Células progenitoras coronarias y biomarcadores solubles en pronóstico cardiovascular después de la angioplastia coronaria

Resumen

El desarrollo de grandes eventos cardiovasculares adversos, que afectan el pronóstico cardiovascular después de la angioplastia coronaria, está influenciado por la extensión del daño coronario y la reparación vascular. El uso de nuevos biomarcadores celulares y solubles coronarios, reactivos al daño vascular y la reparación, son útiles para predecir el desarrollo de MACE y pronóstico.

Resumen

Los principales eventos cardiovasculares adversos (MACEs) afectan negativamente el pronóstico cardiovascular de los pacientes sometidos a angioplastia coronaria debido a una lesión isquémica coronaria. El alcance del daño coronario y los mecanismos de reparación vascular son factores que influyen en el desarrollo futuro de los MACEs. Las características vasculares intrínsecas como las características de la placa y la complejidad de las arterias coronarias han demostrado información de pronóstico para las MACEs. Sin embargo, el uso de biomarcadores circulantes intracoronarios se ha postulado como un método conveniente para la identificación temprana y el pronóstico de mace, ya que reflejan más de cerca los mecanismos dinámicos que implican daño coronario y reparación. La determinación de biomarcadores circulantes coronarios durante la angioplastia, como el número de subpoblaciones de células progenitoras mononucleares (MCC), así como la concentración de moléculas solubles que reflejan inflamación, adhesión celular y reparación, permite evaluación de la evolución futura y el pronóstico de MACEs 6 meses después de la angioplastia coronaria. Este método se destaca por su naturaleza traslacional y mejor rendimiento que los biomarcadores de circulación de sangre periférica con respecto a la predicción de los MACE y su efecto en el pronóstico cardiovascular, que puede aplicarse para la estratificación del riesgo de los pacientes con enfermedad de las arterias coronarias sometida a angioplastia.

Introducción

La angioplastia coronaria y la colocación de stents representan un procedimiento de salvamento para pacientes con enfermedad de las arterias coronarias (CAD). Sin embargo, los principales eventos cardiovasculares adversos (MACE), incluyendo muerte cardiovascular, infarto de miocardio, restenosis coronaria y episodios de angina de pecho o insuficiencia cardíaca descompensación, pueden ocurrir meses después de la intervención coronaria, lo que provoca visitas no programadas al hospital. Los MACE son comunes en todo el mundo y su morbimortalidad es alta¹.

La lesión isquémica coronaria induce la respuesta vascular temprana y los mecanismos reparadores que implican la movilización de los MMP debido a su capacidad de diferenciación y/o potencial angioreparador, así como la producción de moléculas solubles como moléculas de adhesión intercelular (ICAM), metaloproteinasas de matriz (MMP), y especies reactivas de oxígeno, que reflejan la adhesión celular, la remodelación de tejidos y el estrés oxidativo. Aunque se han utilizado características vasculares intrínsecas como las características de la placa y la complejidad de las arterias coronarias para predecir macEs, algunos estudios han sugerido que los biomarcadores relacionados con los mecanismos de lesión y reparación que se producen en el endotelio coronario podrían ser muy útiles para la identificación temprana y el pronóstico de eventos cardiovasculares en pacientes con CAD sometidos a angioplastia coronaria^2,3,4,5.

El interés continuo en comprender los mecanismos subyacentes a la lesión y reparación CAD ha motivado a los investigadores a estudiar los biomarcadores circulantes intracoronarios, ya que el muestreo coronario refleja más estrechamente el daño vascular y la reparación⁶. Sin embargo, la caracterización de biomarcadores coronarios en estudios en humanos ha sido escasa^7,8,9. Por lo tanto, el propósito del presente estudio fue describir un método para determinar la cantidad de MMP circulantes coronarios y moléculas solubles, reflejando tanto la lesión vascular y la reparación, y para mostrar si estos biomarcadores están asociados con las MACEs y el pronóstico clínico de pacientes con EAC que se sometieron a una angioplastia coronaria. Este método se basa en el uso de MMP circulantes y moléculas solubles relacionadas con el vascular obtenidos por lugares de muestreo más cercanos al daño del vaso. También puede ser útil para estudios clínicos para isquemia de miembros inferiores, accidente cerebrovascular, vasculitis, trombosis venosa, y otras lesiones que implican lesión vascular y reparación.

