Inmunohistoquímica de montaje completo en embriones y larvas de pez cebra

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para la detección de proteínas mediadas por anticuerpos fluorescentes en preparaciones enteras de embriones y larvas de peces cebra.

Resumen

La inmunohistoquímica es una técnica ampliamente utilizada para explorar la expresión y localización de proteínas durante los estados normales de desarrollo y enfermedad. Aunque muchos protocolos de inmunohistoquímica se han optimizado para secciones de tejido y tejido de mamíferos, estos protocolos a menudo requieren modificación y optimización para organismos modelo no mamíferos. El pez cebra se utiliza cada vez más como sistema modelo en la investigación básica, biomédica y traslacional para investigar los mecanismos biológicos moleculares, genéticos y celulares de los procesos de desarrollo. Zebrafish ofrece muchas ventajas como sistema modelo, pero también requieren técnicas modificadas para una detección óptima de proteínas. Aquí, proporcionamos nuestro protocolo para la inmunohistoquímica de fluorescencia de montaje completo en embriones y larvas de peces cebra. Este protocolo también describe varias estrategias de montaje diferentes que se pueden emplear y una visión general de las ventajas y desventajas que proporciona cada estrategia. También describimos modificaciones a este protocolo para permitir la detección de sustratos cromogénicos en el tejido de montaje completo y la detección de fluorescencia en el tejido larvario seccionado. Este protocolo es ampliamente aplicable al estudio de muchas etapas de desarrollo y estructuras embrionarias.

Introducción

El pez cebra (Danio rerio) ha surgido como un modelo poderoso para el estudio de los procesos biológicos por varias razones, incluyendo el corto tiempo de generación, el desarrollo rápido, y la amenabilidad a las técnicas genéticas. Como resultado, el pez cebra se utiliza comúnmente en pantallas de moléculas pequeñas de alto rendimiento para la investigación toxicológica y el descubrimiento de fármacos. El pez cebra también es un modelo atractivo para el estudio de los procesos de desarrollo, ya que una sola hembra puede producir rutinariamente 50-300 huevos a la vez y los embriones ópticamente claros se desarrollan externamente permitiendo una visualización eficiente de los procesos de desarrollo. Sin embargo, las primeras investigaciones se basaron principalmente en pantallas genéticas delanteras utilizando N-etil-N-nitrosourea (ENU) u otros mutágenos debido a los desafíos en el establecimiento de técnicas genéticas inversas. Hace aproximadamente dos décadas, los morfosolinos se utilizaron por primera vez en peces cebra para derribar genes dirigidos^1. Los morpholinos son pequeños oligonucleótidos antisentido que inhiben la traducción del ARNm objetivo después de la microinyección en un embrión en una etapa temprana del desarrollo. Una debilidad importante de los morfolinos es que se diluyen a medida que las células se dividen y generalmente pierden eficacia en 72 horas después de la fertilización (hpf). Si bien los morfolinos siguen siendo una poderosa herramienta para la alteración del gen del pez cebra, las nucleasas de efectos similares a los activadores de transcripción (TALEN), las nucleasas de zinc-dedo (ZFN) y las repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) interespaciadas regularmente agrupadas se utilizan más recientemente para apuntar directamente al genoma del pez cebra^2,3. Estas estrategias genéticas inversas, en combinación con la genética delantera y las pantallas de alto rendimiento, han establecido el pez cebra como un modelo poderoso para estudiar la expresión y la función génicas.

