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Resumen

El objetivo de este protocolo es formar conjuntos de motores moleculares en nanoestructuras de origami de ADN y observar la motilidad del conjunto utilizando la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total.

Resumen

Los motores citoesqueléticos son responsables de una amplia variedad de funciones en las células eucariotas, incluyendo mitosis, transporte de carga, motilidad celular, y otros. Muchas de estas funciones requieren motores para funcionar en conjuntos. A pesar de una gran cantidad de conocimientos sobre los mecanismos de los motores citoesqueléticos individuales, comparativamente menos se sabe acerca de los mecanismos y comportamientos emergentes de los conjuntos motores, ejemplos de los cuales incluyen cambios en la procesabilidad y velocidad del conjunto con cambiar el número de motor, la ubicación y la configuración. La nanotecnología de ADN estructural, y la técnica específica del origami de ADN, permite la construcción molecular de arquitecturas bien definidas de conjuntos motores. La forma de las estructuras de carga, así como el tipo, número y colocación de los motores en la estructura se pueden controlar. Aquí, proporcionamos protocolos detallados para producir estos conjuntos y observarlos utilizando la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total. Aunque estas técnicas se han aplicado específicamente para motores citoesqueléticos, los métodos son generalizables a otras proteínas que se ensamblan en complejos para realizar sus tareas. En general, el método de origami de ADN para crear conjuntos bien definidos de proteínas motoras proporciona una poderosa herramienta para disección de los mecanismos que conducen a un comportamiento móvil emergente.

Introducción

La dinneina y la quinesina son proteínas motoras citoesqueléticas responsables de innumerables funciones en las células eucariotas1. Al convertir la energía química de la hidrólisis ATP en trabajo productivo, estos motores se translocan en microtúbulos para transportar y distribuir diversas cargas intracelulares. También se coordinan en los reordenamientos intracelulares masivos asociados con la mitosis, donde exhiben fuerzas orquestadas que contribuyen al posicionamiento y separación de los cromosomas. Ensayos estructurales, bioquímicos y biofísicos, incluidas observaciones de moléculas únicas, han revelado los mecanismos de estos motores a nivel individual (bien revisados en trabajos anteriores2,3,4). Sin embargo, muchas de las tareas de los motores requieren que trabajen en pequeños conjuntos de tipos de motores similares y mixtos. Comparativamente menos se entiende sobre los mecanismos que coordinan la actividad y la última motilidad emergente de estos conjuntos5,6. Esta brecha de conocimiento se debe, en parte, a la dificultad de crear conjuntos con características controlables, como el tipo de motor y el número de copia. Durante la última década, se han empleado las técnicas de construcción molecular del origami de ADN para resolver este problema. Para los motores basados en microtúbulos, algunos ejemplos de estas investigaciones incluyen observaciones de molécula única de conjuntos de dinneina citoplásmica-17,8,9, dinneina intraflagelar11, varios motores de kinesina12,13, y mezclas de dineinas y kinesinas7,14,15. Aquí, proporcionamos detalles de la purificación y etiquetado de oligonucleótidos de motores de levadura7,16,17,18,20, plegado y purificación de origami de ADN segmentado con conformidad ajustable8, y la toma de imágenes de los motores de levadura propulsando las estructuras del chasis7,18.

La construcción de conjuntos motores para la observación in vitro de molécula única requiere tres esfuerzos primarios. La primera es la expresión, purificación y etiquetado de construcciones motoras adecuadas para adherirse al origami de ADN. La segunda es la producción y purificación de estructuras de origami de ADN definidas (a menudo denominadas "chasis"). Y la tercera es la conjugación de los motores a la estructura del chasis seguida de la observación utilizando la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF). Aquí, proporcionamos protocolos establecidos para este proceso para motores recombinantes a base de microtúbulos purificados de la levadura Saccharomyces cerevisiae7,16,17,18, 19. Se han investigado conjuntos motores a base de origami de ADN utilizando kinesina recombinante15 y dinaína7,8,18 construcciones producidas en este sistema de expresión de levadura16 ,17,18,19. Este protocolo es válido para estas construcciones, dado que están controladas por el promotor inducido por galactosa, y fusionadas a las mismas etiquetas proteicas para la purificación (vinculador de proteasa ZZ y TEV) y para la oligoconjugación de ADN (SNAPtag).