Protocolo

Este protocolo cumple con las directrices institucionales del Comité de ética de la investigación humana.

1. Angiografía coronaria, ultrasonido y muestreo de sangre

1. Solicitar información clínica y demográfica de referencia antes de la intervención coronaria. Recopilar los datos de la persona: edad, sexo, estado actual de tabaquismo, índice de masa corporal (IMC), presión arterial alta, dislipidemia, diabetes mellitus, medicamentos, y la indicación de la angiografía coronaria actual.
2. Realizar angiografía coronaria a través del cateterismo cardíaco utilizando un enfoque radial. Este procedimiento debe realizarse bajo una guía de fluoroscopia en la sala de hemodinámica por cardiólogos expertos.
   NOTA: Identificar recipientes evaluables. Para el presente estudio, los vasos evaluables se definieron como arterias con secciones de más de 1,5 mm y estenosis de lumen de más del 50%.
3. Avance el catéter de ultrasonido intravascular a la región de interés y registre imágenes. Utilice el software adecuado para localizar y medir el área luminal más pequeña.
4. Utilice un catéter coronario para recoger 10 ml de sangre desde el lugar más cercano a la placa.
5. Después del alta del paciente, programe evaluaciones médicas periódicas para realizar un seguimiento de los puntos finales del estudio. Si el contacto telefónico no es posible o una visita al médico se retrasa por más de 2 meses, solicite a una persona autorizada (previamente diseñada) que verifique los puntos finales del estudio.
   NOTA: Considere cualquiera de los siguientes MACE: 1) muerte cardiovascular, 2) nuevo infarto de miocardio, 3) angina inestable que provoca una visita médica no programada dentro de 24 h, 4) restenosis de stent como lo demuestra la angiografía coronaria, 5) episodios de descompensación insuficiencia cardíaca que requiere atención clínica.

