Nucleofección y Propagación In Vivo de Parásitos de La Eimeria de Pollo

Resumen

Aquí, proporcionamos un método para lograr la transfección estable de parásitos de pollo Eimeria mediante la nucleofectación de esporozoitos o merozoites de segunda generación. Los parásitos eimerianos modificados genéticamente que expresen genes antigénicos hetrólogos podrían utilizarse como vehículos de administración de vacunas.

Resumen

La transfección es un proceso técnico a través del cual el material genético, como el ADN y el ARN de doble cadena, se entregan en las células para modificar el gen de interés. Actualmente, la tecnología transgénica se está convirtiendo en una herramienta indispensable para el estudio de Eimeria,los agentes causales de la coccidiosis en aves de corral y ganado. Este protocolo proporciona una descripción detallada de la transfección estable en parásitos eimerianos: purificación y nucleofección de esporozoítos o merozoitos de segunda generación, y propagación in vivo de parásitos transinfectados. Utilizando este protocolo, logramos la transfección en varias especies de Eimeria. En conjunto, la nucleofección es una herramienta útil para facilitar la manipulación genética en parásitos eimerianos.

Introducción

Eimeria spp. causa coccidiosis, lo que conduce a pérdidas económicas sustanciales en la industria ganadera y avícola. Aunque los medicamentos anticoccidiales, y en cierta medida, las vacunas anticoccidiales atenuadas, se han utilizado ampliamente para el control de la coccidiosis, todavía existen deficiencias con respecto a su resistencia a los medicamentos, residuos de drogas y la posible difusión de cepas vacunales que recuperan la virulencia¹. Con el desarrollo de la biología molecular, la transfección se ha convertido en una herramienta vital para estudiar las funciones genéticas, desarrollar nuevas vacunas y detectar nuevas dianas farmacológicas para Eimeria.

En las últimas décadas, la transfección se ha aplicado con éxito para parásitos apicomplexianos como Plasmodium y Toxoplasma gondii^2,3,4,5,6. Un estudio con la galone como reportero para la transfección en E. tenella pilotó tal trabajo en Eimeria⁷. La transfección de E. tenella^8,9, E. mitis^10,y E. acervulina (Zhang et al., datos inéditos) tuvo éxito en pollos. Recientemente, logramos la transfección utilizando merozoitas de E. necatrix a través de la nucleofección¹¹.

Los estudios mostraron que Eimeria que expresa un antígeno hetrólogo tiene el potencial de desarrollarse como una vacuna recombinante, como las que expresan el antígeno A de Campylobacter jejuni (CjaA) o la interleucina de pollo 2 (chIL-2)^12,13. Por lo tanto, este protocolo describe un estudio de nucleofección de Eimeria spp. en pollos. El procedimiento describe la purificación de esporozoítos o merozoitos, nucleofección con plasma, inoculación cloacal/inyección intravenosa y propagación in vivo para ayudar a los investigadores a iniciar estudios sobre parásitos transgénicos de Eimeria.

Protocolo

Los pollos para todos los experimentos con animales fueron alojados y mantenidos de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Agrícola de China y siguieron los Principios Rectores Internacionales para la Investigación Biomédica que involucran a los animales. Los experimentos fueron aprobados por el Comité de Animales de Laboratorio de la Administración de Beijing.

1. Extracción y purificación de esporozoítos de Eimeria spp. (por ejemplo, E. tenella)

1. Liberación de esporocistos
   1. Centrifugar 1 x 10⁷ovocitos esporulados en solución de dicromato de potasio (2,5%, m/v) a 2.300 x g durante 5 min. Lávelos con PBS (solución tampón de fosfato) tres veces.
   2. Resuspenda los pellets con 1 ml de PBS y transfiera a un tubo de 15 ml. Agregue el mismo volumen de perlas de vidrio (rango de 1 mm x 1 mm de diámetro) y oscile la suspensión de ovocitos utilizando un mezclador de vórtice para liberar los esporocistos.
   3. Supervise la liberación de esporocistos mediante microscopía cada minuto. Deje de vórtice cuando más del 90% de los ovocitos estén rotos.
      NOTA: La mayoría de los ovocitos (como E. tenella, E. necatrixy E. acervulina)se rompieron después de 1 min utilizando el mezclador de vórtice.
   4. Transfiera la suspensión del esporocisto a nuevos tubos de 1,5 ml y centrífuga a 1.600 x g durante 5 min.
   5. Resuspender el precipitado con 1 ml de solución de gradiente de densidad del 50%, combinar en un tubo de 1,5 ml y centrifugar a 10.000 x g durante 1 min.
      NOTA: Para conocer la composición del gradiente de densidad, consulte la Tabla 1. El gradiente de densidad es un medio coloidal a base de sílice, que consiste en partículas de sílice coloidal de 15-30 nm de diámetro (23% p/p en agua), que han sido recubiertas con polivinilpirrolidona (PVP).
2. Liberación de esporozoítos
   1. Resuspenda el precipitado con el tampón de exciestación(Tabla 1) e incubar en un baño de agua de 42oC durante 40-60 min para liberar los esporozoitos. Deje de incubar cuando se libere más del 90% de los esporozoitas. A continuación, centrífuga a 600 x g durante 10 min.
      NOTA: Agitar los tubos una vez cada 5 minutos durante la excestación.
   2. Resuspenda la precipitación con 1 ml de solución de gradiente de densidad del 55% y centrífuga a 10.000 x g durante 1 min.
   3. Resuspende la precipitación con 1 ml de PBS y cuenta los esporozoítos usando un hemocitómetro.

2. Recogida y purificación de merozoitas de E. necatrix

NOTA: Utilice engorros Arbor Acre (AA) de 7 a 14 d años en el experimento. Los pollos libres de coccidia (n-3) fueron inoculados con 2 x 10⁵ ovocitos de E. necatrix. A las 109 h después de la infección, las aves fueron sacrificadas por dislocación cervical. El intestino fue extirpado para la recolección de los merozoítos de^2a generación. Para diferentes especies de Eimeria, hubo un tiempo diferente para la recolección de los memerozoitos de^2a generación: E. necatrix a las 109 h, y E. tenella a 112 h post-inoculación. Para la transfección de E. necatrix,los merozoites son la opción óptima ya que los segundos merozoites son fáciles de purificar.

1. Colección de los merozoites de segunda generación de E. necatrix
   1. Cortar el intestino de pollo longitudinalmente, desde el tallo de la yema (el medio del intestino delgado) hasta el orificio ileocecal, y lávelo con PBS o HBSS (Solución de sal equilibrada de Hank) suavemente tres veces en un plato de Petri.
   2. Cortar el intestino en trozos de 0,5 cm x 0,5 cm y colocarlo en un matraz cónico con un tampón de digestión (Tabla 1). Colocar el matraz sobre un mezclador magnético a 37oC con una barra de agitación durante 30-60 min para liberar merozoites. Después de 30 minutos de incubación, controlar la liberación de merozoites mediante un examen microscópico cada 5 min.
2. Purificar los merozoitas por filtración y centrifugación.
   1. Filtrar la suspensión que contiene merozoitas digeridos utilizando cuatro capas de gasa^14,y centrifugar a 600 x g durante 10 min.
   2. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante que contiene residuos intestinales. Transfiera la precipitación con merozoites purificados a tubos de 1,5 ml.
   3. Resuspende la precipitación con 1 mL de PBS y cuenta los merozoites usando un hemocitómetro.

3. Nucleofección de merozoites o esporozoítos

1. Preparación antes de la nucleofección de parásitos
   1. Preparar unos 10⁷ merozoites o esporozoítos en un tubo. Si transfecta los merozoitos, prepare 3-4 tubos.
   2. Preparar una cantidad de ADN plásmido o fragmento de PCR purificado que sea mayor o igual a 10 g.
      NOTA: El plásmido utilizado en este estudio contiene 2 genes: proteína fluorescente amarilla mejorada (EYFP) y dihidrofolato reductasa tirosa sintasa derivada de Toxoplasma gondii (TgDHFR-TS)¹⁵.
   3. Preparar 25 U de enzima de restricción. Si los plásmidos se linealizan, la enzima de restricción puede mejorar la eficiencia de la transfección. Si los plásmidos son circulares, omita la enzima de restricción.
   4. Preparar 85 ml de tampón de nucleofección: mezclar 20 ml de tampón de nucleofección I y 1 ml de tampón de nucleofección II, y utilizar una parte de la solución. El volumen del búfer total es de 100 l.
2. Nucleofección
   1. Centrifugar la suspensión de esporozoita o merozoita a 600 x g durante 10 min. A continuación, deseche el sobrenadante.
   2. En el siguiente orden, añadir 85 ml de tampón de transfección nuclear, 10 g de plásmido (fragmento de PCR) y 25 U de enzima de restricción (generalmente 5 l) en el tubo de 1,5 ml que contenga esporozoitos o merozoitos.
   3. Transfiera la suspensión a una taza de transfección nuclear. Pon la copa en una ranura de transferencia nuclear.
   4. Encienda el dispositivo de nucleofección utilizando el botón de encendido y seleccione el procedimiento de transfección U-033. Si el dispositivo de nucleofección se inicia en el modo Decisión de programa libre, salga de este modo pulsando el botón X.
   5. Cuando finalice el programa, pulse el botón X del dispositivo de nucleofección y la pantalla debe mostrar OK, lo que indica que la nucleofección se ha realizado correctamente.
   6. Añadir 0,5-1 ml del medio de águila modificada (DMEM)⁸ de Dulbecco a la copa de nucleofección para detener la reacción y transferir la suspensión al tubo de 1,5 ml después de mezclar suavemente.

4. Inoculación cloacal o inyección intravenosa

1. Inocular los parásitos nucleos en pollos de 7 días de edad. Inocular los merozoitas de E. necatrix o las esporozoias de E. tenella por vía cloacal, pero inocular E. acervulina esporozoitas mediante inyección intravenosa. Inocular alrededor de 2 x 10⁷ millones de esporozoítos en cada pollo, e incoluate merozoites 10⁷ para cada ave.

