Integración de Enfoques Bioinformáticos y Validaciones Experimentales para Entender el Papel de la Señalización de Muesca en el Cáncer de Ovario

Resumen

La bioinformática es una forma útil de procesar conjuntos de datos a gran escala. Mediante la implementación de enfoques bioinformáticos, los investigadores pueden obtener de forma rápida, fiable y eficiente aplicaciones perspicaces y descubrimientos científicos. Este artículo demuestra la utilización de la bioinformática en la investigación del cáncer de ovario. También valida con éxito los hallazgos bioinformáticos a través de la experimentación.

Resumen

La señalización de muesca es una vía reguladora altamente conservada implicada en muchos procesos celulares. La desregulación de esta vía de señalización a menudo conduce a la interferencia con el desarrollo adecuado e incluso puede resultar en la iniciación o progresión de los cánceres en ciertos casos. Debido a que esta vía sirve funciones complejas y versátiles, se puede estudiar extensamente a través de muchos enfoques diferentes. De ellos, la bioinformática proporciona un método de estudio innegablemente rentable, accesible y fácil de usar. La bioinformática es una forma útil de extraer piezas más pequeñas de información de conjuntos de datos a gran escala. Mediante la implementación de diversos enfoques bioinformáticos, los investigadores pueden interpretar de forma rápida, fiable y eficiente estos grandes conjuntos de datos, produciendo aplicaciones perspicaces y descubrimientos científicos. Aquí, se presenta un protocolo para la integración de enfoques bioinformáticos para investigar el papel de la señalización de Notch en el cáncer de ovario. Además, los hallazgos de bioinformática se validan mediante la experimentación.

Introducción

La vía de señalización Notch es una vía altamente conservada que es importante para muchos procesos de desarrollo dentro de los organismos biológicos. Se ha demostrado que la señalización de muesca desempeña un papel importante en la proliferación celular y la autorrenovación, y los defectos en la vía de señalización de la muesca pueden conducir a muchos tipos de cánceres^1,2,3,4,5,6. En algunas circunstancias, la vía de señalización Notch se ha relacionado con el crecimiento de los tejidos y el cáncer, así como la muerte celular y la supresión tumoral⁷. Los receptores de muesca múltiple (NOTCH 1-4) y el mastermind del co-u2012activator (MAML 1-3), todos con diversas funciones, añaden un nivel adicional de complejidad. Mientras que la vía de señalización Notch es sofisticada en términos de funciones, su vía central es simple sobre una base molecular^8. Los receptores de muesca actúan como proteínas transmembranas compuestas de regiones extracelulares e intracelulares^9. Un ligando a la región extracelular de los receptores Notch facilita la escisión proteolítica, lo que permite que el dominio intracelular de notch (NICD) se libere en el núcleo. NICD se une a la mente maestra del activador de co-u2012 para activar la expresión génica descendente¹⁰.

En los últimos años, la señalización de la muesca ha demostrado desempeñar una variedad de papeles en la iniciación y progresión de varios tipos de cánceres en diferentes especies^6,11. Por ejemplo, la señalización Notch se ha relacionado con la tumorigenesis que afecta al gen humano NOTCH1 ^12. Recientemente, los genes NOTCH2, NOTCH3, Delta-like 3 (DLL3), Mastermind-u2012like protein 1 (MAML1)y un dominio de desintegrina y metaloproteinasa-u2012quecontiene proteína 17 (ADAM17) se mostraron fuertemente asociados con el cáncer de ovario, especialmente con la mala supervivencia general de los pacientes¹³.

A medida que aumenta continuamente la cantidad de datos experimentales y asociados al paciente, también aumenta la demanda de análisis de los datos disponibles. Los datos disponibles están dispersos en las publicaciones, y pueden ofrecer hallazgos incoherentes o incluso contradictorios. Con el desarrollo de nuevas tecnologías en las últimas décadas, como la secuenciación de próxima generación, la cantidad de datos disponibles ha crecido exponencialmente. Aunque esto representa avances rápidos en la ciencia y oportunidades para la investigación biológica continua, evaluar el significado de los datos disponibles públicamente para resolver preguntas de investigación es un gran desafío¹⁴. Creemos que la bioinformática es una forma útil de extraer piezas más pequeñas de información de conjuntos de datos a gran escala. Mediante la implementación de diversos enfoques bioinformáticos, los investigadores pueden interpretar de forma rápida, fiable y eficiente estos grandes conjuntos de datos, produciendo descubrimientos perspicaces. Estos descubrimientos pueden ir desde la identificación de posibles nuevos objetivos de terapia farmacológica o biomarcadores de enfermedades, hasta tratamientos personalizados para pacientes^15,16.

La bioinformática en sí misma está evolucionando rápidamente, y los enfoques están cambiando constantemente a medida que los avances tecnológicos barren la ciencia médica y biológica. Actualmente, los enfoques bioinformáticos comunes incluyen la utilización de bases de datos y programas de software de acceso público para analizar secuencias de ADN o proteínas, identificar genes de especial relevancia o importancia, y determinar la relevancia de genes y productos genéticos a través de la genómica funcional¹⁶. Aunque el campo de la bioinformática ciertamente no se limita a estos enfoques, estos son significativos para ayudar a los médicos e investigadores a gestionar los datos biológicos en beneficio de los pacientes en su conjunto.

Este estudio tiene como objetivo resaltar varias bases de datos importantes y su uso para la investigación sobre la vía de señalización Notch. NOTCH2, NOTCH3y su co-u2012activator MAML1 se utilizaron como ejemplos para el estudio de la base de datos. Estos genes se utilizaron porque se ha validado la importancia de la vía de señalización Notch en el cáncer de ovario. Los análisis sistemáticos de los datos recuperados confirmaron la importancia de la señalización de Notch en el cáncer de ovario. Además, debido a que la señalización de Notch está bien conservada en todas las especies, se confirmó que la sobreexpresión de Drosophila melanogaster NICD y Mastermind juntos puede inducir tumores en los ovarios drosofilia, apoyando los hallazgos de la base de datos y el papel significativo y conservado de la señalización de la muesca en el cáncer de ovario.

Protocolo

1. Predicción de los resultados clínicos de los perfiles genómicos (PRECOG)

NOTA: El portal PRECOG (precog.stanford.edu) accede a los datos disponibles públicamente de 165 conjuntos de datos de expresión de cáncer, incluidos los niveles de expresión génica y los resultados clínicos de los pacientes¹⁷. Proporciona específicamente el análisis Meta-u2012Z, que incorpora grandes conjuntos de datos para proporcionar puntuaciones de Z-u2012 de diferentes genes en 39 tipos de cáncer para indicar la supervivencia global del paciente. Las tasas de supervivencia deficientes y buenas se indican con valores positivos y negativos de puntuación Z-u2012, respectivamente.

1. Cree una cuenta con un correo electrónico académico afiliado para acceder a esta base de datos. Introduzca la dirección de correo electrónico y la contraseña asociadas a la cuenta.
2. Haga clic en el botón Ver detalles situado debajo del encabezado de análisis Meta-Z.
3. Introduzca el gen de interés en la barra de búsqueda.
4. Utilice la barra de desplazamiento situada en la parte inferior de la pantalla para obtener la puntuación Z de supervivencia para el tipo de cáncer específico de interés.

2. CSIOVDB

NOTA: CSIOVDB(csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html)es una base de datos de microarrays desarrollada por el Instituto de Ciencias del Cáncer de Singapur para estudiar el cáncer de ovario¹⁸. Esta base de datos contiene datos de carcinomas de diferentes sitios tumorales, así como datos normales del tejido ováros. Además, CSIOVDB proporciona parcelas de supervivencia Kaplan-u2012Meier para evaluar la supervivencia del paciente con niveles diferenciales de expresión génica. CSIOVDB se puede aplicar para investigar la asociación entre los niveles de expresión génica y las etapas/grados del cáncer de ovario.

1. Introduzca el gen de interés y, a continuación, haga clic en el botón Buscar.
2. Haga clic en la pestaña Estado de la enfermedad.
   NOTA: Esta pestaña proporciona estadísticas resumidas de la expresión génica del gen objetivo de interés en los estados de la enfermedad del cáncer de ovario.
3. Haga clic en la pestaña Histología.
   NOTA: Esta pestaña proporciona estadísticas resumidas de la expresión génica del gen objetivo de interés en las principales histologías de cáncer de ovario.
4. Haga clic en la pestaña Parámetros clinico-patológicos.
   NOTA: Esta pestaña proporciona una comparación de los niveles de expresión génica entre diferentes etapas del cáncer de ovario, grados y respuestas clínicas con pruebas Mann-Whitney.
5. Haga clic en la pestaña Supervivencia.
   NOTA: Esta pestaña proporciona gráficas Kaplan-Meier asociadas con La supervivencia general y la supervivencia libre de enfermedades. Para esta base de datos, la supervivencia libre de enfermedadse se considera supervivencia libre de progresión y recurrencia¹⁸. Los análisis multivariados para la supervivencia general y la supervivencia libre de enfermedades también se encuentran en esta pestaña. Los análisis multivariados comparan características relacionadas con los pronósticos de cáncer de ovario (etapa, grado, desbultamiento quirúrgico, histología, edad) y el gen de interés.
6. Haga clic en la pestaña Subtipo.
   NOTA: Esta pestaña proporciona estadísticas resumidas y pruebas de Mann-Whitney para el nivel de expresión del gen de interés en subtipos moleculares de cáncer de ovario. Esta pestaña también proporciona gráficas Kaplan-Meier asociadas con la supervivencia general y la supervivencia libre de enfermedades del gen de interés en subtipos moleculares de cáncer de ovario.