La capacidad de estudiar la función génica generalmente requiere una evaluación de la distribución espacio-temporal de la expresión de genes o genes. Las dos técnicas más utilizadas para visualizar estos patrones de expresión durante el desarrollo temprano son la hibridación in situ (ISH) y la inmunohistoquímica de montaje completo (IHC). La hibridación in situ se desarrolló por primera vez en 1969 y se basa en el uso de sondas de ARN antisentido etiquetadas para detectar la expresión de ARNm en un organismo^4. Por el contrario, los anticuerpos etiquetados se utilizan en la inmunohistoquímica para visualizar la expresión de proteínas. La idea de etiquetar proteínas para la detección se remonta a los⁵ de 1930 y el primer experimento del IHC se publicó en 1941 cuando se utilizaron anticuerpos etiquetados con FITC para detectar bacterias patógenas en los tejidos infectados^6. ISH e IHC han evolucionado y mejorado significativamente en las décadas siguientes y ahora se utilizan rutinariamente en el laboratorio de investigación molecular y diagnóstica^7,8,9,10,11. Si bien ambas técnicas tienen ventajas y desventajas, IHC ofrece varios beneficios sobre ISH. Prácticamente, IHC consume mucho menos tiempo que la ISH y generalmente es menos costoso dependiendo del costo del anticuerpo primario. Además, la expresión de ARNm no siempre es una métrica fiable de la expresión de proteínas, ya que se ha demostrado en ratones y humanos que sólo alrededor de un tercio de la variación de la abundancia de proteínas puede explicarse por la abundancia de ARNm^12. Por esta razón, IHC es un suplemento importante para confirmar los datos de ISH, cuando sea posible. Por último, IHC puede proporcionar datos subcelulares y de colocalización que no pueden ser determinados por ISH^13,14,15. Aquí, describimos un método paso a paso para detectar de forma fiable las proteínas mediante inmunohistoquímica en embriones y larvas de pez cebra de montaje completo. El objetivo de esta técnica es determinar la expresión espacial y temporal de una proteína de interés en todo el embrión. Esta tecnología utiliza anticuerpos primarios específicos para antígenos y anticuerpos secundarios etiquetados fluorescentemente. El protocolo es fácilmente adaptable para su uso en secciones de tejido deslizante y para su uso con sustratos cromogénicos en lugar de fluorescencia. Usando este protocolo, demostramos que el desarrollo de músculo esquelético de pez cebra expresa receptores de glutamato ionotrópico, además de receptores de acetilcolina. Las subunidades del receptor de glutamato de tipo NMDA son detectables en el músculo longitudinal a 23 hpf.

Protocolo

Los procedimientos para trabajar con adultos y embriones reproductores de peces cebra descritos en este protocolo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal de la Universidad Estatal de Murray.

1. Recogida y fijación de embriones

1. Prepare tanques de desove colocando parejas de sexo mixtas de pez cebra adultos en tanques con una malla o un revestimiento ranurado lleno de agua del sistema durante la noche.
2. En las luces encendidas, cambie el agua del tanque de desove para agua fresca del sistema para eliminar las heces. Utilice un ciclo de luz oscura de 14 h/10 h con luces encendidas a las 9 am.
3. Una vez que se pongan los huevos, devuelva a los adultos a los tanques domésticos.
4. Recoger los huevos mediante la elaboración de ellos utilizando un pipeta de transferencia o vertiéndolos en un colador de malla.
5. Transfiera los huevos a platos de Petri llenos de medio cuerpo con medio embrionario (como un 30% de danieau o un medio embrionario E2 con 0,5 mg/L de azul de metileno), limitando el número de embriones por plato a 50.
6. Retire los huevos que estén muertos o que no se dividan.
   NOTA: Los embriones muertos se pueden identificar fácilmente a medida que se vuelven opacos y a menudo aparecen "nublados". Si el azul de metileno se añade al medio embrionario, los embriones muertos tienen una apariencia azul oscuro.
7. Incubar platos de huevos a 28,5oC hasta que lleguen a la etapa deseada. Para este experimento, elevar los embriones hasta 23 hpf.
8. Opcional) Transfiera los embriones a 24 hpf a 200 m 1-fenil 2-tiourea (PTU) en medio embrionario para prevenir la melanogénesis^16,17. Alternativamente, blanquear los embriones después de la fijación (ver sección 5 opcional).
9. Cambiar el medio embrionario o el medio de PTU diariamente.
10. Dechorionar embriones desenombreced usando fórceps de punta ultrafina bajo un estereomicroscopio. Alternativamente, los embriones descolasten químicamente incubando en 1 mg/ml de pronasa en medio embrionario durante varios minutos a temperatura ambiente. Retire los embriones de Pronase y lávelos tres veces con medio embrionario.
11. Los embriones desconredados se adhieren al plástico. Mantenerlos en platos Petri de vidrio o plástico recubiertos con 1-2% de agarosa disuelta en medio embrionario. Mueva embriones desconredados usando pipeteos Pasteur pulidos con fuego para minimizar el daño.
12. Transfiera los embriones a tubos centrífugos de 1,5 ml utilizando un pipeta de plástico o pulida por fuego.
13. Retire el medio embrionario con un micropités. Deje sólo suficiente líquido para cubrir los embriones después de cada cambio de líquido.
14. Preparar 4% paraformaldehyde (PFA) en 1 x solución salina con fosfato (PBS) en una campana de humo químico.
    ADVERTENCIA: PFA es un material peligroso. Use guantes y deseche líquidos y sólidos contaminados en áreas designadas.
15. Fijar los embriones en 4% PFA para 1-2 h con balanceo suave a temperatura ambiente. Alternativamente, fijar los embriones 4 h para pasar la noche a 4 oC.
16. Lavar tres veces en 1PBS + 1% Triton-X (PBTriton) durante 5 min.
17. Utilizar los embriones inmediatamente o almacenar a 4 oC durante un máximo de 1 semana.
18. Para el almacenamiento a largo plazo, deshidratar los embriones en 100% metanol (MeOH) 2 h o durante la noche a -20 oC. Almacene los embriones a -20 oC en MeOH durante varios meses.
    ADVERTENCIA: MeOH es un material peligroso. Use guantes y deseche líquidos y sólidos contaminados en áreas designadas.