Las cepas de levadura específicas producen construcciones motoras específicas. Por ejemplo, la dinneina utilizada para estudiar el papel del cumplimiento de la carga se purificó a partir de la cepa RPY10847,8. En general, se pueden solicitar cepas que contengan construcciones motoras con las modificaciones genéticas apropiadas para la expresión y la purificación a los laboratorios que han publicado el uso de dichos motores. Las construcciones con atributos novedosos como mutaciones o etiquetas se pueden hacer utilizando técnicas genéticas recombinantes, como la transformación de acetato de litio21 y kits comerciales. Se han publicado protocolos detallados para la creación de proteínas motoras modificadas en levaduras para estudios de molécula única19. Además de los motores que se fusionan con el SNAPtag, los oligos utilizados para etiquetar los motores deben conjugarse con el sustrato SNAP, la bencileguanina (BG); Los protocolos publicados anteriormente describen la formación y purificación de BG-oligo conjugados18. La estrategia general descrita aquí también se ha empleado para motores basados en actina (véanse los trabajos anteriores, por ejemplo,22,23,24), y los motores purificados de otros organismos y sistemas de expresión (véase funciona por ejemplo7,9,10,11,12,13,14).

Los microtúbulos polimerizados (MT) se utilizan en estos experimentos en dos procedimientos diferentes. La purificación de afinidad MT de motores funcionales requiere MT que no estén etiquetados con otros grupos funcionales, mientras que el ensayo TIRF de motilidad de conjunto motor requiere MTs etiquetados con biotina y fluoróforos. En todos los casos, los MT se estabilizan con taxol para evitar la desnaturalización. El paso de purificación de afinidad MT se utiliza para eliminar cualquier motor no móvil con una alta afinidad MT, ya que estos motores pueden alterar la motilidad del conjunto si se conjugan a un chasis. Durante este proceso, los motores activos desuntan los MT y permanecen en solución, mientras que los motores de unión ajustada giran hacia abajo en el pellet MT. Esto ayuda a garantizar que todos los motores del chasis sean de una población activa.

Se ha utilizado una variedad de estructuras de origami de ADN para estudiar conjuntos motores citoesqueléticos. A medida que la comprensión mecanicista del transporte de conjuntos ha aumentado, las estructuras de origami de ADN empleadas en experimentos han crecido en complejidad. En principio, cualquier estructura podría adaptarse para este fin siempre que se modifique para incluir sitios de unión de ADN de una sola cadena para motores y fluoróforos. Los diseños y atributos específicos del chasis pueden ser útiles para sondear preguntas particulares sobre el comportamiento emergente de los conjuntos de motores. Por ejemplo, se han utilizado varillas rígidas para desarrollar conocimientos fundamentales de cómo el número de copia afecta al transporte por equipos de dininyins y kinesins7,15,18y 2D plataformas se han utilizado para estudiar el conjunto de miosina se han utilizado para estudiar conjunto de miosina se han utilizado para estudiar conjunto de miosina navegación de las redes actin22. Se han utilizado estructuras con flexibilidad variable o ajustable para comprender las funciones del acoplamiento elástico entre motores y para sondear cómo la sincronización escalonada afecta a la motilidad8,24. Más recientemente, las estructuras esféricas se utilizan para obtener información sobre cómo las restricciones geométricas a la unión de vías motoras afectan a la dinámica de la motilidad25.

En este protocolo, ofrecemos pasos específicos para experimentos de conjunto en chasis segmentados con rigidez variable. Los sitios de enlace en el chasis a veces se conocen como "manijas", mientras que las secuencias de ADN complementarias que unen estas asas se denominan "antimanijas". El número de motores en estos chasis está determinado por el cual los segmentos contienen grapas de mango extendidas con complementariedad con el oligo handle en los motores oligoetiquetados. El uso de diferentes secuencias de mango en diferentes segmentos permite la unión de diferentes tipos de motores a ubicaciones específicas en el chasis. El chasis detallado aquí se compone de 7 segmentos rígidos secuenciales, cada uno compuesto por 12 hélices de ADN de doble cadena dispuestas en 2 anillos concéntricos8. Los segmentos rígidos contienen las manijas del motor y están conectados a través de regiones que pueden ser ADN flexible de una sola cadena o ADN rígido de doble cadena, dependiendo de la ausencia o presencia, respectivamente, de grapas "linker". Por lo tanto, el cumplimiento de la estructura del chasis viene determinado por la presencia o ausencia de estas grapas "linker". Véanse los informes anteriores para obtener más detalles y secuencias de ADN específicas8. Además, se pueden utilizar varios métodos para purificar el chasis26. El método de centrifugación de gradiente de glicerol zonal de velocidad27 se describe aquí.

Protocolo

1. Crecimiento, expresión y cosecha de proteínas motoras controladas por un promotor inducido por galactosa

  1. Usando una placa de cultivo de levadura-peptona-dextrosa (YPD) y un palo inoculante estéril, la raya deseada cepa de levadura congelada e incubar durante 3-4 días a 30 oC.
  2. Día 1 de crecimiento del cultivo: Por la tarde, añadir 10 mL de medios de cultivo YP con 2% de dextrosa a un tubo de cultivo de vidrio de 1" de diámetro e inocularlo con una sola colonia de la placa. Crece en un tambor de rodillos que gira rápidamente a 30 oC durante la noche.
  3. Día 2: Por la tarde, transfiera los 10 ml de cultivo a un matraz de 250 ml que contenga 50 ml de medios de cultivo YP con un 2% de rafinosa. Incubar durante la noche a 30 oC mientras agita a 250 rpm en un agitador orbital.
  4. Día 3: Por la tarde, transfiera los 60 ml de cultivo a un matraz de 3 L que contenga 1 L de medios de cultivo YP con 2% de galactosa. Incubar durante la noche a 30 oC mientras agita a 250 rpm en un agitador orbital.
  5. Día 4: A partir de media mañana, monitorizar la densidad óptica (OD) del cultivo a 600 nm cada 2 h. Cuando el cultivo está entre una DoT 1.5 y 2, continúe con los siguientes pasos para cosechar las células. La cosecha fuera de este rango de DoPuede puede reducir el rendimiento debido a los recuentos bajos de células antes de la D.O. 1.5, o la reposo celular y la degradación de proteínas por encima de La OD 2.
  6. Decantar el cultivo celular en botellas de centrífuga y girar a 6200 x g a 4 oC durante 8 min. Verter el sobrenadante y desechar.
  7. Resuspenda el pellet celular en el frasco con H2O destilado doblemente (ddH2O).
  8. Girar las células a 6200 x g a 4 oC durante 8 min. Verter el sobrenadante y desechar.
  9. Dependiendo de la viscosidad del pellet celular, agregue hasta 2 ml de ddH2O para crear una solución suficiente mente fluida para pipetear.
  10. Usando un controlador de pipeta motorizado equipado con una pipeta de 10 ml, dispensar lentamente la suspensión celular en nitrógeno líquido una gota a la vez. Esto producirá gránulos congelados de células de levadura.
  11. Almacene las células congeladas a -80 oC hasta que estén listas para purificar.

2. Purificación de proteínas motoras de células de levadura

  1. Lisis celular y extracción de proteínas solubles
    1. Preparar 1 ml de una solución fresca de 0,1 M PMSF en etanol puro. Espere a agregar el PMSF a los tampones acuosos, ya que es inestable en el agua; también, evitar la exposición al agua hasta dentro de 20 minutos (la vida media aproximada de PMSF en agua) de uso.
    2. Preparar 50 mL de tampón de lisis 4x en hielo con suplementos de la 5x stock de tampón de lisis, pero no añadir PMSF hasta justo antes de que el buffer se aplique al pellet de levadura.
    3. Moler los pellets de levadura líquidos congelados con nitrógeno en un polvo fino con una trituradora de café tipo hoja que ha sido pre-enfriada con nitrógeno líquido.
      NOTA: Esta extracción de proteínas normalmente comienza con el pellet celular cosechado a partir de 2 L de cultivo de levadura. La cantidad inicial del cultivo de levadura se puede ajustar hacia arriba o hacia abajo con ajustes proporcionales a los volúmenes de cuentas IgG y oligos de ADN en los pasos 2.2.2 y 2.3.1 a continuación.
    4. Aliquot 15 mL del tampón de lisis 4x con TDT y Mg-ATP en hielo y añadir PMSF al buffer para lograr una concentración final de 2 mM, completando la preparación del tampón de lisis 4x con suplementos.
    5. Recoger el polvo de levadura en un vaso de vidrio pre-enfriado de 100 ml en hielo. Añadir un pequeño volumen del tampón de lisis 4x con suplementos en el polvo para que la concentración final del tampón no exceda 1x. Típicamente, agregue 1,5 ml del búfer por cada 10 ml de polvo de levadura.
    6. Descongelar rápidamente el polvo a la fase líquida colocando el vaso de precipitados en un baño de agua de 37oC con agitación constante utilizando una espátula.
    7. Colocar el vaso de lisato de nuevo en hielo inmediatamente después de la descongelación, estimar el volumen de lysate utilizando un tubo cónico de 50 ml, y añadir más tampón de lisis 4x con suplementos para que la concentración final del tampón sea de 1x. Típicamente, 2 L de cultivo de levadura produce un total de 25-35 mL de lisato que contiene 1x tampón de lisis.
    8. Distribuya uniformemente el lisado a las botellas de centrífuga en hielo. Equilibre cuidadosamente las botellas a una diferencia de masa no superior a 0,01 g entre cada par, asegurándose de que cada botella esté por encima del volumen mínimo requerido para evitar el colapso de la botella. Centrífuga a 290.000 x g durante 25 min a 4oC.
    9. Recoger el sobrenadante que contiene proteínas solubles en un tubo cónico de 50 ml sobre hielo, y desechar el pellet que contiene residuos celulares y orgánulos grandes. Evite recopilar porciones turbias del sobrenadante, ya que pueden obstruir la columna de flujo de gravedad utilizada en los pasos posteriores. Ahorre 10 l del sobrenadante para el análisis SDS-PAGE.
  2. Purificación de afinidad igG
    1. Durante el giro anterior, configure una columna de cromatografía de flujo de gravedad sobre hielo o en una cámara fría.
    2. Transfiera 200 ml de perlo de afinidad de IgG al 50% a la columna utilizando una punta de pipeta P-1000 cortada con una cuchilla de afeitar para ampliar el diámetro de su puerto de entrada. Si purifica más o menos de 2 L de pellet de cultivo celular, ajuste el volumen de perla proporcionalmente, con un volumen mínimo de 100 l.
    3. Alícuota otros 15 mL del tampón de lisis 4x con TDT y Mg-ATP y añadir PMSF al buffer para lograr una concentración final de 2mM. Diluir el búfer 4x en hielo a 1x añadiendo ddH2O.
    4. Lavar las perlas 2x con 5 ml de 1x tampón de lisis con suplementos.
    5. Resuspenda las perlas en 200 l de 1x tampón de lisis con suplementos.
    6. Añadir la suspensión del cordón al extracto proteico obtenido de la centrifugación e incubar la mezcla a 4oC durante 1 h con rotación suave.
    7. Durante la incubación, preparar 25 ml del tampón de lavado (receta detallada en la Tabla 1)sobre hielo y 50 ml de 1x tampón TEV (receta detallada en la Tabla 1)sobre hielo.
    8. Después de la incubación de 1 h, filtre la mezcla de lysato-perla sobre hielo o en la cámara fría a través de la misma columna de cromatografía utilizada en el paso 2.2.2 anterior. Ahorre 10 s de la corriente a través para el análisis SDS-PAGE.
    9. Lave las perlas restantes atoradas a motor sobre hielo 2x con 5 ml de tampón de lavado. Ahorre 10 l del primer lavado para el análisis SDS-PAGE.
    10. Lave las perlas sobre hielo una vez con 5 ml de 1 x tampón TEV. Permita que el búfer drene completamente de la columna.
  3. Etiquetado con oligonucleótidos de ADN y escote TEV
    1. Retire la columna de cromatografía de la configuración y recapitule la parte inferior de la columna. Dentro de la misma columna, incubar las perlas motoras con 100 l de 1 x tampón TEV que contenga 10-20 m del BG-oligo purificado a temperatura ambiente (RT) durante 10-15 min. Si purifica más o menos de 2 L de pellet de cultivo celular, ajuste el volumen de 1 x tampón TEV y BG-oligos purificado proporcionalmente. Aumentar el tiempo de incubación de acuerdo con las instrucciones del fabricante si es necesario para aumentar el rendimiento y la tasa de etiquetado del motor, pero tenga en cuenta que los tiempos de incubación más largos también pueden aumentar la proporción de motores disfuncionales debido a la desnaturalización de proteínas en RT.
    2. Resuspenda suavemente las cuentas cada minuto de la incubación.
    3. Lave las perlas motoras etiquetadas 4x con 4 ml de tampón TEV 1x utilizando la misma columna de cromatografía y configuración que antes. Deje que el lavado final drene completamente de la columna.
    4. Tapar la parte inferior de la columna, resuspender las perlas motoras en no más de 200 l de 1x TEV Buffer, y transferir a un tubo de microcentrífuga de fondo redondo de 2 ml.
    5. Incubar la suspensión con 0,3 unidades de proteasa TEV por l de mezcla motor-perla a 16 oC durante 1 h con rotaciones suaves. El tubo debe montarse para minimizar la superficie total del tubo con el que entran en contacto las perlas.
    6. Centrifugar el tubo en una microcentrífuga a 21.130 x g durante 30 s en una cámara fría para concentrar la mezcla en la parte inferior del tubo.
    7. Todavía en la sala fría, utilice una punta de pipeta P-1000 cortada para transferir la mezcla a una columna de centrifugar y centrifugar a 21.130 x g durante 30 s. Recoger el filtrado que contiene los motores purificados cortados con TEV. La proteasa TEV estará en el filtrado, así como en los motores.
    8. Guarde 10 l del filtrado para el análisis SDS-PAGE. Alícuota el filtrado restante en volúmenes de 2 l para experimentos TIRF o de 50 ol para purificación de afinidad de microtúbulos. Congele con flash las alícuotas en nitrógeno líquido y guárdelas a -80 oC.
    9. Resuspenda las perlas restantes en el filtro en 1 búfer TEV para el análisis SDS-PAGE. Utilice el mismo volumen de 1x tampón TEV que en el paso 2.3.4 anterior.

3. Microtúbulo (MT) polimerización

  1. Preparación de mezclas de tubulina para ensayos TIRF
    1. En una sala fría, disuelva por separado la tubulina liofilizada de cada tipo (tubulina bovina sin etiquetar, tubulina biotinada y tubulina fluorescente) en tampón de reconstitución (receta detallada en la Tabla 2)para realizar una concentración final de 10 mg/ml. Dejar sentarse en hielo durante 10 minutos.
      1. Mezcle los siguientes componentes y deje sentarse en hielo durante 10 minutos en la cámara frigorífica (las concentraciones finales se indican entre paréntesis): 18 ml de tubulina bovina (8,2 mg/ml), 2 ml de tubulina biotinylatada (0,9 mg/ml) y 2 ml de tubulina fluorescente (0,9 mg/ml).
    2. Preparar alícuotas de 3 ml de la mezcla de tubulina y congelar el flash en nitrógeno líquido. Conservar las mezclas a -80oC.
  2. Preparación de la tubulina para la purificación de la afinidad MT de los motores
    1. En una sala fría, disolver la tubulina bovina liofilizada en el tampón de reconstitución para realizar una concentración final de 10 mg/ml. Dejar sentarse en hielo durante 10 minutos.
    2. Preparar alícuotas de 3 ml de la mezcla de tubulina y congelar el flash en nitrógeno líquido. Conservar las mezclas a -80oC.
  3. Polimerización de la tubulina en los TM
    1. Retirar una alícuota de 3 ol de tubulina del congelador de -80 oC y descongelar se descongele muy rápida y brevemente hasta la fase líquida sosteniendo la parte inferior del tubo. Colocar inmediatamente sobre hielo e incubar durante al menos 3 minutos.
    2. Capa suave de 3 l de mezcla de polimerización 2x (receta detallada en la Tabla 2)sobre la solución de tubulina. Mezcle moviendo suavemente el tubo, pero no mezcle pipeteando, ya que las fuerzas de cizallamiento pueden interrumpir la nucleación mt y el alargamiento.
    3. Incubar la mezcla en un baño de agua a 37oC durante 30 min.
    4. Capa suavemente 6 l de RT 1x BRB80 con suplementos (receta detallada en la Tabla 2)en la parte superior y mezcle con el parpadeo. No mezcle pipeteando.
    5. Incubar la mezcla a 37oC durante al menos 10 min.
    6. Proceda a la purificación de afinidad MT, o si hace ensayos TIRF, incubar MTs en la oscuridad en RT durante la noche para formar MTs más largos.
    7. Almacene los TM polimerizados durante semanas en la oscuridad en RT.

4. Purificación de afinidad de microtúbulos (MT)

  1. Eliminación de túbulinas no polimerizadas por centrifugación
    1. Mezclar los siguientes componentes para hacer un cojín de 60% de glicerol: 1x BRB80 (sin suplementos; receta detallada en la Tabla 2), 20 M Taxol (disuelto en DMSO), 1 mM de TDT y 60% de glicerol.
    2. Transfiera 60 ml del cojín de glicerol a un tubo ultracentrífugo. Capa suavemente de 12 l de los MM sin etiquetar polimerizados previamente en la parte superior del cojín. Para evitar el cizallamiento de los TM, transfiéralos con una punta de pipeta de corte.
    3. Centrifugar la mezcla a 97.300 x g a 22oC durante 15 min. Después del giro, el exceso de tubulinas permanecen en la capa líquida superior, mientras que los MT forman un pellet en la parte inferior. Marque el borde exterior del tubo antes del giro para ayudar a localizar el pellet, ya que el pellet puede no ser visible a simple vista.
    4. Retire con cuidado la capa líquida (-12 l) por encima del cojín de glicerol y ahorre 10 l para el análisis SDS-PAGE.
    5. Enjuague suavemente la interfaz entre la capa líquida y el cojín con 20 ml de 1x BRB80 con suplementos. Retire y deseche el enjuague de 20 l.
    6. Retire con cuidado el cojín de glicerol (60 l) y ahorre 10 l para el análisis SDS-PAGE. Tenga cuidado de no molestar al pellet MT.
    7. Enjuague suavemente el pellet con 60 ml de 1x BRB80 con suplementos (receta detallada en la Tabla 2). Tenga cuidado de no molestar al pellet MT. Deseche la solución de enjuague.
    8. Resuspenda el pellet de MT en 24 l de tampón de lisis suplementado con Taxol (receta detallada en la Tabla 3)utilizando una punta de pipeta cortada.
  2. Purificación de motores funcionales mediante cromatografía de afinidad basada en MT
    1. Retire dos alícuotas de 50 l de motores purificados de la levadura del congelador -80C y descongele rápidamente hasta la fase líquida. Colocar inmediatamente sobre hielo.
    2. Añadir los siguientes componentes a un nuevo tubo de ultracentrífuga en el orden indicado e incubar la mezcla a RT durante 10 min: (1) 100 l de los motores purificados de levadura, (2) 29 l de mezcla 5x ATP/Taxol (receta detallada en la Tabla 3), luego (3) 12 l de MTs tran purificados con una punta de pipeta de corte.
    3. Centrifugar la mezcla a 97.300 x g y 22 oC durante 15 min. Después del giro, los motores funcionales permanecen en el sobrenadante, y los MT forman un pellet, junto con los motores no funcionales unidos a ellos.
    4. Recoger el sobrenadante, congelar el flash en alícuotas de 2 l, y almacenar a -80 oC.
    5. Ahorre 10 l del sobrenadante para el análisis SDS-PAGE. Resuspenda el pellet en 141 éL de 1x BRB80 para el análisis SDS-PAGE, también. Utilice normas proteicas, como la actina, para crear una curva estándar para cuantificar la concentración de los motores purificados como se detalló anteriormente17.
    6. Utilice esta información de concentración al conjugar motores al chasis en el paso 6.1.3.

5. Producción de chasis de origami de ADN segmentado

  1. Formación del chasis
    1. Ordene los oligonucleótidos básicos enumerados en las tablas publicadas anteriormente8 en 96 placas de pozos mojadas a 250 m en tampón Tris, o sequeyas y luego resuspenderlas a 250 m con tampón Tris.
    2. Cree una piscina de las grapas del núcleo mezclando 5 ml de cada grapa de núcleo (consulte la tabla S1 en Driller-Colangelo 20168).
    3. Cree una piscina de las grapas del vinculador mezclando 5 ml de cada grapa del vinculador (consulte la tabla de grapas del vinculador en Driller-Colangelo 20168).
    4. Cree un conjunto de grapas de unión de fluoróforos mezclando 5 ml de cada grapa de mango de fluorofóforo (consulte la tabla de mango de fluoróforo s en Driller-Colangelo 20168).
    5. Mezclar reacciones de plegado de 50 l con los siguientes componentes: 1x tampón plegable; 100 nM 8064 andamios; 600 nM núcleo básico piscina de grapas; Piscina de grapas de fluoróforo de 600 nM; 9 m de hebra de fluoróforo (ver tabla antimanipulación de fluoróforo en Driller-Colangelo 20168); para cada sitio de encuadernación del motor, ya sea 4,2 m de hebras de mango extendido so o 600 nM hebras sin asas como se desee (ver tabla de grapas de mango/antimanipulación del motor en Driller-Colangelo 20168); 600 nM linkers como se desee8; adicional 6 mM MgCl2; y agua.
    6. Doblar en un ciclor térmico utilizando el siguiente programa: Calentamiento rápido a 80 oC, refrigeración en incrementos de un solo grado a 65 oC durante 75 minutos, luego refrigeración adicional en incrementos de un solo grado a 30 oC sobre 17,5 h.
    7. Calidad de plegado de ensayo en un gel de agarosa del 2% en tampón TBE de 0,5x (ver Tabla 4 para la receta) complementado con 11 mM MgCl2 y mancha de gel de ADN (ver Tabla de Materiales). Ejecutar gel en tampón TBE de 0,5x complementado con 11 mM MgCl2 a 70 V para 60-90 min. Ejecutar geles en un baño de agua helada o en una cámara frigorífica para evitar el calentamiento excesivo y la posterior desnaturalización de las estructuras del chasis.
    8. Imagen del gel utilizando condiciones adecuadas para la mancha de gel de ADN utilizada en el paso 5.1.7.
  2. Purificación del chasis
    1. A última hora de la tarde, el día anterior a la purificación, cree gradientes de glicerol colocando suavemente 80 ml cada uno de 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% y 15% glicerol en 1x tampón plegable de origami en un tubo de centrífuga (ver Tabla 4 para la receta). Los límites entre las capas deben ser ligeramente visibles.
    2. Incubar gradientes a 4oC durante la noche.
    3. A la mañana siguiente, añadir 45% de glicerol en 1x origami plomón plegable a la solución de chasis plegado a una concentración final de 10% glicerol. Mezclar suavemente y la capa en la parte superior del degradado en el tubo centrífugo.
    4. Gire el gradiente con el chasis a 243.000 x g durante 130 min a 4 oC.
    5. Recoger fracciones de 50 l del tubo en una dirección superior a inferior.
    6. Fundido un gel de agarosa del 2% en tampón TBE de 0,5x complementado con 11 mM MgCl2 y una mancha de gel de ADN.
    7. Cargar 5 l de cada fracción en el gel y ejecutar gel en 0.5x TBE tampón complementado con 11 mM MgCl2 para 90-120 min a 70 V. Ejecutar geles en un baño de agua helada o en una cámara fría para evitar el calentamiento excesivo y la posterior desnaturalización de las estructuras del chasis.
    8. Imagen del gel utilizando condiciones adecuadas para la mancha de gel de ADN utilizada en el paso 5.2.6.
    9. Seleccione fracciones para futuros experimentos que exhiban estructuras monoméricas bien plegadas libres de grapas no incorporadas.
    10. Concentraciones cuantificadas de fracciones seleccionadas utilizando métodos espectroscópicos apropiados, como la absorción UV a 260 nm. Utilice esta información de concentración al conjugar motores al chasis en el paso 6.1.3.

6. Fabricación de cámaras de ensayo de diapositivas

  1. Haga una cámara de ensayo deslizante pegando dos tiras de cinta adhesiva de doble cara a una diapositiva de vidrio y colocando un cubreobjetos en la parte superior. La cámara es el espacio estrecho entre el tapón y el tobogán de vidrio, flanqueado por las dos tiras de cinta. La Figura 1 ilustra la cámara de ensayo.
  2. Al preparar la diapositiva con soluciones, utilice una pipeta para fluir cualquier fluido en la cámara desde un lado y utilice una tira de papel de filtro para recoger el flujo del fluido en el otro lado.

7. Ensayo de motilidad de conjunto de motores TIRF

  1. Conjugación de motores al chasis de ADN
    1. En hielo, prepare 1 ml fresco cada uno de BRB80 complementado por TDT, tampón de lisis suplementado con Taxol y tampón de lisis suplementado con caseína-Taxol (recetas detalladas en la Tabla 5). Transfiera 200 l de cada tampón a un tubo RT.
    2. Todavía en el hielo, utilice el búfer de lisis suplementada con caseína-Taxol en frío para preparar las mezclas de energía 4x y carroñero 4x (recetas detalladas en la Tabla 5).
    3. Incubar 10 l de motores purificados de 300 nM con 5 sl de chasis de ADN de 10 nM sobre hielo durante 15-30 min. Se ha demostrado que estas concentraciones de motores saturan los sitios de unión de motores del chasis durante este tiempo de incubación.
      NOTA: la ocupación del motor no es del 100%, probablemente debido a la falta estocástica de grapas de mango en las estructuras individuales del chasis8,28.
    4. Durante la incubación, diluir la biotina y el fluoróforo MTs 100x con el tampón de lisis suplementado por RT Taxol, y preparar una resina de filtración de gel adecuada para la cromatografía de columna de exclusión de tamaño siguiendo el procedimiento descrito a continuación.
  2. Eliminación del exceso de motores del motor-chasis conjuga por cromatografía de columna de exclusión de tamaño
    1. En un tubo cónico de 50 ml, lavar 5 ml de la resina de filtración de gel 2x con 45 ml de ddH2O. Para cada lavado, mezcle la resina con agua en el tubo cónico y gire la mezcla a 460 x g durante 1 min. Deseche el sobrenadante y guarde la resina.
    2. Lavar la resina 2x con 45 ml de 1x tampón de lisis (receta detallada en la Tabla 5)utilizando el mismo método descrito anteriormente.
    3. Resuspenda la resina lavada en un tampón de lisis 1x en una proporción de 1:1, de modo que la resina se convierta en una suspensión del 50 % en tampón. La resina lavada se puede almacenar a 4 oC durante al menos 1 mes.
    4. Transfiera 800 l de la suspensión de resina a una columna de centrifugado. Escurrir el exceso de búfer por flujo de gravedad durante 5 min. Retire cualquier tampón restante con un giro de 2 giros a 1.000 x g. El volumen final de la resina debe ser de alrededor de 350-400 l.
    5. Diluir la mezcla motor-chasis con el amortiguador de lisis suplementado con caseína-Taxol a un volumen final de 50 l. Transfiera la mezcla diluida a la columna de espín llena de resina.
    6. Centrifugar la columna de giro a 1.000 x g durante 6 s (este tiempo incluye el tiempo de aceleración y desaceleración). Recoja los conjugados motor-chasis puros guardando el filtrado y deseche la columna que retiene el exceso de motores.
  3. Preparación de diapositivas para imágenes
    1. Flujo de 13 ml de albúmina sérica bovina biotinlada de 1 mg/ml en una cámara de ensayo de diapositivas. Incubar durante 2 min para permitir la unión de BSA al vidrio.
    2. Lave la cámara 2x con 20 l de la BRB80 suplementada con TDT RT fluyendo en el tampón en un lado de la cámara y eliminando el exceso de líquido lejos del otro lado usando una tira de papel de filtro.
    3. Flujo en 20 oL de estreptavidina de 0,5 mg/ml. Incubar durante 2 min para permitir la unión de estreptavidina a la biotina en la BSA.
    4. Lave la cámara 2x con 20 ml del tampón de lisis suplementado por RT Taxol.
    5. Flujo suave en 20 s de los MM diluidos con una punta de pipeta cortada. Incubar durante 2 min para permitir la unión entre la biotina en los MT y la estreptavidina.
    6. Lavar 2x con 20 l del tampón de lisis suplementado con caseína-Taxol RT. Incubar durante 2 min para permitir que la caseína permee toda la cámara.
    7. Diluir los conjugados motor-chasis purificados de 5x a 10x a condiciones de una sola molécula (10-100 pM) con el amortiguador de lisis suplementado con caseína-Taxol en frío. Mezclar los siguientes componentes para producir una mezcla final motor-chasis: 10 l de la dilución motor-chasis, 5 l de mezcla de energía 4x y 5 l de mezcla de carroñero de 4x.
    8. Flujo en 20 l de la mezcla motor-chasis final a la cámara de deslizamiento del ensayo y proceder a la microscopía TIRF.
  4. Adquisición de imágenes y datos
    1. Imagen de la diapositiva inmediatamente con un microscopio TIRF. Normalmente, cada diapositiva permanece útil durante entre 30 y 60 minutos.
    2. Adquiera una imagen fija en el canal MT y una película en el canal del chasis. Para los motores de este protocolo, las películas de 10 minutos con una velocidad de fotogramas de 0,5 fps y un tiempo de exposición de 200 ms son adecuadas.
    3. A partir de la película del chasis, genere un kymograph para cada MT en ImageJ o un software de procesamiento de imágenes similar29. Analizar las velocidades y longitudes de funcionamiento de los conjuntos motor-chasis midiendo las pendientes y distancias horizontales de las carreras en el kymograph30.

Resultados

Las purificaciones exitosas de motores y estructuras de chasis fueron analizadas por electroforesis de gel. El análisis SDS-PAGE confirmó la extracción exitosa de dinaína de la levadura(Figura 2),ya que el filtrado final recogido en el paso 2.3.7 mostró una banda clara y afilada en la posición de 350 kDa. Como era de esperar, esta banda de dynein estaba ausente del flujo y lavado que eliminaba las proteínas no deseadas, y las perlas de las que se ausen...

Discusión

Las técnicas de construcción molecular del origami de ADN proporcionan una manera única de construir conjuntos motores con arquitecturas definidas, números de motor y tipos, permitiendo estudios de cómo el comportamiento emergente surge de configuraciones motoras específicas31. A medida que los estudios estructurales y celulares continúan dilucidando ejemplos de motores citoesqueléticos que trabajan en equipos, las técnicas para aislar e investigar los mecanismos biofísicos y bioquímico...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a K. Chau, J. Morgan y A. Driller-Colangelo por contribuir a las técnicas del chasis segmentado de origami de ADN. También agradecemos a los antiguos miembros de los laboratorios Reck-Peterson y Shih por sus útiles discusiones y contribuciones al desarrollo original de estas técnicas. Agradecemos a J. Wopereis y al Smith College Center for Microscopy and Imaging y a L. Bierwert y al Smith College Center for Molecular Biology. Agradecemos el programa NSF MRI por la adquisición de un microscopio TIRF.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
2 mL Round Bottom TubeUSA Scientific1620-2700
Biotin labeled tubulin protein: porcine brain, >99% pureCytoskeleton.comT333P-A
Biotin-BSASigmaA8549-10MG
Bottle Assembly, Polycarbonate, 250 mL, 62 x 120 mmBeckman Coulter356013
Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate, 10.4 mL, 16 x 76 mmBeckman Coulter355603
Centrifugal Filter UnitMillipore SigmaUFC30VV00
IgG Sepharose 6 Fast Flow, 10 mLGE Healthcare17096901
Micro Bio-Spin Chromatography Columns, emptyBio-Rad7326204EDU
P8064 ScaffoldTilibit2 mL at 400nM
Poly-Prep Chromatography ColumnsBio-Rad731-1550
ProTev ProteasePromegaV6101
Scotch Double Sided Tape with Dispenseramazon.comN/A
Sephacryl S-500 HRGE Healthcare17061310
StreptavidinThermo Fisher434302
SYBR Safe DNA stainInvitrogen
Tubulin protein (>99% pure): porcine brainCytoskeleton.comT240-B
Tubulin, HiLyte 647Cytoskeleton.comTL670M-A
Ultra-Clear Centrifuge TubesBeckman Coulter344090

Referencias

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