2. Determinación de los MMP circulantes (Figura 2)

1. Procesar la sangre dentro de 1 h de la recolección. Transfiera 6 ml de la sangre recogida a un tubo cónico de 15 ml y diluya 1:1 (v/v) con 1 solución salina tamponada de fosfato (PBS), pH a 7,4.
2. Añadir 2 ml de gradiente de densidad medio a tres tubos de ensayo. Transfiera cuidadosamente tres alícuotas de volumen igual de sangre diluida a cada tubo de ensayo que contenga el medio de gradiente de densidad.
   NOTA: El volumen total de la densidad del medio gradiente y la sangre diluida no debe exceder las tres cuartas partes de la capacidad máxima del tubo de ensayo.
3. Centrífuga a 1.800 x g,4oC durante 30 min. Transfiera la banda en la interfaz entre las capas en un tubo nuevo. Añadir 2 mL de PBS y centrifugar a 1.800 x g,4oC durante 6 min. El pellet contendrá los MMP.
4. Lave el pellet varias veces. Aspirar la solución anterior y resuspender suavemente el pellet celular en PBS fresco. Para lavados posteriores, centrífuga a 1.800 x g,4oC durante 2 min. Repita el proceso 6x.
5. Resuspenda el pellet celular en 1 ml de PBS. Mezclar 20 l de la suspensión celular con 0,4% de trypan azul, diluido 1:1 (v/v). Aplique una gota a un hemocitómetro y cuente las células no retenidas bajo un microscopio de luz.
6. Proceda a la determinación de Los MMP. Etiquetar tubos de citometría de flujo de 5 ml y alícuota 1 x 10⁶ células por tubo. Prepare los anticuerpos de control coincidentes con isotipos correspondientes. Centrifugar a 1.800 x g,4oC durante 6 min y desechar el sobrenadante.
7. Añadir el anticuerpo primario diluido en 100 ml de una solución de incubación de anticuerpos que consiste en 1x PBS (pH a 7,4), 2 mM de ácido etilendiaminetetraacético (EDTA) y 0,05% de albúmina sérica bovina (BSA). Resuspender durante 10 s e incubar durante 20 min a 4oC, protegido por la luz. El protocolo puede ser pausado en este paso fijando los linfocitos en 4% paraformaldehído en PBS y almacenando muestras de hasta 24 h a 4 oC.
   NOTA: Las concentraciones finales de los anticuerpos primarios utilizados en el presente protocolo fueron CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50.
8. Centrifugar a 1.800 x g,4oC durante 2 min y desechar el sobrenadante. Resuspender en 500 s de 1pbS (pH a 7,4), 2 mM EDTA.
9. Realice el análisis de citometría de flujo. Utilice anticuerpos de control coincidentes con isotipos para configurar la tinción de fondo. A continuación, seleccione que los linfocitos se propagan en la gráfica FSC/SSC, tratando de excluir los granulocitos residuales, los desechos celulares y otras partículas, que generalmente se encuentran en la parte inferior, distribuidas a la izquierda en la gráfica. Dicha distribución se considera 100%.
10. Utilice una puerta que contenga un alto número de células con inmunofenotipos comunes CD45⁺ y CD34⁺. Para los inmunofenotipos dobles positivos, utilice una puerta que identifique previamente CD45⁺, CD34⁺, con la adición de KDR (VEGFR-2)⁺, CD133⁺, o CD184⁺. Identifique las subpoblaciones MPC por sus marcadores específicos de superficie celular. Informe como el porcentaje de eventos bloqueados.
11. Identificar las principales subpoblaciones de los MMP. En el presente estudio los principales inmunofenotipos fueron CD45⁺CD34⁺CD133⁺, CD45⁺CD34⁺CD184⁺, CD45⁺CD34⁺CD133⁺CD184⁺, CD45⁺CD34⁺KDR⁺, CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD133⁺, y CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD184.
    NOTA: Los marcadores de superficie celular utilizados fueron CD45 (linfocitos), CD34 (células endoteliales y/o vasculares), KDR (VEGFR-2, marcador de membrana de células endoteliales), CD133 (células progenitoras endoteliales) y CD184 (células madre hematopoyéticas y células endoteliales).

