life Technologies	41400045	0.5 mL
Other Materials:
PBS	Gibco	14040133
Gentamicin	Sigma	G1397
TrypLE	Gibco	12604013
DMSO	Sigma	472301	Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells
Forceps	Any
Razor Blades	Any
Scissors	Any
Whatman paper	VWR	21427-648
60 mm plate	VWR	734-2318
10 cm plate	VWR	25382-428 (CS)
T25 Flasks	ThermoFisher	156367
T75 Flasks	ThermoFisher	156499
Centrifuge Tubes (15 mL)	BioPioneer	CNT-15
Oxygen Consumption Rates:
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent	Seahorse XFe96 Analyzer	Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102416-100	96-well plates for use in XFe96 Analyzer
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit	Agilent	103015-100	components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below
Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate	Agilent	102720-100	components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below
Palmitic acid	Sigma	P5585-10G	for measurement of fatty acid oxidation
Carnitine	Sigma	C0283-5G	for measurement of fatty acid oxidation
Etomoxir	Sigma	E1905	for measurement of fatty acid oxidation
BSA	Sigma	A7030	used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation