Producción de la plataforma de entrega de vacunas Core-Shell, sensible al infrarrojo cercano

Resumen

En este artículo se describen los protocolos utilizados para producir una nueva plataforma de administración de vacunas, "polybubbles", para permitir la liberación de ráfagas retrasadas. Se utilizaron poliésteres como poli(ácido láctico-co-glicólico) y policaprolactona para formar las poliburbujas y pequeñas moléculas y antígenos como carga.

Resumen

Las estrategias de administración de vacunas que pueden limitar la exposición de la carga a disolventes orgánicos al tiempo que permiten nuevos perfiles de liberación son cruciales para mejorar la cobertura de inmunización en todo el mundo. Aquí, se introduce una nueva plataforma inyectable, curable y retardada de liberación por ráfaga, que permite la administración de vacunas llamada polybubbles. La carga se inyectó en poliburbujas a base de poliéster que se formaron en una solución acuosa basada en carboximetilululosa al 10%. Este documento incluye protocolos para mantener la forma esférica de las poliburbujas y optimizar la colocación y retención de la carga para maximizar la cantidad de carga dentro de las poliburbujas. Para garantizar la seguridad, se analizó el contenido de disolvente clorado dentro de las poliburbujas mediante el análisis de activación de neutrones. Se realizaron estudios de liberación con moléculas pequeñas como carga dentro de la poliburbuja para confirmar la liberación tardía de ráfagas. Para mostrar aún más el potencial de entrega bajo demanda de la carga, los nanorods de oro se mezclaron dentro de la carcasa de polímero para permitir la activación del láser infrarrojo cercano.

Introducción

La cobertura limitada de inmunización da lugar a la muerte de 3 millones de personas causadas específicamente por enfermedades prevenibles mediante^{vacunas 1}. Las condiciones inadecuadas de almacenamiento y transporte conducen al desperdicio de vacunas funcionales y, por lo tanto, contribuyen a reducir la inmunización mundial. Además, la vacunación incompleta debida a no adherirse a los calendarios de vacunas requeridos también provoca una cobertura vacunada limitada, específicamente en los países en desarrollo². Se requieren varias visitas al personal médico dentro del período recomendado para recibir inyecciones de refuerzo, limitando así el porcentaje de población con vacunación completa. Por lo tanto, es necesario desarrollar nuevas estrategias para la administración controlada de vacunas a fin de eludir estos desafíos.

Los esfuerzos actuales para desarrollar tecnologías de administración de vacunas incluyen sistemas poliméricos basados en emulsiones^3,,4. Sin embargo, la carga a menudo está expuesta a una mayor cantidad de disolvente orgánico que puede causar potencialmente agregación y desnaturalización, específicamente en el contexto de la carga basada en^{proteínas 5,,6}. Hemos desarrollado una nueva plataforma de entrega de vacunas, "poliburbujas", que potencialmente puede albergar múltiples compartimentos de carga mientras minimiza el volumen de carga que está expuesto al disolvente^7. Por ejemplo, en nuestra plataforma de poliburbujas de núcleo-shell, se inyecta un bolsillo de carga de diámetro 0,38 mm (SEM) en el centro de una poliburbuja de 1 mm. En este caso, la superficie de la carga expuesta al disolvente orgánico sería de aproximadamente 0,453 mm^2. Después de considerar la densidad de embalaje de las esferas (micropartículas) dentro de una esfera (depósito de carga), el volumen real de micropartículas (10 m de diámetro) que podría caber en el depósito es de 0,17 mm^3. El volumen de una micropartícula es de 5,24x10^-8 mm³ y, por lo tanto, el número de micropartículas de partículas que pueden ajustarse al depósito es de 3,2x10⁶ partículas. Si cada micropartícula tiene 20 bolsillos de carga (como resultado de la doble emulsión) de 0,25 m de diámetro, entonces la superficie de carga expuesta al disolvente orgánico es de 1274 mm^2. Por lo tanto, el depósito de carga dentro de la poliburbuja tendría una superficie menos expuesta al disolvente orgánico en comparación con la de la carga orgánica expuesta a disolventes en micropartículas. Por lo tanto, nuestra plataforma a base de poliéster puede reducir potencialmente la cantidad de carga expuesta a disolvente orgánico que, de lo contrario, puede causar agregación de carga e inestabilidad.

