Combinación de microdisección de captura láser y qPCR microfluídico para analizar perfiles transcripcionales de células únicas: un enfoque de biología de sistemas para la dependencia de opioides

Resumen

Este protocolo explica cómo recoger neuronas individuales, microglia y astrocitos del núcleo central de la amígdala con alta precisión y especificidad anatómica utilizando microdisección de captura láser. Además, explicamos nuestro uso de RT-qPCR microfluídico para medir un subconjunto del transcriptoma de estas células.

Resumen

La heterogeneidad transcripcional profunda en células individuales anatómicamente adyacentes sugiere que la funcionalidad sólida del tejido puede lograrse mediante la diversidad de fenotipos celulares. Experimentos de una sola célula que investigan la dinámica de la red de los sistemas biológicos demuestran respuestas celulares y tisulares a diversas condiciones a una resolución biológicamente significativa. En este documento, explicamos nuestros métodos para recopilar células individuales de ubicaciones anatómicamente específicas y medir con precisión un subconjunto de sus perfiles de expresión génica. Combinamos la microdisección de captura láser (LCM) con reacciones en cadena cuantitativas de la polimerasa de transcripción inversa microfluídica (RT-qPCR). También utilizamos esta plataforma microfluídica RT-qPCR para medir la abundancia microbiana de contenido intestinal.

Introducción

La medición de los perfiles de expresión génica de células individuales ha demostrado una extensa heterogeneidad fenotípica dentro de un tejido. Esta complejidad ha complicado nuestra comprensión de las redes biológicas que gobiernan la función del tejido. Nuestro grupo y otros han explorado este fenómeno en muchos tejidos y condiciones^1,2,3,4,5,6. Estos experimentos no sólo sugieren que la regulación de las redes de expresión génica subyace a tal heterogeneidad, sino también que la resolución de una sola célula revela una complejidad en la función del tejido que la resolución a nivel de tejido no aprecia. De hecho, sólo una pequeña minoría de células puede responder a una condición o desafío específico, pero el impacto de esas células en la fisiología general puede ser sustancial. Además, un enfoque de biología del sistema que aplica métodos multivariantes a conjuntos de datos de alta dimensión de múltiples tipos de células y tejidos puede dilucidar los efectos del tratamiento en todo el sistema.

Combinamos LCM y RT-qPCR microfluídico para obtener dichos conjuntos de datos. Tomamos este enfoque aquí en contraste con la recolección de células individuales a través de la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y el uso de secuenciación de ARN (RNA-seq) para medir su transcriptoma. La ventaja de LCM sobre FACS es que la especificidad anatómica exacta de las células individuales se puede documentar con LCM, relativamente y absolutamente. Además, mientras que el ARN-seq puede medir más características que RT-qPCR, RT-qPCR microfluídico es menos costoso y tiene una mayor sensibilidad y especificidad⁷.

En este experimento representativo, investigamos los efectos de la dependencia de opioides y la abstinencia de opioides con precipitación de naltrexona en la expresión génica neuronal, microglia y astrocito en el núcleo central de la amígdala (CeA) y la abundancia de microflora intestinal⁴. Se analizaron cuatro grupos de tratamiento: 1) Placebo, 2) Morfina, 3) Naltrexona y 4) Retiro (Figura 1). Encontramos que la dependencia de opioides no alteraba sustancialmente la expresión génica, pero que la abstinencia de opioides indució la expresión de genes inflamatorios, Tnf en particular. Los astrocitos eran el tipo de célula más afectado. El microbioma intestinal se vio profundamente afectado por la abstinencia de opioides como lo indica una disminución en la relación Firmicutes a Bacteroides, que es un marcador establecido de disbiosis intestinal^8,9.

Protocolo

Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las recomendaciones del Comité de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Thomas Jefferson y la Facultad de Medicina de la Universidad de Drexel. El protocolo fue aprobado por la Universidad Thomas Jefferson y el Colegio de Medicina de la Universidad de Drexel IACUC.

1. Modelo animal

1. Inserte dos pellets de sulfato de morfina de liberación lenta de 75 mg o dos pellets de placebo por vía subcutánea en ratas macho adultas de Sprague-Dawley.
   1. Use una bata y guantes apropiadamente para una cirugía estéril menor. Afeite el dorsum de rata con pinzas si es necesario.
   2. Aplique pomada de veterinario en los ojos del animal. Anestesiar a la rata con aproximadamente 20 s de inhalación de isoflurano. La anestesia se confirma por la pérdida del conocimiento.
   3. Haga una incisión de línea media en el dorso de rata con tijeras contundentes esterilizadas con perlas y separe la dermis de la pared del cuerpo con una sonda esterilizada con perlas. Inserte los pellets debajo de la dermis con fórceps esterilizados con perlas. Suturar la incisión cerrada con una aguja estéril.
      NOTA: Todo el procedimiento tarda unos 5 minutos por rata. Se utilizan guantes estériles frescos para cada rata.
   4. Coloque la rata en una jaula de aislamiento para la recuperación postquirúrgica. Compruebe si hay latidos cardíacos y ritmo respiratorio regular. Observa a la rata hasta que se recupere la conciencia. Evalúe el dolor postquirúrgico.
   5. Evaluar las ratas 8 h postcirugía y cada 12 h después para la recuperación y la infección. Coloque ratas en una jaula con el resto de la cohorte cuando estén completamente recuperadas de la cirugía, alrededor de 24 horas después de la cirugía.
2. Dar una inyección de naltrexona intraperitoneal (75 mg/kg) a las cohortes G y Retirada después de 6 días de exposición a morfina.
   NOTA: Hubo cuatro cohortes de ratas en este experimento representativo (véase la figura 1).

2. Cosecha de muestras

1. Cosecha el cerebro 6 días después de la inserción del pellet o 24 horas después de la inyección de naltrexona.
   1. Colocar al animal en una cámara de isoflurano durante aproximadamente 30 s o hasta que se produzca la pérdida de conciencia, lo que indica la falta de movimiento y la disminución de la frecuencia respiratoria.
   2. Usa una guillotina afilada para decapitar rápidamente al animal.
   3. Disecciona el cerebro del cráneo del animal.
   4. Usa una maquinilla de afeitar de mano afilada para hacer las siguientes incisiones gruesas en el cerebro eliminado: Primero, corta el cerebelo y desecha. En segundo lugar, separe el tronco encefálico del cerebro con una incisión transversal. En tercer lugar, vaivar el antecefálico y/o tronco encefálico con una incisión sagital de línea media.
   5. Coloque el antecefálico y el tronco encefálico en un molde de incrustación de tejido plástico con 3-4 cm de compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) en la parte inferior del molde. Cubra el resto de la muestra con PTU.
   6. Coloque inmediatamente el molde de incrustación de tejido plástico con la muestra cubierta con PTU en un baño que contenga hielo seco y metanol. No deje que el metanol se derrame en el molde de incrustación de tejido. Mantenga el molde de incrustación con la muestra de cerebro en el baño de metanol-hielo hasta que la recolección de tejido salde terminada (10-15 min como máximo).
   7. Coloque la muestra cerebral en un congelador de -80 oC tan pronto como sea posible.
2. Cosecha las muestras intestinales simultáneamente.
   1. Después de una rápida decapitación, haga una incisión de línea media en el abdomen del animal con un bisturí.
   2. Encuentra el cecum y separa su conexión con los dos puntos ascendentes.
   3. Apriete el contenido de cecal en un tubo cónico de 15 ml.
   4. Colocar inmediatamente el tubo cónico sobre hielo seco y ponerlo en un congelador de -80 oC lo antes posible.
      NOTA: El contenido del intestino delgado también se puede recopilar utilizando los mismos métodos que un control negativo.

3. Cortar

1. Corta el cerebro de la rata hemisectizada usando un criostato.
   1. Retire el molde de incrustación de plástico con el forebrain del congelador de -80 oC y colóquelo en un criostato de -20 oC.
   2. Retire la muestra de cerebro foreincrustado incrustada en OCT del molde de incrustación. Utilice una maquinilla de afeitar para cortar las esquinas del molde de incrustación de plástico verticalmente si es necesario. Monte el antecebra para el corte coronal de rostral a caudal en un mandril de criostato usando OCT.
      NOTA: Los puntos de referencia anatómicos para identificar el CeA incluyen el tracto óptico y la estría terminalis(Figura 2B). El tracto óptico se ramifica desde el quiasmo óptico y rastrea dorsal-lateral como el cerebro se corta rostral a caudal. Cuando el tracto óptico tiene una morfología similar a la que se ve en un atlas bregma cerebro de rata -2,12 mm¹⁰, las rodajas de prueba se pueden ver bajo un microscopio. La morfología del tracto óptico y la estria terminalis se puede comprobar en un atlas cerebral de rata¹⁰ para identificar el bregma y si el CeA rodea los terminales de la estría.
   3. Cortar secciones coronales de 10 m de espesor desde el rostral forebrain hemisected hasta el caudal hasta que se alcancen las secciones que contienen el CeA.
      NOTA: La anchura y la altura de las secciones son de aproximadamente 200 mm.
   4. Recoger secciones de 10 m que contengan el CeA, o la región del cerebro preferida, montando secciones de 10 m en diapositivas de vidrio liso. Coloque inmediatamente los portaobjetos de vidrio sobre una sartén de metal que descansa sobre hielo seco. Coloque las diapositivas con secciones cerebrales en un congelador de -80 oC tan pronto como sea posible.
      NOTA: Se pueden colocar varios sectores en la misma diapositiva. Si utiliza una mancha de tipo de celda diferente para las rodajas en la misma diapositiva, deje unos 100 mm entre las rodajas para que se pueda utilizar una pluma hidrófoba para separar las soluciones de anticuerpos específicas del tipo de celda en la diapositiva. Deje unos 20 mm desde el borde de la diapositiva a cada lado de la rebanada.

4. Tinción de inmunofluorescencia

1. Mancha las secciones del cerebro forebrain para la célula cerebral de elección (por ejemplo, neurona, microglia, astrocito, etc.) utilizando inmunofluorescencia.
   1. Retire uno o más portaobjetos con secciones de 10 m del CeA del congelador de -80 oC.
   2. Fijar los portaobjetos con 75% de etanol para 30 s. Retire el exceso de líquido.
   3. Bloquear las rodajas durante 30 s con un 2% de antígeno sérico bovino (BSA) en 1 solución salina tampón de fosfato (PBS). Lavar 1x con PBS.
   4. Agregue una solución de anticuerpos primarios a la corredera durante 2 min.
      NOTA: La solución de anticuerpos primarios se compone de un anticuerpo primario del 2%, un 1% de RNase Out y un 96% de la misma solución bSA PBS para el paso de bloqueo anterior (paso 4.1.3). El experimento representativo utilizó un anticuerpo anti-NeuN, un anticuerpo anti-Cd11 y un anticuerpo anti-GFAP en las siguientes cantidades: 3 l de inhibidor de ARN primario, 1,88 l y 145,12 l de solución de BSA.
   5. Agregue la solución de anticuerpos secundarios a la diapositiva durante 3 min.
      NOTA: La solución secundaria de anticuerpos se compone de 1 l de etiqueta fluorescente antiratón de cabra de 488 nm (1:500), 2,5 ml de inhibidor de ARN, 1,3 ml de DAPI (1:10.000) y 196,5 ml de 2% de ABS.

5. Serie de deshidratación de etanol y xileno

1. Sumergir los portaobjetos en etanol al 75% durante 30 s. Inmediatamente después, sumerja los portaobjetos en etanol al 95% durante 30 s. Inmediatamente después, sumerja los portaobjetos en etanol al 100% durante 30 s. Inmediatamente después, sumerja los portaobjetos en un segundo recipiente que contenga 100% etanol para 30 s.
2. Después de la serie de deshidratación de etanol, sumerja los portaobjetos en xileno recién vertido durante 1 min. Inmediatamente después, sumerja los portaobjetos en un segundo recipiente de xileno durante 4 min.
3. Retire los portaobjetos del baño de xileno y deje secar al aire en la oscuridad durante 5 min.
4. Coloque los portaobjetos en un desecador durante 5 minutos para secarlos más.

6. Microdisección de captura láser

1. Si está manchado, coloque el portaobjetos en el microscopio y encuentre la región de interés (CeA) utilizando puntos de referencia anatómicos (es decir, el quiasmo óptico y la estria terminalis).
2. Utilice la fluorescencia para identificar el tipo de célula manchada y su núcleo en la región de interés. Elija una celda o varias celdas si realiza muestras agrupadas de una sola celda. Marque las celdas de interés utilizando el software LCM.
3. Coloque la tapa LCM encima de la rebanada en la región de interés.
4. Utilice tomas de prueba de un láser infrarrojo (IR) para ajustar la resistencia, el tamaño y la duración del láser IR de modo que el adhesivo de la tapa LCM se derrita solo sobre el área de la celda única seleccionada. Esto garantiza que no se recopilarán otras celdas que no sean las celdas seleccionadas.
   NOTA: En este experimento representativo, se utilizaron 10 grupos de células del mismo tipo de célula como una sola muestra para limitar la variabilidad de célula a célula en la expresión génica entre muestras con el mismo tratamiento. Sin embargo, este método se puede utilizar para verdaderos experimentos de una sola celda^1,3.
5. Seleccione las celdas individuales que se recopilarán para el análisis utilizando las herramientas de software LCM(Figura 2C). Las células seleccionadas deben estar en el área anatómica del CeA (o la región cerebral de elección) en función del atlas cerebral de rata y el bregma¹⁰. Las células deben estar al menos a 3 m de los núcleos teñidos adyacentes.
6. Dispare el láser IR para recoger las células individuales identificadas.
7. Coloque la tapa en la estación de control de calidad (QC) y visualíse la para asegurarse de que solo se seleccionaron las celdas deseadas. Si otras células se seleccionaron por error, se puede utilizar un láser ultravioleta para destruir las células no deseadas mientras la tapa permanece en la estación DE control de calidad.
8. Tome una foto de la sección de tejido de donde se recogió la célula para documentar su especificidad anatómica. Registre la distancia de la rebanada desde el bregma si procede utilizando un atlas de cerebro de rata como referencia¹⁰.
9. Retire la tapa LCM de la estación QC, conecte el dispositivo de extracción de muestras y pipeta 5,5 l de tampón de lisis a la muestra.
   NOTA: La solución tampón de lisis consta de 0,5 l de potenciador de lisis y 5 l de tampón de resuspensión.
10. Coloque el dispositivo ExtracSure en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml y colóquelo en una placa de cocción a 75 oC durante 15 minutos.
11. Esgire la muestra y el tampón de lisis durante 30 s a baja velocidad (0,01-0,02 x g) y coloque la muestra recogida en un congelador de -80 oC.

7. RT-qPCR microfluídico de una sola célula

1. Preamplificación de ARNm de una sola célula para chip de matriz dinámica 96.96
   1. Combine las imprimaciones del gen qPCR de ARNm hacia adelante y hacia atrás para todos los genes que se están probando en una piscina de imprimación para la preamplificación (concentración de 500 nM cada imprimación). Por ejemplo, 1 l de imprimaciones de 100 m en 80 s más 120 ml de tampón de suspensión de ADN.
      NOTA: Las secuencias de imprimación utilizadas para el experimento representativo se pueden encontrar en O'Sullivan et al.⁴.
   2. En una nueva placa de PCR de 96 x 96, agregue 1 l de VILO de 5x a cada poca.
   3. Retire las muestras de células únicas LCM de las muestras almacenadas a -80 oC, deje descongelar brevemente, centrifugar brevemente a baja velocidad (0,01-0,02 x g)y agregue 5,5 ml de la muestra de una sola célula lysed a la placa PCR. Cada muestra se agrega a su propio pozo.
   4. Colocar la placa PCR con las muestras y VILO en el termociclador y calentar a 65oC durante 1,5 minutos. Gire la placa durante 1 min a 1.300 x g a 4oC y colóquela sobre hielo.
   5. Añadir 0,15 l de mezcla maestra de síntesis de ADNc de 10x, proteína 0,12 éL T4 Gene 32 y 0,73 l de tampón de suspensión de ADN a cada pocal.
   6. Colocar la placa PCR en el termociclador y ejecutar el siguiente protocolo: 25 oC durante 5 min, 50 oC durante 30 min, 55 oC durante 25 min, 60 oC durante 5 min, 70 oC para 10 min, 4 oC hasta el final.
   7. Añadir 7,5 ml de mezcla maestra de taq polimerasa a cada pocto.
   8. Añadir 1,5 l de la piscina de imprimación (ver arriba) a cada pocto.
   9. Colocar la placa PCR en el termociclador y ejecutar el siguiente protocolo de preamplificación: 95 oC durante 10 min, seguido de 22 ciclos de 96 oC durante 5 s, 60 oC durante 4 min.
   10. Añadir 0,6 l de tampón de reacción de exonucleasa I 10x, 1,2 l de exonucleasa I y 4,2 l de tampón de suspensión de ADN a cada pocal.
   11. Coloque la placa PCR en el termociclador y ejecute el siguiente protocolo: 37 oC durante 30 min, 80 oC durante 15 min.
   12. Añadir 54 l de tampón TE a cada poca. Gire la placa pcR a 1.300 x g a 5 min. Almacene a 4 oC si continúa inmediatamente con el siguiente paso. Conservar a -20oC si esperas más de 12 h para el siguiente paso.
2. Prepare la placa de muestra para el chip de matriz dinámica 96.96.
   1. En una nueva placa pcR de 96 pocillos, agregue 0,45 ml de tinte de unión al ADN de 20x y 4,55 ml de mezcla maestra ROX baja a cada pocto.
   2. Añadir 3 l de muestra preamplificada a cada pocto, girar la placa pcR a 1.300 x g,luego poner la placa en hielo.
3. Prepare la placa de ensayo para el chip de matriz dinámica 96.96.
   1. En una nueva placa pcR de 96 pocillos, añada 3,75 ml de reactivo de carga de ensayo GE de 2x y 1,25 ml de tampón de suspensión de ADN a cada pocal.
   2. Añadir 2,5 sL de imprimación qPCR de 10 m a cada pocto correspondiente. Gire la placa PCR a 1.300 x g durante 5 min.
4. Cargue y ejecute el chip de matriz dinámica 96.96.
   1. Prepara el chip con fluido de línea de control.
   2. Coloque el chip en un CONTROLADOR IFC HX y ejecute el script Prime (136X).
   3. Añadir 6 l de la muestra de la placa de muestra de PCR en los pozos de muestra correspondientes en el chip de matriz dinámica 96.96.
   4. Añadir 6 l de la muestra de la placa de ensayo de PCR en los pozos de ensayo correspondientes en el chip de matriz dinámica 96.96.
   5. Utilice agujas para hacer estallar cualquier burbuja de aire en los pozos del chip de matriz dinámica 96.96.
   6. Coloque el chip de matriz dinámica 96.96 en el HX del controlador IFC y ejecute el script Load Mix (136x).
   7. Retire el chip del controlador IFC HX, despegue la etiqueta adhesiva protectora y coloque el chip de matriz dinámica 96.96 en una plataforma microfluídica RT-qPCR. Ejecute el protocolo GE Fast 96 x 96 PCR (30 ciclos).
      NOTA: La calidad del ARN y la validez de los resultados se evalúan mediante múltiples métodos, incluida la validación de ensayos a través de electroforesis de gel, curvas de temperatura de fusión, réplicas de muestras y ensayos, y gráficas de series de dilución estándar. Además, los hallazgos transcripcionales pueden ser validados por métodos independientes en hemisección cerebral incluyendo la mancha occidental y los ensayos de inmunofluorescencia.

8. Medición de la abundancia bacteriana con RT-qPCR microfluídico

1. Extraiga el ADN bacteriano siguiendo las instrucciones del kit de extracción de ADN de heces.
2. Estimar la concentración de ADN bacteriano utilizando qPCR.
3. Agregue el ADN bacteriano extraído a una nueva placa de PCR. Añadir 1 l de ADN bacteriano extraído y 9 l de tampón de suspensión de ADN.
4. Prepare la placa de ensayo para el chip de matriz dinámica 48.48 (consulte los pasos 7.2.1-7.2.2)
5. Prepare la placa de muestra para el chip de matriz dinámica 48.48 (consulte los pasos 7.3.1-7.3.2)
   1. En una nueva placa pcR de 96 pocillos, añada 0,45 ml de tinte de unión al ADN de 20x y 4,55 ml de mezcla maestra ROX baja a 48 pocillos.
   2. Añadir 3 l de la muestra de la placa de PCR que contiene el ADN bacteriano a los 48 pocillos y girar hacia abajo la placa de PCR a 1.300 x g durante 5 min. Almacenar a 4 oC.
6. Cargue y ejecute el chip de matriz dinámica 48.48 (consulte los pasos 7.4.1-7.4.7).

Resultados

La selección de las células individuales se validó tanto visual como molecularmente. Visualmente, la morfología celular fue vista antes de la recolección celular. Las células recogidas fueron vistas en la estación de control de calidad y la mancha de núcleos celulares (DAPI) se superpuso con el marcador de selección de una sola célula fluorescencia. La Figura 2A muestra imágenes representativas de una diapositiva con cerebro de rat...

Discusión

La biología de una sola célula ha demostrado la heterogeneidad de los fenotipos celulares y la robustez de la función tisular. Estos hallazgos han proporcionado información sobre la organización de sistemas biológicos tanto a escala macro como a microescala. Aquí, describimos la combinación de dos métodos, LCM y qPCR microfluídico, para obtener medidas de transcriptoma de una sola célula que proporcionen especificidad anatómica y precisión transcripcional a un costo relativamente bajo(Fi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
20X DNA Binding Dye	Fluidigm	100-7609	NA
2x GE Assay Loading Reagent	Fluidigm	85000802-R	NA
48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression	Fluidigm	BMK-M-48.48	NA
96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression	Fluidigm	BMK-M-96.96	NA
Anti-Cd11β Antibody	Genway Biotech	CCEC48	Microglia Stain
Anti-NeuN Antibody, clone A60	EMD Millipore	MAB377	Neuronal Stain
ArcturusXT Laser Capture Microdissection System	Arcturus	NA	NA
Biomark HD	Fluidigm	NA	RT-qPCR platform
Bovine Serum Antigen	Sigma-Aldrich	B4287
CapSure Macro LCM Caps	ThermoFisher Scientific	LCM0211	NA
CellDirect One-Step qRT-PCR Kit	ThermoFisher Scientific	11753500	Lysis buffer solution components
DAPI	ThermoFisher Scientific	62248	Nucleus Stain
DNA Suspension Buffer	TEKnova	T0221
Exonuclease I	New Englnad BioLabs, Inc.	M0293S	NA
ExtracSure Sample Extraction Device	ThermoFisher Scientific	LCM0208	NA
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	ThermoFisher Scientific	22-037-246	Plain glass slides
GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube	ThermoFisher Scientific	N8010611
GFAP Monoclonal Antibody	ThermoFisher Scientific	A-21294	Astrocyte Stain
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A28175	Seconadry Antibody
IFC Controller	Fluidigm	NA	NA
RNaseOut	ThermoFisher Scientific	10777019
SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox	Bio-Rad	PN 172-5211	Rox master mix
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	ThermoFisher Scientific	11754250	Contains VILO and SuperScript
T4 Gene 32 Protein	New Englnad BioLabs, Inc.	M0300S	NA
TaqMan PreAmp Master Mix	ThermoFisher Scientific	4391128	NA
TE Buffer	TEKnova	T0225	NA