2. Preparación de embriones

1. Rehidratar los embriones a través de incubaciones en serie a temperatura ambiente.
   1. Incubar en 75% MeOH/25% 1x PBS durante 5 min, balanceándose.
   2. Incubar en 50% MeOH/50% 1x PBS durante 5 min, balanceándose.
   3. Incubar en 25% MeOH/75% 1x PBS durante 5 min, balanceándose.
   4. Incubar en 100% PBTriton durante 5 min, meciéndose.
2. (Opcional) Preparar una solución de trabajo fresca de proteína K (10 g/ml en PBTriton) en hielo añadiendo 10 ml de caldo de proteína K recién desaliñado (10 mg/ml).
   1. Permeabilizar los embriones digiriendo hasta 30 min en Proteinase K.
      NOTA: El tiempo sugerido es <24 hpf: sin digestión; 24 hpf: 15 min de digestión; y 7 días de edad: 30 min de digestión.
   2. Enjuague los embriones permeabilizados en PBTriton y vuelva a fijarlos en 4% de PFA durante 20 min a temperatura ambiente.
   3. Lave los embriones tres veces en PBTriton durante 5 minutos a temperatura ambiente con un suave balanceo.

3. Incubación de anticuerpos primarios

1. Seleccione una solución de bloqueo comercial o suero que coincida con las especies de host de anticuerpos secundarios (por ejemplo, 10% de suero de cabra en PBTriton) con o sin 2 mg/ml de albúmina de suero bovino (BSA).
2. Bloquear los embriones en solución de bloqueo durante 1-3 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 oC mientras se balancea.
3. Incubar en anticuerpos primarios diluidos en solución de bloqueo o 1% de suero en PBTriton durante la noche a 4oC mientras se balancea. En este experimento, los anticuerpos primarios utilizados fueron anti-NMDAR1, receptor anti-pan-AMPA, y anti-fosfo-histona H3, cada uno diluido a una concentración final de 1:500 en 1% suero de cabra en PBTriton.
4. Lavar cinco veces en PBTriton durante 10 minutos a temperatura ambiente mientras se balancea.

4. Incubación secundaria de anticuerpos

1. Seleccione un anticuerpo secundario basado en las especies anfitrionas del anticuerpo primario y la longitud de onda deseada.
2. Incubar en anticuerpos secundarios diluidos en solución de bloqueo o 1% de suero durante 2 h a temperatura ambiente (o durante la noche a 4oC) durante el balanceo.
   NOTA: Los anticuerpos secundarios fluorescentes son sensibles a la luz. Usamos 1:500 cabra-anti-ratón Alexa488 diluido en 1% suero de cabra en PBTriton.
3. Cubra los tubos con papel de aluminio o cubra con una caja de bloqueo de luz para este y todos los pasos subsiguientes.
4. Lavar tres veces en PBTriton durante 10 minutos a temperatura ambiente mientras se balancea.
5. Transfiera los embriones a una solución de glicerol al 50% en PBS sobre un lecho de agarosa del 2% en medio embrionario y proceda a la documentación o proceda a los pasos de procesamiento posteriores a continuación.