Las poliburbujas se forman sobre la base del principio de separación de fase donde el poliéster en fase orgánica se inyecta en una solución acuosa que resulta en una burbuja esférica. La carga en la fase acuosa se puede inyectar en el centro de la poliburbuja. Otro compartimiento de carga se puede lograr potencialmente dentro de la poliburbuja mezclando una carga diferente con la cáscara de polímero. La poliburbuja en esta etapa será maleable y luego se curará para dar lugar a una estructura de poliburbuja sólida con carga en el medio. Se eligieron poliburbujas esféricas sobre otras formas geométricas para aumentar la capacidad de carga dentro de la poliburbuja, minimizando al mismo tiempo el tamaño total de la poliburbuja. Las poliburbujas con carga en el centro fueron elegidas para demostrar la liberación de ráfaga retrasada. Las poliburbujas también se incorporaron con un agente sensible al infrarrojo cercano (NIR), es decir, habilitador de la teología, a saber, nanorods de oro (AuNR), para provocar un aumento de la temperatura de las poliburbujas. Este efecto podría facilitar potencialmente una degradación más rápida y podría utilizarse para controlar la cinética en futuras aplicaciones. En este documento, describimos nuestro enfoque para formar y caracterizar poliburbujas, para lograr la liberación de ráfagas retrasadas de las poliburbujas, e incorporar AuNR dentro de las poliburbujas para causar la activación de NIR.

Protocolo

1. Síntesis de triacrilato de policaprolacilana (PCLTA)

1. Secar 3,2 ml de triol de policaprolacyona (PCL) de 400 Da durante la noche a 50oC en un matraz inferior redondo abierto de 200 ml y K₂CO₃ en un vial de vidrio a 90oC.
2. Mezclar el triol con 6,4 ml de diclorometano (DCM) y 4,246 g de carbonato de potasio (K₂CO₃₎bajo argón.
3. Mezclar 2,72 ml de cloruro de acriloilo en 27,2 ml de DCM y añadir gota a la mezcla de reacción en el matraz durante 5 min.
4. Cubra la mezcla de reacción con papel de aluminio y déjela intacta a temperatura ambiente durante 24 horas bajo argón.
5. Después de 24 h, filtre la mezcla de reacción con un papel de filtro en un embudo Buchner al vacío para descartar el exceso de reactivos.
6. Prefría el filtrado del paso 1.5 que contiene el polímero endcapped en éter dietílico en un 1:3 (vol/vol) y rotovape a 30oC para eliminar el éter dietílico.

2. Formación de la poliburbuja

NOTA: La inyección de polímero en el agua desionizada (DI) haría que las poliburbujas migraran a la parte inferior del vial, lo que resultaría en un fondo aplanado. Utilice 10% (wt/vol) carboximetilcelulosa (CMC) llenar el vial de vidrio en su lugar para evitar el aplanamiento de la poliburbuja.

1. Preparar una solución de CMC al 10% (wt/vol) en agua DI.
2. Llene un vial de vidrio de 0,92 ml con 0,8 ml de 10% CMC utilizando una pipeta de transferencia de 1 ml.
3. Mezclar 1000 mg/ml de 14 kDa PCL en DCM y sintetizar PCLTA en un 1:3 (vol/vol) para un volumen total de 200 l o preparar 200 l de 1000 mg/ml de 5 kDa de poli (ácido láctico-co-glicólico) diacrilato (PLGADA) en cloroformo.
4. Mezclar la 2-hidroxi-4o-(2-hidroxitoxi)-2-metilpropiofenona (fotoiniciador) con la mezcla de polímero (PLGADA o PCL/PCLTA) en 0.005:1 (vol/vol).
5. Cargue 200 l de mezcla de polímeros en una jeringa de vidrio de 1 ml montada en una bomba de jeringa que esté conectada a un tubo de acero inoxidable dispensador con un diámetro interior de 0,016 pulgadas.
6. Utilice un micromotor para controlar el movimiento hacia adelante y hacia atrás del tubo de polímero para inyectar polímero en el 10% CMC en el vial de vidrio para formar la poliburbuja.
7. Curar las poliburbujas bajo ultravioleta (UV) a 254 nm longitud de onda durante 60 s a 2 W/cm².
8. Congelar flash las poliburbujas en nitrógeno líquido y liofilizar durante la noche a 0,010 mBar vacío y a -85 oC.
9. Separe las poliburbujas del CMC seco usando fórceps y lave las poliburbujas con agua DI para eliminar cualquier CMC residual. Tenga en cuenta que es probable que se utilicen otros polímeros con modificaciones para alterar la cinética de liberación.

3. Modulación del diámetro de la poliburbuja

1. Llene un vial de vidrio de 0,92 ml con 10% CMC utilizando una pipeta de transferencia de 1 ml.
2. Mezclar PCL/PCLTA en un 1:3 (vol/vol) con 1000mg/mL 14kDa PCL y sintetizar PCLTA. Mezclar el fotoiniciador con la mezcla de polímeros en un 0.005:1 (vol/vol).
3. Cargue la mezcla de polímeros en una jeringa de vidrio de 1 ml montada en una bomba de jeringa que esté conectada a un tubo de acero inoxidable dispensador con un diámetro interior de 0,016 pulgadas.
4. Utilice un micromotor para controlar el movimiento hacia adelante y hacia atrás del tubo de polímero para inyectar polímero en el 10% CMC en el vial de vidrio para formar la poliburbuja.
5. Para obtener poliburbujas con varios diámetros, varíe la tasa de dosificación de 0.0005 a 1 l/s.
6. Tome imágenes del vial con las poliburbujas con diámetro variable.
7. Utilice ImageJ para cuantificar el diámetro de las poliburbujas y utilizar el tamaño del vial como escala.

4. Centrar la carga dentro de la poliburbuja

1. Modulación de la viscosidad PCL/PCLTA utilizando K₂CO₃:
   NOTA: La viscosidad de PLGADA no tiene que modificarse utilizando K₂CO₃ porque la viscosidad de 5 kDa PLAGDA a 1000 mg/ml es suficiente para centrar la carga.
   1. Añadir K₂CO₃ (que se aisló después de la reacción PCLTA) a la PCLTA en diferentes concentraciones, incluyendo 0 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml, 40 mg/ml y 60 mg/ml.
   2. Mida las viscosidades dinámicas de las soluciones cambiando la velocidad de cizallamiento de 0 a 1000 1/s utilizando la reometría.
   3. Inyectar manualmente la carga en el medio (consulte el paso 4.2 para preparar la mezcla de carga) de las poliburbujas que se formaron utilizando las soluciones PCL/PCLTA con diferentes concentraciones de K₂CO₃ (paso 4.1.1). Determinar la concentración óptima de K₂CO₃ observando qué solución del paso 4.1.1 puede resultar en la retención de la carga en el medio.
2. Centrado de la carga (ya se muestra viabilidad con moléculas pequeñas) con CMC
   1. Mezclar la carga con 5% (wt/vol) CMC en un rotador durante la noche para aumentar la viscosidad de la carga.
   2. Inyectar manualmente 2 l de mezcla de carga en la poliburbuja y proceder con el curado UV a 254 nm de longitud de onda durante 60 s a 2 W/cm².
   3. Congelar flash las poliburbujas en nitrógeno líquido durante 30 s y liofilizar durante la noche a 0,010 mBar vacío y a -85 oC.
   4. Separe las poliburbujas del CMC seco usando fórceps y lave con agua DI para eliminar cualquier CMC residual.
   5. Corte la poliburbuja por la mitad e imagine las mitades usando microscopía confocal para asegurarse de que la carga está centrada (consulte el paso 6 para las longitudes de onda de excitación y emisión utilizadas).

5. Formulación de carga

NOTA: La formulación de poliburbujas puede albergar varios tipos de carga, incluyendo moléculas pequeñas, proteínas y ácidos nucleicos.

1. Sobre la base de estudios anteriores, en el caso de la carga proteica, utilizar excipientes incluyendo polietilenglicol (PEG)^6,polivinilpirrolidona (PVP), y glucopolímeros⁶ para mejorar la estabilidad de la proteína durante la formulación de poliburbuja.
2. Forme poliburbujas basadas en el protocolo del paso 2.
3. Preparar la solución de antígeno añadiendo 17,11 g de trehalosa a 625 l de antígeno VIH gp120/41.
4. Inyecte manualmente 1 ml de solución de antígeno en el centro de la poliburbuja.
5. Abra las poliburbujas en los días 0, 7, 14 y 21, y registre la fluorescencia del antígeno con longitudes de onda de excitación y emisión 497 nm y 520 nm, respectivamente.
6. Determinar la funcionalidad del antígeno mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y utilizar 5% de leche sin grasa como tampón de bloqueo.

6. Liberación de carga

NOTA: La molécula o antígeno pequeño se puede utilizar como tipo de carga

1. Molécula pequeña
   1. Incubar poliburbujas con acriflavina centrada en 400 l de solución salina tampón de fosfato (PBS) a 37 oC, 50 oC para poliburbujas PLGADA y a 37 oC, 50 oC, 70 oC para poliburbujas PCL/PCLTA.
      NOTA: La razón por la que recomendamos probar las temperaturas por encima del cuerpo es a) simular la temperatura (50 oC) a la que alcanza la poliburbuja mientras se láser de las nanorods de oro (AuNRs) dentro de PCL y PLGA; y b) acelerar el proceso de degradación de LA PCL (50oC, 70oC).
   2. En cada momento, recoja los sobrenadantes y sustitúyalo con 400 l de PBS fresco.
   3. Utilice un lector de placas para cuantificar las intensidades de fluorescencia en los sobrenadantes recogidos.
      NOTA: Utilice ex/em de 416 nm/514 nm para acriflavine.
2. Antígeno
   1. Incubar poliburbujas con suero de albúmina bovina centrada (BSA)-488 en 400 l de PBS a 37 oC, 50 oC para poliburbujas PLGADA y a 37 oC, 50 oC para las poliburbujas PCL/PCLTA.
   2. En cada momento, recoja los sobrenadantes y sustitúyalo con 400 l de PBS fresco.
   3. Utilice un lector de placas para cuantificar las intensidades de fluorescencia en los sobrenadantes recogidos. Utilice ex/em de 497 nm/520 nm para BSA-488.
      NOTA: No se debe realizar un estudio de liberación a 70 oC para las poliburbujas PCL/PCLTA para evitar exponer el antígeno a temperaturas extremas.

7. Toxicidad

1. Cuantificación del contenido de cloro en poliburbujas mediante el análisis de activación de neutrones (NAA)
   1. Utilice poliburbujas que fueron liofilizadas durante 2, 4, 6, 20 y 24 h para este estudio a 0,010 mBar vacío y a -85 oC.
   2. Mida 5-9 mg de poliburbujas y colóquelos en viales de irradiación LDPE.
   3. Prepare 1000 g/ml de solución de calibración de cloro de la solución de calibración rastreable del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST).
   4. Utilice el reactor Triga de 1 megavatios para llevar a cabo irradiaciones de neutrones en cada muestra a una velocidad de fluencia de neutrones de 9,1 ×^{10 12} /cm²s para 600 s.
   5. Transfiera las poliburbujas a viales sin racionados.
   6. Utilice el detector HPGe para obtener espectros de rayos gamma durante 500 s después de intervalos de descomposición de 360 s.
   7. Utilice el software NAA de Canberra Industries para analizar los datos.
2. Cuantificar el contenido de cloro liberado de las poliburbujas utilizando NAA
   1. Incubar poliburbujas que fueron liofilizadas durante la noche (a 0,010 mBar de vacío y a -85 oC) en 400 oC de PBS a 37 oC.
   2. Recoger los sobrenadantes en las semanas 1, 2 y 3 después de la incubación.
   3. Analice los sobrenadantes para el contenido de cloro utilizando NAA utilizando el mismo método descrito anteriormente en el paso 7.1.

8. AuNR Synthesis de Kittler, S., et al.⁸

1. Preparar la solución de siembra de AuNR mezclando 250 l de ácido cloroáurico de 10 mM (HAuCl₄), 7,5 ml de bromuro de cetrimonio de 100 mM (CTAB), y 600 l de 10 mM de borohidruro de sodio frío en hielo (NaBH_4).
2. Preparar la solución de crecimiento mezclando 40 ml de CTAB de 100 mM, 1,7 ml de 10 mM HAuCl_4,250 ml de nitrato de plata (AgNO₃₎y 270 l de ácido ascórbico de 17,6 mg/ml a un tubo.
3. Mezcle vigorosamente 420 ml de solución de semillas con la solución de crecimiento a 1200 rpm durante 1 min. A continuación, deje la mezcla intacta para reaccionar durante 16 h.
4. Retire el exceso de reactivos de la mezcla centrifugando a 8000 × g durante 10 min y deseche el sobrenadante.

9. Hidrofobicización de AuNRs por Soliman, M.G., et al.^9.

1. Ajuste el pH de 1,5 ml de auNR sintetizados estabilizados por CTAB a 10 utilizando hidróxido de sodio de 1 mM (NaOH).
2. Revuelva la solución con 0,1 ml de tiol PEG metilado de 0,3 mM (mPEG) a 400 rpm durante la noche.
3. Mezclar LOS AUNR peginados con 0,4 M de dodecilamina (DDA) en cloroformo a 500 rpm durante 4 días.
4. Pipetear la capa orgánica superior que contiene AuNRs hidrofbicizados y almacenar a 4 oC hasta su uso futuro.

10. Activación NIR de poliburbujas

1. Mezclar la solución de polímero (PLGADA o PCL/PCLTA) con AuNRs hidrofbicizados en un 1:9 (vol/vol).
2. Añadir fotoiniciador a la mezcla polímero-AuNR en un 0.005:1 (vol/vol).
3. Forme poliburbujas inyectando la mezcla polímero-AuNR en un vial de vidrio de 0,92 ml con 10% cmC (wt/vol) (consulte el paso 2).
4. Curar las poliburbujas a 254 nm longitud de onda durante 60 s a 2 W/cm².
5. Congelación repentina de nitrógeno líquido durante 30 s y liofilizar durante la noche a 0,010 mBar vacío y a -85 oC.
6. Separe las poliburbujas secas con fórceps y lave con agua DI para eliminar cualquier CMC residual.
7. Incubar las poliburbujas en 400 oL de PBS a 37 oC.
8. Active las poliburbujas usando láser NIR de 801 nm a 8A durante 5 minutos cada lunes, miércoles y viernes.
9. Tome imágenes infrarrojas (FLIR) con visión de futuro de la poliburbuja antes y después de la activación láser para obtener valores de temperatura.
10. Calcule las diferencias de temperatura entre antes y después de la activación láser en función de los valores de temperatura de las imágenes FLIR.

Resultados

Las poliburbujas se caracterizaron ampliamente utilizando SEM y NAA. La carga se centró con éxito para dar lugar a una liberación de ráfaga retrasada. Las poliburbujas también se activaron con éxito con láser debido a la presencia de AuNRs dentro de las poliburbujas.

Caracterización de la poliburbuja
Las burbujas inyectadas en una solución acuosa sin CMC dieron lugar a una poliburbuja aplanada debido...

Discusión

Tecnologías y desafíos actuales
Las micropartículas y nanopartículas a base de emulsión se han utilizado comúnmente como portadores de administración de fármacos. Aunque la cinética de liberación de la carga de estos dispositivos ha sido ampliamente estudiada, el control de la cinética de liberación de ráfagas ha sido un desafío importante¹¹. La versatilidad y funcionalidad de la carga también está limitada en sistemas basados en emulsiones debido a la exposici?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Step Ultra Tetramethylbezidine (TMB)-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Substrate Solution	Thermo scientific	34028
2-Hydroxy-2-methylpropiophenone	TCI AMERICA	H0991
450 nm Stop Solution for TMB Substrate	Abcam	ab17152
Acryloyl chloride	Sigma Aldrich	A24109-100G
Acriflavine	Chem-Impex International	22916
Anhydrous ethyl ether	Fisher Chemical	E138-500
Anti-HIV1 gp120 antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP)
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher BioReagents	BP9700100
BSA-CF488 dye conjugates	Invitrogen	A13100
Bromosalicylic acid	Acros Organics	AC162142500
Carboxymethylcellulose (CMC)	Millipore Sigma	80502-040
Centrimonium bromide (CTAB)	MP Biomedicals	ICN19400480
Chloroform	Fisher Chemical	C2984
Coating buffer	Abcam	ab210899
Dichloromethane (DCM)	Sigma Aldrich	270997-1L
Diethyl ether	Fisher Chemical	E1384
Dodeacyl Amine	Acros Organics	AC117665000
Doxorubicin hydrochloride	Fisher BioReagents	BP251610
L-ascorbic acid	Acros Organics	A61 100
Legato 100 Syringe Pump	KD Scientific	14 831 212
mPEG thiol	Laysan Bio	NC0702454
Nonfat dry milk	Andwin Scientific	NC9022655
Potassium carbonate	Acros Organics	AC424081000
Phosphate saline buffer	Fisher BioReagents	BP3991
(Poly(caprolactone)	Sigma Aldrich	440744-250G
(Poly(caprolactone) triol	Acros Organics	AC190730250
Poly (lactic-co-glycolic acid) diacrylate	CMTec	280050
Potassium carbonate	Acros Organics	AC424081000
Recombinant HIV1 gp120 + gp41 protein	Abcam	ab49054
Silver nitrate	Acros Organics	S181 25
Sodium borohydride	Fisher Chemical	S678 10
Tetrachloroauric acid	Fisher Chemical	G54 1
Trehalose	Acros Organics	NC9022655
Triethyl amine	Acros Organics	AC157910010