5. Clasificación de propagación y FACS

1. Recoger los ovocitos de las heces 5-9 días después de la inoculación con esporozoitos transinfectados. Recoger los ovocitos al tercer día después de inocular con merozoites transinfectados.
2. Utilice la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y 150 mg/kg de pirimetamina⁸ para aumentar sucesivamente la proporción de población transgénica.
   NOTA: Utilice pirimetamina agregándola directamente en el pienso. Para un uso más conveniente, preparar pirimetamina soluble en agua. Disolver 1 g de pirimetamina en 0,2 ml pf H₂SO₄ y 9,8 ml de N-metilpirrolidona (NMP), y luego añadir 1,5 ml de esta solución en 1 L de agua potable para las aves.

6. Purificación opcional de columnas

NOTA: Si se necesitan más esporozoítos o merozoitos puros, hay un método opcional que los purifica a través de una columna de celulosa dietilaminoethyl-52 (DE-52 celulosa).

1. Prepare la columna de celulosa DE-52 con al menos un día de antelación.
   1. Preparar el tampón eluyente de glicina (Tabla 1). Ajustar el pH del tampón eluyente de glicina de 7,6 a 8,0 y precalentado a 41 oC.
   2. Agregue 2,5 g de celulosa DE-52 a la columna. Agregue agua y remoje durante la noche. Descarta el sobrenadante.
   3. Añadir agua y remojar durante 1 h. Deseche el sobrenadante.
   4. Añadir 0.1 M NaOH y remojar durante al menos 2 horas. Repita este paso.
   5. Sustituya el sobrenadante por agua. Después de que la celulosa se asiente completamente hasta el fondo (alrededor de media hora), repita este paso.
   6. Deseche el sobrenadante, agregue 0.1 M HCl, y remoje durante al menos 2 horas. Repita este paso.
   7. Deseche el sobrenadante y remoje la celulosa dos veces con tampón eluyente de glicina.
   8. Mida y ajuste el pH de 7.6 a 8.0 agregando 0.1 M HCl o 0.1 M NaOH.
      NOTA: En esta parte, el líquido tiene al menos 5 veces más volumen que el de la celulosa DE-52.
2. Ajuste el caudal entre 40-50 r/min.
3. Cuando se complete la sedimentación de la celulosa, agregue la suspensión de esporozoita o merozoita a la columna cromatográfica. Ajuste el caudal a 30-40 r/min.
   NOTA: Resuspenda la precipitación de esporozoita o merozoita con el tampón eluyente de glicina antes de añadir la columna cromatográfica.
4. Recoger con tampón eluyente de glicina en tubos de 50 ml. Detener la recolección de acuerdo con los resultados del examen microscópico de esporozoítos o merozoites durante el proceso de elución.
5. Centrifugar el tampón eluyente de glicina recogido a 600 x g durante 10 min. Transfiera la precipitación de esporozoita o merozoita a nuevos tubos de 1,5 ml.
6. Cuenta los esporozoítos o merozoitos usando un hemocitómetro.

Resultados

Este protocolo se ha utilizado para transfectar parásitos eimeicos. En este estudio, los merontes y merozoites de^2a generación de E. necatrix se mostraron en la Figura 2A y la Figura 2B,mientras que la Figura 2C y la Figura 2D mostraron los esporoquistes y esporozoitos de E. ten...

Discusión

En la década de 1990, se desarrolló un sistema de transfección para parásitos apicomplexanos, y se utilizó para estudios sobre parásitos eimerianos. Recientemente, se llevó a cabo un transfectado estable en E. tenella^8,9 y E. nieschulzi¹⁵. Logramos la transfección estable de E. necatrix transfectando merozoites de segunda generación^11. La inoculación de esporozoitas transtrofadas...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
ATP-disodium	Sigma	A26209
Cellulose DE-52	Solarbio	C8350
Constant Flow Pump	SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD.	HL-2B
DMEM	MACGENE	CM15019
Glass beads	Sigma	Z250473-1PAK
Glucose	Sigma	No. V900116
Glycine	Biotopped	G6200
HBSS	MACGENE	CC016
KH2PO4	Sigma	No. V900041
Low Speed Centrifuge	BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD.	DT5-2
Magnetic Mixer	SCILOGEX	MS-H280-Pro
MgCl2	Sigma	449164
MoFlo cell sorter	BeckMan Coulter, US	201309995
NaHCO3	Sigma	144-55-8
Nucleofection device	LONZA/amaxa	90900012 (Nucleofector II)
PBS	Solarbio	P1010
Percoll (DG gradient stock solution)	GE Healthcare	17-0891-09
Sodium taurodeoxycholate hydrate	Sigma	T0875
Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge	ThermoFisher Scientific	75002430
The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES.
Trypsin	Solarbio	T8150
Vortex Mixer	Beijing North TZ-Biotech Develop.co.	HQ-60-II
Water Bath Thermostat	Grant Instruments (Cambridge), Ltd.	GD120,GM0815010