3. Expresión génica en el tejido normal y tumoral (GENT)

NOTA: El portal gent (medical-u2012genome.kribb.re.kr/GENT) es desarrollado y mantenido por el Instituto de Investigación de La Biociencia y La Biotecnología de Corea (KRIBB)¹⁹. Recopila 16.400 (U133A; 241 conjuntos de datos) y 24.300 (U133plus2; 306 conjuntos de datos) de muestras disponibles públicamente. Después de la estandarización, GENT ofrece datos de expresión génica a través de diversos tejidos, que se dividen en tumores y tejidos normales.

1. Haga clic en la pestaña Buscar en la parte superior de la pantalla.
2. En la sección etiquetada 1. Palabra clave, seleccione el símbolo Gene para los Términos en el menú desplegable, introduzca el símbolo genético del gen de interés en el área en blanco de la sección Palabra clave y seleccione Tejido para la opción Tipo.
3. Haga clic en el botón Buscar en la parte inferior de la 1. Sección de palabras clave. Muestra los gráficos resumidos de la expresión génica en tejidos normales y tumorales de diferentes tipos de cáncer basados en las plataformas U133A y U122Plus2.
   NOTA: Es opcional seleccionar la opción Filtrado de datos en la parte superior del gráfico de resumen para seleccionar una base de datos determinada para estudiar.
4. Haga clic en el vínculo situado junto a Descarga de datos de resultados para acceder a la información detallada sobre los valores de expresión génica, los tipos de tejido y las fuentes de datos.

4. Enciclopedia de la línea celular del cáncer del Instituto Amplio (CCLE)

NOTA: CCLE (portals.broadinstitute.org/ccle) fue creado por el Broad Institute y proporciona perfiles genómicos y mutaciones de 947 líneas celulares de cáncer humano^20.

1. Introduzca los genes deseados en la barra de búsqueda y, a continuación, haga clic en el botón Buscar.
2. En la sección seleccionada conjunto de datos, haga clic en la opción expresión mRNA (RNAseq) del menú desplegable.
   NOTA: Otras opciones incluyen expresión de ARNm (Affy), derribo de Aquiles shRNAy númerode copia .
3. Haga clic en el botón Alternar todas las trazas. Seleccione el tipo de tejido de interés en el cuadro gris de la derecha. Desplácese hacia abajo hasta la parte inferior de la pantalla y haga clic en el botón Descargar expresión mRNA.
4. Abra el documento de texto descargado. Copie y pegue todo el texto en la hoja 1. Copie todo el texto de la hoja 1.
5. Haga clic en la hoja en la pestaña Hoja 2 del software de hoja de cálculo en la parte inferior de la hoja de cálculo. Haga clic con el botón derecho en la columna A, seleccione Pegado especialy, a continuación, seleccione la opción Transponer en la hoja 2.
6. Una vez que el texto se transpone en dos columnas en la Hoja 2,haga clic en la flecha desplegable para el encabezado de la opción Ordenar y filtrar y luego seleccione la opción Filtro. Aparecerá una flecha en el área de encabezado denominada Gene. Haga clic en la flecha y escriba el tipo de tejido de interés.
   NOTA: Este paso filtrará todos los datos y solo mostrará los niveles de expresión génica para el tipo de tejido de interés.

5. cBioPortal

NOTA: cBioPortal (www.cioportal.org) fue desarrollado en el Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK), y accede, analiza y visualiza datos genómicos de cáncer a gran escala^21,22. Específicamente, este portal permite a los investigadores buscar alteraciones genéticas y redes de señalización.

1. Mediante la consulta de la página de destino, haga clic en los órganos/tejidos de interés en la sección seleccionada seleccionar estudios. Seleccione el estudio particular de interés y, a continuación, pulse el botón Consultar por genes.
2. En la sección seleccionadas perfiles genómicos, seleccione una de las tres opciones: mutaciones, alteraciones de número de copia putativa de GISTICo expresión de ARNm. Seleccione más los datos correspondientes en el menú desplegable Seleccionar paciente/conjunto de casos.
3. Introduzca los símbolos de genes de destino en el cuadro de consulta Intro genes. Haga clic en el botón Enviar consulta.
4. Haga clic en la pestaña Red en la parte superior de la página para recuperar la red genética deseada.
   NOTA: La red de señalización está codificada por colores. Los genes introducidos están indicados por nodos de semillas con un borde grueso. Cada gen está representado por un círculo rojo, y la intensidad del color del círculo rojo refleja su frecuencia de mutación. Los genes están conectados por líneas de diferentes colores. Las líneas marrones significan "En el mismo componente", lo que indica la participación en el mismo componente biológico. Las líneas azules significan "Reacciona con", lo que indica las reacciones genéticas. Las líneas verdes significan "cambio de estado", lo que sugiere que un gen podría causar un cambio de estado de otro gen.
5. Haga clic en la pestaña Archivo en la parte superior de la imagen para elegir Guardar como imagen (PNG) para la descarga de imágenes de red.

6. Disección de Drosophila con genotipos deseados y tinción DAPI

NOTA: Recoger la Drosophila femenina con los genotipos deseados, luego diseccionar los ovarios de la mosca para someterse a los procedimientos de tinción dAPI para la toma de imágenes.

1. Preparar las acciones de mosca tj-Gal4, Gal80ts/CyO; UAS-NICD-GFP/TM6B, w*; UAS-mam.A; y w[1118] para crear moscas con NICD-overexpression (tj-Gal4, Gal80ts/+; UAS-NICD-GFP/+) y NICD y mam-overexpression (tj-Gal4, Gal80ts/UAS-mam.A; Capacidad UAS-NICD-GFP/+).
2. Aplique la técnica de orientación a la expresión génica temporal y regional (TARGET) para controlar la expresión génica espaciotemporal²³. Levante las moscas a 18 oC hasta la edad adulta, luego cambie a 29 oC durante 48 h con levadura antes de la disección.
   NOTA: tj-Gal4 sólo puede controlar la expresión UAS bajo temperaturas más altas, cuando la inhibición por Gal80ts se alivia. La adición de levadura antes de la disección agranda los ovarios para la cosecha.
3. Colocar 3 ml de solución salina 1x tamponada con fosfato (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄) en una placa de recogida de embriones. Utilice una almohadilla de CO₂ para anestesiar a las moscas.
4. Elija una mosca hembra, luego agarre cuidadosamente el tórax inferior de la mosca usando un par de fórceps disecantes y sumerja en la solución 1x PBS en un plato de recolección de embriones. Usa un segundo par de fórceps para pellizcar la parte inferior del abdomen y tirar suavemente para liberar los órganos internos.
5. Identifique y separe el par de ovarios del cuerpo de la mosca. Romper la vaina muscular situada en el extremo posterior de los ovarios y separar los óvulos.
   NOTA: Se requiere separar los óvulos y romper la vaina muscular para lograr resultados de tinción de mayor calidad.
6. Coloque los ovarios en un tubo centrífugo de 1,5 ml que contenga 500 ml de 1 pbS. El tubo debe permanecer en hielo hasta que se recojan todos los ovarios.
7. Retire el 1x PBS y coloque 0,5 ml de solución fija (4% formaldehído) en el tubo. Coloque el tubo en el nutator durante 10 minutos.
8. Retire la solución fija del tubo y deséchela en un contenedor de residuos adecuado. Utilice 1 ml de 1pbT (1x PBS complementado con 0,4% de tritón™ X-100) para lavar los ovarios 3 veces durante 15 min.
9. Deseche el lavado PBT final y agregue 1 ml de PBTG (0,2% de albúmina sérica bovina, 5% de suero de cabra normal en 1x PBT) para evitar la unión inespecífica.
   NOTA: Este paso podría omitirse para la tinción DAPI, pero es esencial para la tinción de anticuerpos. La tinción de inmunohistoquímica detallada se puede encontrar en Jia et al.²⁴.
10. Colocar 150 sl de DAPI (10 g/ml) en el tubo durante 10 a 15 minutos de nuez. Deseche la DAPI y lave los ovarios 1veces durante 10 min usando 1 ml de 1x PBT. Retire el PBT y lave 2veces durante 10 minutos usando 1PBS.
11. Retire el exceso de PBS hasta que queden aproximadamente 300 ml de PBS en el tubo con los ovarios. Pipet a los ovarios hacia arriba y hacia abajo varias veces usando una pipeta de 200 l, con el fin de liberar las cámaras de óvulos.
12. Gire suavemente hacia abajo el tubo y retire cuidadosamente la mayor cantidad de 1x solución de PBS como sea posible sin quitar los ovarios. Colocar 120 ml de solución de montaje (1 g de gallato n-propilo, 5 ml de 10X PBS, 40 ml de glicerol y 5 ml de dH₂O) en el tubo.
    NOTA: La solución de montaje es pegajosa, por lo que es difícil transferir exactamente 120 l de solución de montaje en un tubo. Para aliviar este problema, se puede utilizar una punta de pipeta de 1.000 ml para añadir tres gotas de solución de montaje en el tubo.
13. Retire aproximadamente 0,33 mm de una punta de pipeta de 200 ml y utilice la punta de pipeta recién cortada para colocar la solución de montaje en un portaobjetos de vidrio del microscopio.
14. Coloque suavemente el vidrio de encubrimiento en la solución de montaje y selle los bordes del deslizamiento de la cubierta con esmalte de uñas transparente.
    NOTA: Es necesario sellar los bordes del cristal de la cubierta para evitar que las cámaras de huevo fluyan dentro de la solución de montaje al tomar imágenes confocales.
15. Adquirir imágenes con un microscopio confocal utilizando los siguientes ajustes: lente objetivo de aumento de 10x; apertura numérica : 0,8; Longitud de onda de emisión de DAPI a 410-513 nm.

Resultados

Utilizando el procedimiento mencionado en el paso 1 utilizando el portal PRECOG, se obtuvieron las puntuaciones Z de NOTCH2, NOTCH3y MAML1 en cáncer de ovario (1.3, 2.32, 1.62, respectivamente). Los valores negativos de la puntuación Z-u2012 indican la mala supervivencia global de los pacientes con altos niveles de expresión de los tres genes. Mediante el formato condicional del software de hoja de cálculo, los valores de puntuación Z-u2012 se muestran en un gráfico de ba...

Discusión

Como hay innumerables enfoques y métodos para la utilización de la bioinformática, hay numerosas bases de datos disponibles en línea para el público en general. Se puede extraer una gran cantidad de información de cada una de estas bases de datos, pero algunas son más adecuadas para propósitos particulares, como evaluar la supervivencia del paciente en función de ciertos insumos. Los análisis sistemáticos de los datos recuperados de diferentes bases de datos individuales pueden producir de manera convincente i...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen	D1306	1:1000 Dilution
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Powder, pH 7.4	ThermoFisher	FLBP6651	Dissolved with ddH2O to make 1X PBS
Goat serum	Gibco	16210064	Serum
Embryo dish	Electron Microscopy Sciences	70543-45	Dissection Dish
Nutating mixers	Fisherbrand	88861041	Nutator
tj-Gal4, Gal80ts/ CyO; UAS-NICD-GFP/ TM6B	Dr. Wu-Min Deng at Florida State University	N/A	Fly stock
w*; UAS-mam.A	Bloomington Drosophila Stock Center	#27743	Fly stock
w[1118]	Bloomington Drosophila Stock Center	#5905	Fly stock
The PRECOG portal	Stanford University	precog.stanford.edu	Publicly accessible database of cancer expression datasets
CSIOVDB	Cancer Science Institute of Singapore	csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html	Microarray database used to study ovarian cancer
The Gene Expression across Normal and Tumor tissue (GENT) Portal	Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB)	medical–genome.kribb.re.kr/GENT	Publicly accessible database of gene expression data across diverse tissues, divided into tumor and normal tissues.
Broad Institute Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE)	Broad Institute and The Novartis Institutes for BioMedical Research	portals.broadinstitute.org/ccle	Provides genomic profiles and mutations of human cancer cell lines
cBioPortal	Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK)	cioportal.org	Portal that allows researchers to search for genetic alterations and signaling networks
Zeiss 710 Inverted confocal microscope	Carl Zeiss	ID #M 210491	Examination and image collection of fluorescently labeled specimens