Pasos opcionales

5. Blanqueamiento

1. Preparar la solución de lejía en un tubo de 1,5 ml añadiendo 810,7 l de ddH₂O, 89,3 ml de 2 M KOH y 100 ml de 30% H₂O₂.
2. Invierta el tubo tres veces para mezclar.
3. Pipetear 1 ml de dirección de la solución de lejía a los embriones.
4. Abra la tapa del tubo embrionario para permitir que el gas escape. Toque suavemente el tubo en el banco para desalojar las burbujas.
5. Supervise el proceso de blanqueo (utilice un microscopio si es necesario) y detenga la reacción cuando el pigmento se extraiga lo suficiente (aproximadamente 5 min para 24 hpf o 10 min para 72 hpf).
6. Retire cuidadosamente la solución de blanqueo con un micropipeta y enjuague los embriones tres veces en 1 ml de PBTriton.
   NOTA: Los embriones son pegajosos en este paso.
7. Continúe con la documentación o los pasos de procesamiento adicionales a continuación.

6. Disección de embriones y desyolking

1. Para eliminar la yema, transfiera una pequeña cantidad (200 ol o suficiente para cubrir completamente el embrión, pero lo suficientemente restrictivo como para limitar dónde puede flotar) de 1x PBS a una diapositiva de depresión o un portaobjetos de vidrio liso.
2. Utilice un pipeta de transferencia de plástico para mover 1 o más embriones a la gota de PBS.
3. Utilice fórceps ultrafinos y 00 pines de insectos para romper la yema y raspar muy suavemente gránulos de yema de la superficie ventral del embrión (véase también Cheng et al., 2014)¹⁸.
4. Retire los gránulos de yema y reponga PBS según sea necesario.
5. Repita hasta que el embrión esté lo suficientemente libre de yema.

7. Montaje plano en diapositivas

1. Transfiera embriones deyolked a un portaobjetos de vidrio cargado con una pipeta de plástico o una micropipeta de 1 ml con una punta recortada (para reducir el estrés de cizallamiento). Orientar como desee con una punta de micropipeta de 200 l o un pasador de insecto.
2. Elimina el exceso de PBS con una toallita Kim o una toalla de papel.
3. Agregue 2-3 gotas de soporte de montaje a la corredera y al cubreobjetos.
4. Secar al aire durante aproximadamente 5 a 10 min.
5. Selle el cristal de la cubierta sobre el portaobjetos con esmalte de uñas transparente.
   NOTA: Los bordes del vidrio de la cubierta deben estar completamente cubiertos con una capa fina y continua de esmalte de uñas.
6. Dejar secar aproximadamente 10 minutos antes de la toma de imágenes.

8. Montaje en Agarose

1. Preparar el 1% de agarosa en medio embrionario añadiendo 0,5 g de agarosa a 50 ml de medio embrionario en un matraz o vaso de precipitados aptos para microondas de al menos 3 veces mayor volumen del deseado.
2. Calienta en un microondas, girando cada 30 s, hasta que la agarosa se disuelva por completo.
3. Hacer 1 ml de alícuotas en tubos centrífugos de 1,5 ml. Almacene las alícuotas a temperatura ambiente.
4. Cubra las tapas del tubo con cerraduras de tapa antes de calentar.
5. Coloque los tubos de agarosa en un soporte de tubo flotante en un vaso de precipitados medio lleno de agua.
6. Microonda el vaso de precipitados con tubos flotantes durante 2-3 minutos, o hasta que la agarosa esté completamente derretida.
7. Transfiera un embrión a la corredera puenteada con una pipeta de plástico o una micropipeta de 200 ml con una punta recortada (para reducir el estrés de cizallamiento).
8. Coloque el embrión en un cubreobjetos rectangular utilizando alfileres de insectos y agregue aproximadamente 20 ml de agarosa derretida directamente al embrión.
9. Oriente rápidamente la región de interés más cercana al cubreobjetos usando 00 alfileres de insectos.
   NOTA: Este es un soporte al revés.
10. Vuelva a colocar el tubo de agarosa en el flotador del tubo de agua caliente entre cada uso y el microondas según sea necesario.
11. Imagen utilizando un microscopio cuando la agarosa se endurece. Mantenga el embrión montado boca abajo para usarlo en un microscopio invertido. Voltear el cubreobjetos (para que la agarosa esté debajo del cubreobjetos) para su uso en microscopios verticales.

9. Montaje en diapositivas puenteadas

1. Para hacer diapositivas puenteadas, pegue las cubiertas cuadradas a la diapositiva de vidrio usando un pequeño punto de superpegamento.
   NOTA: Debe haber una vaguada de al menos 5 mm de ancho entre los labios de las cubiertas. Dos #1 de cubiertas altas es típicamente apropiado para embriones de 24-48 hpf, mientras que tres cubresítos altos pueden ser necesarios para 72 hpf.
2. Transfiera 1-2 embriones deyolked a la corredera puenteada con una pipeta de plástico o una micropipeta de 200 l con una punta recortada (para reducir el estrés de cizallamiento).
3. Elimina el exceso de líquido con una toallita Kim o una toalla de papel.
4. Añadir una gota de glicerol del 80% directamente al embrión.
5. Cubierta con una cubierta rectangular. La gota de glicerol debe tocar el cristal de la cubierta.
6. Añadir más glicerol al espacio entre el cristal de la cubierta y deslizarse según sea necesario para cubrir completamente el embrión con un margen de glicerol en los lados del embrión.
7. Deslice suavemente el vidrio de la cubierta rectangular para enrollar el embrión en su posición para la toma de imágenes.

10. Tinción DAB

NOTA: Esta sección comienza después del paso 4.2 anterior y reemplaza el resto del paso 4.

1. Incubar los embriones en una solución de bloqueo con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa durante 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4oC mientras se balancea.
2. Lavar tres veces en PBTriton durante 10 min a temperatura ambiente.
3. Transfiera los embriones a una placa de cultivo o diapositiva de depresión con una pipeta de transferencia.
4. Mezclar 50 éL de 1% DAB (3,3'-diaminobenzidina) disuelto en ddH₂O y 50 oL de 0,3% de peróxido de hidrógeno y llevar a 1 ml con PBS.
   ADVERTENCIA: DAB es un material peligroso. Use guantes y deseche líquidos y sólidos contaminados por DAB en áreas designadas.
5. Cubra los embriones teñidos con HRP con la solución DAB preparada anteriormente y monitoree para el desarrollo del color (normalmente 1-5 min) bajo un microscopio.
6. Después de alcanzar el nivel deseado de desarrollo de color, enjuague los embriones brevemente en PBS.
7. Transfiera los embriones a un tubo de 1,5 ml antes de la fijación.
8. Vuelva a fijar los embriones durante 15-20 min en 4% de PFA a temperatura ambiente.
9. Lave los embriones tres veces en PBTriton durante 5 min.
10. Proceda a la documentación.

11. Protocolo modificado para la tinción de tejido seccionado que se monta en diapositivas

1. Rodear el tejido para ser manchado con una pluma de papá.
2. Transfiera los portaobjetos a una cámara húmeda.
3. Agregue 1 ml de PBS directamente a la diapositiva.
4. Incubar 7 min a temperatura ambiente para eliminar el medio de incrustación.
5. Vierta PBS invirtiendo la diapositiva.
6. Rehidratar 1 min en hasta 1 mL de tampón TNT (100 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% Tween20).
7. Bloquear en hasta 1 ml de solución de bloqueo (comercial o 10% de suero + 2% de BSA) durante 1 h a temperatura ambiente.
8. Incubar durante la noche en anticuerpos primarios diluidos en suero del 1% o solución de bloqueo a 4oC.
9. Lavar cinco veces en hasta 1 ml de tampón TNT a temperatura ambiente.
10. Incubar en anticuerpos secundarios durante 2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4oC. Cubra la cámara con papel de aluminio o utilice una tapa oscura.
11. Lavar cinco veces en TNT a temperatura ambiente. Vierte el último lavado.
12. Montar con 2-3 gotas de medio de montaje y cubreobjetos. Dejar sentarse 5-10 min.
13. Selle el cristal de la cubierta sobre el portaobjetos con esmalte de uñas transparente. Deje secar completamente antes de tomar imágenes.

12. Documentación

1. Registre el procedimiento completo y las desviaciones en un cuaderno de laboratorio.
2. Registre la concentración, el nombre, el número de catálogo, el fabricante y el número de lote del anticuerpo principal.
3. Coloque la muestra montada adecuadamente en la etapa del microscopio. Localice la región de interés.
4. Seleccione un ejemplo relativamente brillante. Ajuste la exposición y la ganancia de la cámara para que la señal sea lo suficientemente brillante sin saturarla.
5. Compare la intensidad de tinción de la misma región de interés utilizando los mismos ajustes de exposición al comparar entre embriones experimentales etiquetados con anticuerpos y embriones de anticuerpos de control (por ejemplo, IgG).

Resultados

La inmunohistoquímica de montaje completo utiliza anticuerpos para detectar el patrón espacial de expresión de proteínas en el animal intacto. El flujo de trabajo básico de la inmunohistoquímica (representado en la Figura 1)consiste en la cría de peces cebra, la cría y preparación de embriones, el bloqueo de antígenos no específicos, el uso de un anticuerpo primario específico del antígeno para apuntar a la proteína de interés, la detección de...

Discusión

La inmunohistoquímica es una herramienta versátil que se puede utilizar para caracterizar la expresión espacio-temporal de prácticamente cualquier proteína de interés en un organismo. La inmunohistoquímica se utiliza en una amplia variedad de tejidos y organismos modelo. Este protocolo ha sido optimizado para su uso en peces cebra. La inmunohistoquímica en diferentes especies puede requerir diferentes técnicas de fijación y manipulación, bloqueando las soluciones dependiendo de las especies y la presencia de p...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Fisher Scientific	BP160-100
Aluminum foil, heavy duty	Kirkland		Any brand may be substituted
Anti-NMDA antibody	Millipore Sigma	MAB363
Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002	Millipore Sigma	05-598
Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4)	Millipore Sigma	MABN832
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP1600-100
Calcium Nitrate [Ca(NO3)2]	Sigma Aldrich	C4955
Centrifuge tubes, 1.5 mL	Axygen	MCT150C
Clear nail polish	Sally Hanson		Any nail polish or hardener may be subsituted
Depression (concavity) slide	Electron Miscroscopy Sciences	71878-01
Diaminobenzidine	Thermo Scientific	1855920
Embryo medium, Danieau, 30%			17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water.
Embryo medium, E2			7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 μM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue
Floating tube holder	Thermo Scientific	59744015
Fluorescence compound microscope	Leica Biosystems	DMi8
Fluorescence stereomicroscope	Leica Biosystems	M165-FC
Glass coverslips 18 mm x 18 mm	Corning	284518
Glass coverslips 22 mm x 60 mm	Thermo Scientific	22-050-222
Glass slides	Fisher Scientific	12-544-4
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-1
Goat anti-mouse IgG Alexa 488	Invitrogen	A11001
HEPES solution	Sigma Aldrich	H0887
Humid chamber with lid	Simport	M920-2
Hydrogen peroxide, 30%	Fisher Scientific	H325-500
Immunedge pap pen	Vector labs	H-4000
Insect pins, size 00	Stoelting	5213323
Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O)	Sigma Aldrich	63138
Mesh strainer	Oneida		Any brand may be substituted
Methanol	Sigma Aldrich	34860
Methylene blue	Sigma Aldrich	M9140
Micro-tube cap lock	Research Products International	145062
Microwave oven	Toastmaster
Mouse IgG	Sigma Aldrich	I8765
Normal goat serum	Millipore Sigma	S02L1ML
Nutating mixer	Fisher Scientific	88-861-044
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	04042-500
Pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-20C
PBTriton			1% TritonX-100 in 1x PBS
Permount mounting medium	Fisher Chemical	SP15-500
Petri dish (glass)	Pyrex	3160100
Petri dish (plastic)	Fisher Scientific	FB0875713
1-phenyl 2-thiourea	Acros Organics	207250250
Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4	Gibco	70011-044
Phosphate buffered saline (PBS), 1x			1x made from 10x stock diluted in dH2O
Potassium Chloride (KCl)	Sigma Aldrich	P9333
Potassium Hydroxide (KOH)	Fisher	P250-500
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)	Sigma Aldrich	P5655
Pronase	Sigma Aldrich	10165921001
Proteinase K	Invitrogen	AM2544
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma Aldrich	S7653
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)	Sigma Aldrich	S7907
Spawning tank with lid and insert	Aquaneering	ZHCT100
SuperBlock PBS	Thermo Scientific	37515
Superfrost + slides	Fisher Scientific	12-550-15
Superglue gel	3M Scotch
TNT			100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O
Transfer pipette	Fisher	13-711-7M
Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH)	Sigma Aldrich	T6399
Tris Base	Fisher Scientific	S374-500
TritonX-100	Sigma Aldrich	T9284
Tween20	Fisher Scientific	BP337-500
Ultrafine forceps	Fisher Scientific	16-100-121
Water, ultrapure/double distilled	Fisher Scientific	W2-20