3. Determinación de biomarcadores solubles en plasma

1. Utilice un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para determinar la concentración de SICAM-1 y MMP-9(Figura 3,fila superior).
   1. Centrifugar las muestras de sangre a 3.000 x g,temperatura ambiente durante 5 min y recoger el plasma.
   2. Etiquete los estándares, tubos de muestra y tubos de control. Equilibre los pozos pre-recubiertos en la placa de ensayo lavando 2x con el tampón de lavado proporcionado en el kit ELISA.
   3. Transfiera los estándares, muestras y controles a los pozos. Sellar e incubar a 37oC durante 90 min.
      NOTA: No deje que los pozos se sequen por completo.
   4. Deseche el contenido y añada el anticuerpo de detección de biotina. Sellar e incubar a 37oC durante 60 min.
   5. Deseche el contenido y lave 3veces. Sellar la placa e incubar secuencialmente con solución de trabajo streptavidina seguida de sustrato de tetrametilbenzidina a 37 oC durante 30 min, protegido por la luz. Lavar 3x entre incubaciones. Cuando se desarrolle el color, agregue la solución de parada y lea la absorbancia de densidad óptica en un lector ELISA de microplaca.
2. Utilice un ensayo de multiplexación inmunomagnética para determinar la concentración del factor de necrosis tumoral alfa (TNF) y la interleucina 1 beta (IL-1o)(Figura 3,fila inferior).
   1. Etiquete los estándares, tubos de muestra y tubos de control.
   2. Vortex los viales de perlas magnéticas para 30 s. Transfiera la suspensión del cordón a tubos de tamaño adecuado, y luego a los pozos en la placa de ensayo de multiplexación. El vórtice periódico evita la precipitación de las cuentas.
   3. Inserte de forma segura la arandela de placa magnética de mano. Espere 2 minutos a que las cuentas se acumulen en la parte inferior de cada pozo e invierta rápidamente tanto la arandela de placa magnética de mano como el conjunto de placas, sobre un fregadero o contenedor de residuos. Recuerde utilizar la arandela de placa magnética de mano para mantener las cuentas dentro de los pozos.
   4. Añadir 150 l de tampón de lavado en cada pozo y esperar 30 s para permitir que las cuentas se acumulen en la parte inferior. Deseche el contenido como en el paso 3.2.3. A continuación, añada 25 ml de tampón de ensayo universal (proporcionado en el kit) seguido de 25 s de estándares, muestras y controles preparados.
   5. Sellar la placa e incubar durante al menos 60 minutos a temperatura ambiente, protegido por la luz, con agitación constante a 500 rpm. Alternativamente, incubar durante la noche a 4oC, protegido por la luz, con agitación constante a 500 rpm si es posible.
   6. Lavar 2 veces añadiendo 150 s de tampón de lavado y esperar 30 s. Deseche el contenido insertando la arandela de placa magnética de mano. Espere 2 minutos e invierta sobre un fregadero o contenedor de residuos.
   7. Incubar secuencialmente con 25 l de mezcla de anticuerpos de detección seguido de 25 l de solución de estreptavidina-PE a temperatura ambiente durante 30 minutos, sellados y protegidos por la luz, con temblor constante a 500 rpm. Lavar 2x entre incubaciones, como se describe en el paso 3.2.6.
   8. Obtenga las lecturas. Añadir 120 l de búfer de lectura. Sellar la placa e incubar 5 min a temperatura ambiente, protegido por la luz, con agitación constante a 500 rpm. Ejecute la lectura en un lector de ensayos de multiplexación. Ajuste los parámetros de lectura según cada analito.

Resultados

Se recogieron senos coronarios, senos venosos y sangre periférica de 52 pacientes que se sometieron a angiografía coronaria(Figura 1)y mostraron una alta prevalencia de hipertensión y dislipidemia. En el seguimiento clínico, 11 (21,1%) Los MACE se produjeron 6 meses después de la angiografía coronaria: muerte (n.o 1), angina de pecho que requirió asistencia hospitalaria (n.o 6), infarto de miocardio (n.o 2) y/o evidencia de insuficiencia cardíaca (n.o...

Discusión

La recolección de sangre de la arteria coronaria afectada puede ser difícil. A veces, la arteria coronaria apenas es accesible. En este caso, el muestreo del seno venoso puede ser una alternativa. Realizamos pruebas de validación comparando biomarcadores circulantes en arteria coronaria frente a seno venoso, sin diferencias significativas. Sin embargo, el rendimiento de los biomarcadores circulantes se validó únicamente para el muestreo coronario. Por lo tanto, el rendimiento de los biomarcadores obtenidos del seno ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA	Roche	10735086001	Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending.
Calibration Beads	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-607	MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests
CD133/1 (AC133)-PE	Milteny Biotec / MACS	#130-080-801	Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD184 (CXCR4)-PE-VIO770	Miltenyi Biotec / MACS	#130-103-798	Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated
CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-601	Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD34-FITC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-081-001	The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34
CD45- VioBlue	Miltenyi Biotec / MACS	#130-092-880	Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated
Conical Tubes	Thermo SCIENTIFIC	#339651	15ml conical centrifuge tubes
Cytometry Tubes	FALCON Corning Brand	#352052	5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12x75 style. Sterile.
EDTA	BIO-RAD	#161-0729	Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe <0.01%, As <1ppm, Insolubles <0.005%
Improved Neubauer	Without brand	Without catalog number	Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2)
K2 EDTA Blood Collection Tubes	BD Vacutainer	#367863	Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL.
Lymphoprep	Stemcell Technologies	01-63-12-002-A	Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL
Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH	#SZBF0920V	Fixation of biological samples, (powder, 95%)
Pipette Transfer 1,3mL	CRM Globe	PF1016, PF1015	The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy.
Test Tubes	KIMBLE CHASE	45060 13100	Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm