Detectar el establecimiento de suministro de sangre compartido en ratones parabióticos mediante inyección de glucosa en vena caudal

Resumen

Aquí describimos un nuevo método para detectar el establecimiento exitoso de circulación sanguínea compartida de dos parabiontes a través de una inyección de glucosa en venas caudales, que causa un daño mínimo y no es mortal para los parabionts.

Resumen

La parabiosis es un método experimental para combinar quirúrgicamente dos animales paralelos a lo largo del eje longitudinal del cuerpo. Presentamos un protocolo para detectar el establecimiento exitoso de chimerismo sanguíneo en parabionts mediante una inyección de glucosa en vena caudal. Se construyeron ratones parabióticos. La glucosa se inyectó en el ratón del donante a través de la vena de la cola, y la fluctuación del nivel de glucosa en sangre se midió en ambos ratones utilizando un glucómetro de la sangre en diferentes momentos. Nuestros resultados mostraron que después de la inyección de glucosa, el nivel de glucosa en sangre en ratones donantes aumentó bruscamente después de 1 min y disminuyó lentamente a partir de entonces. Mientras tanto, el nivel de glucosa en sangre de los ratones receptores alcanzó un pico de 15 minutos después de la inyección. Se obtuvieron resultados similares con Evans azul, utilizado como un control positivo para la glucosa. La fluctuación sincrónica de los niveles de glucosa en sangre indica que el flujo sanguíneo entre los dos ratones se estableció con éxito.

Introducción

La parabiosis es un método de modelado en el que dos organismos vivos se unen quirúrgicamente y se desarrollan como un único sistema fisiológico con un sistema circulatorio compartido^1. Estos modelos se han utilizado ampliamente para estudiar la fisiología debido a la ventaja de que las sustancias producidas por un solo individuo pueden actuar sobre ambos animales al mismo tiempo a través del sistema circulatorio compartido. Desde mediados de la década de 1800, cuando los experimentos parabóticos fueron pioneros por Paul Bert^2,los métodos para construir modelos parabióticos se han estandarizado. Sin embargo, ha faltado un método sencillo y conveniente para verificar el establecimiento exitoso del chimerismo sanguíneo. Se ha informado de que la circulación cruzada puede evaluarse con éxito inyectando por vía intraperitoneal un 0,5% de tinte azul Evans en uno de los parabiontes seguido de la medición de la absorbancia del azul evans en la sangre de ambos parabionts con un lector de microplacas³. Otro método requiere una raza de ratón específica que contenga CD45.1⁺- y CD45.2^{+ -etiquetadamons}en cada parabiont. La citometría celular se utiliza para determinar el cinismo sanguíneo midiendo la frecuencia de los dos marcadores en monocitos del bazo o la sangre^4. Sin embargo, estos métodos son a menudo letales o engorrosos para los animales, y un método seguro y simple para la verificación rápida y confiable de los modelos parabióticos es altamente deseable. En este estudio, establecimos un nuevo método para este propósito, que fue validado en un modelo de ratón de parabiosis. La concentración de glucosa en muestras de sangre extraídas de una vena de cola se mide utilizando un glucómetro, y el patrón de cambios en el nivel de glucosa en ratones donantes y receptores se considera una indicación del chimerismo de circulación. Nombramos a este método el "método de fluctuación de glucosa". La aplicación de este método de validación no se limita a los ratones, sino que podría extenderse a diversos modelos patológicos, excepto aquellos con desregulación grave del metabolismo de la glucosa. El procedimiento es simple, ahorra tiempo y es seguro.

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Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con los animales y su cuidado fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Harbin.

NOTA: Las herramientas y equipos necesarios para el método se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Preparación de materiales y animales

1. Pedir ratones macho C57BL/6 con peso entre 20 g-25 g de un proveedor de animales de laboratorio estándar.
2. Casar a los ratones en un ciclo de 12 h de luz: 12 h de oscuridad a 24 o 26 oC con acceso ad libitum al agua y a los alimentos.

2. Parabiosis

1. Anestesiar a los ratones mediante inyección intraperitoneal de 20 g/L 2,2,2-tribromoetanol a una concentración de 0,1 mL/10 g. Confirmar la anestesia adecuada según lo indicado por la relajación muscular, la respiración lenta y constante, la pérdida del reflejo de estimulación cutánea y la desaparición del reflejo corneal.
2. Aplique pomada oftálmica con una punta Q para prevenir los ojos secos.
3. Realice el procedimiento de parabiosis como se describió anteriormente⁵.
   1. Coloque los ratones en posición supina. Afeitar a fondo el lado izquierdo de un ratón y el lado derecho del otro ratón comenzando aproximadamente 1 cm por encima del codo a 1 cm por debajo de la rodilla con una afeitadora eléctrica. Usa crema depilatoria para limpiar totalmente el pelaje de la piel asecada.
   2. Limpie las áreas afeitadas con yodoforo. Coloque los ratones en una almohadilla calentada cubierta por una almohadilla estéril.
   3. Crea incisiones longitudinales de la piel a partir de 0,5 cm por encima del codo hasta 0,5 cm por debajo de la articulación de la rodilla usando un par de tijeras afiladas en el lado afeitado de cada animal.
   4. Separe suavemente la piel de la fascia subcutánea después de la incisión.
   5. Conecta el olecranon y la rodilla del parabiont con una sutura 3-0.
   6. Sutura la piel arasada con una sutura continua de 5-0.
4. Inyectar 0,5 ml de 0,9% de NaCl por vía subcutánea a cada ratón para evitar la deshidratación.
5. Inyectar tramadol (10 mg/25 g/día) por vía intramuscular a cada ratón para aliviar el dolor.

3. Validación del chimerismo circulante

1. Método de fluctuación de glucosa
   NOTA: Verifique la construcción exitosa del chimerismo de circulación entre parabiontes utilizando el método de fluctuación de glucosa (sin ayuno) el día 10 después de la cirugía de parabiosis.
   1. Anestetizar los parabiontes mediante inyección intraperitoneal de 20 g/L 2,2,2-tribromoetanol a cada ratón a una concentración de 0,1 ml/10 g.
   2. Fije los ratones donantes en un fijador de cola de ratón visual Veous.
   3. Frota las venas caudales en el flanco de una de las colas del parabiont con una bola de algodón empapada en 70-75% de alcohol para limpiar la cola y dilatar los vasos sanguíneos.
   4. Sostenga una jeringa de 1,0 ml que contenga glucosa en la mano derecha y mantenga la aguja paralela a la vena (menos de 15o).
   5. Inserte la aguja en una posición de aproximadamente 2 x 4 cm de la punta de la cola.
   6. Inyectar 100 ml de glucosa (1,2 g/kg) en el donante en un plazo de 10 s.
      NOTA: El término donante se refiere al parabionte que recibe la inyección de glucosa a través de la vena de la cola. El receptor es el otro parabionte, que no recibe glucosa directamente.
   7. Limpie los dedos de los dedos de los dedos de los dedos con iodophor. Cortar los dedos de los dos del dono y los ratones receptores con una tijera y recoger una gota de sangre en diferentes puntos de tiempo después de la inyección de glucosa (1 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min, y 60 min). Retire el coágulo de sangre en cada punto de tiempo de recolección para evitar más daños.
      NOTA: El volumen de sangre recolectada fue de 10-25 ul para una prueba, y 90-225 ul en total.
   8. Incoar la sangre en el centro de las tiras reactivas del glucómetro para la detección del nivel de glucosa.
2. Usa la contramancha azul de Evan como control positivo³.
   1. Inyectar 200 ml de contramancha azul de Evan al 0,5% de la contramancha azul de Evan por vía intraperitoneal en el ratón del donante.
   2. 2 h más tarde, eutanasia los parabiontes mediante inyección intraperitoneal de 20 g/L 2,2,2-tribromoetanol a cada ratón a una concentración de 0,2 ml/10 g, y recoger sangre de ambos parabiontes por punción cardíaca.
   3. Centrifugar las muestras de sangre a 916 x g durante 15 min.
   4. Recoge el suero del sobrenadante.
   5. Diluir el suero con 0,9% de NaCl a la 1:50.
   6. Mida la absorbancia de las muestras de suero diluidas a 620 nm con un espectrofotómetro.

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Resultados

En seis ratones donantes, los niveles de glucosa en sangre aumentaron bruscamente a 26,5 émol/L (aumento del 173%) a un promedio de 1 min después de la inyección de 100 ml de glucosa (1,2 g/kg) a través de la vena de la cola y luego disminuyeron gradualmente a 13,3 mol/L a los 60 min. En ratones receptores, la glucosa en sangre aumentó lentamente después de la inyección y alcanzó el primer nivel máximo a 15 min (47% de aumento, 12,2 mol/L). Sobre la base de los resultados anterio...

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Discusión

La parabiosis se refiere a la técnica quirúrgica de conectar dos animales vivos para establecer un sistema vascular común por medios experimentales^6,7,8. La ventaja de este modelo es que las sustancias producidas por un solo individuo pueden actuar sobre ambos animales al mismo tiempo. Por lo tanto, el modelo de parabiosis se puede utilizar para explorar el papel de una sustancia o factor en una enfermedad relacionada, produc...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
curved forceps	JZ surgical Instruments, China	J31340
fine scissors	JZ surgical Instruments, China	WA1030
needle forcep	JZ surgical Instruments, China	60017961
2.5 mL syringes	Agilent, USA	5182-9642
Tribromoethano	Sigma-Aldrich, USA	T48402-5G
penicillin	Solarbio, China	IP0150
tramadol	Yijishiye, China	YJT712520
glucometer	Roche Diabetes Care, Indiana	Accu-Chek Active test strips
Evan's blue Counterstain	Solarbio, China	G1810
depilatory cream	Nair, USA	LL9161
Warming Blanket (Heating pad)	Kent Scientific Corp, USA	TP-22G
Electrical shaver	Codos, China	CP-5000
3-0,5-0 surgical suture	Shanghai Medical Suture Needle Factory, China	SYZ 3-0#, SYZ 5-0#