Identificación de inhibidores de la interacción HBx-DDB1 mediante un sistema de ensayo de Luciferase dividido

Resumen

Aquí, presentamos un método para el cribado de agentes virales antihepatitis B que inhiben la interacción HBx-DDB1 utilizando un sistema de ensayo de luciferasa dividida. Este sistema permite una fácil detección de interacciones proteína-proteína y es adecuado para identificar inhibidores de dichas interacciones.

Resumen

Existe una necesidad urgente de nuevos agentes terapéuticos para la infección por el virus de la hepatitis B (VHB). Aunque los nucleos(t)ide análogos disponibles actualmente inhiben poderosamente la replicación viral, no tienen ningún efecto directo sobre la expresión de proteínas virales transcritas a partir de un ADN circular covalentemente cerrado viral (CCCDNA). Como la alta carga de antígenos virales puede desempeñar un papel en esta carcinogénesis crónica y relacionada con el VHB, el objetivo del tratamiento del VHB es erradicar las proteínas virales. La proteína reguladora del VHB X (HBx) se une a la proteína de unión al daño del ADN huésped 1 (DDB1) para degradar el mantenimiento estructural de los cromosomas 5/6 (Smc5/6), lo que resulta en la activación de la transcripción viral de cccDNA. Aquí, utilizando un sistema de ensayo de complementación de luciferasa dividida, presentamos un sistema de cribado compuesto integral para identificar inhibidores de la interacción HBx-DDB1. Nuestro protocolo permite una fácil detección de la dinámica de interacción en tiempo real dentro de las células vivas. Esta técnica puede convertirse en un ensayo clave para descubrir nuevos agentes terapéuticos para el tratamiento de la infección por VHB.

Introducción

La infección por el virus de la hepatitis B (VHB) es un importante problema de salud pública en todo el mundo, con estimaciones anuales de 240 millones de personas infectadas crónicamente con vhVH y 90.000 muertes por complicaciones de la infección, como cirrosis y carcinoma hepatocelular (HCC)¹. Aunque los agentes terapéuticos anti-HBV actuales, análogos de nucleos(t)ide, inhiben suficientemente la transcripción inversa viral, rara vez logran la eliminación de proteínas virales, que es el objetivo clínico a largo plazo. Su pobre efecto sobre la eliminación de proteínas virales se debe a su falta de efecto directo en la transcripción viral de los minicromosomas de ADN circular covalentemente cerrado (cccDNA) episómico en el núcleo de hepatocitos^2.

La transcripción del VHB se activa mediante la proteína X reguladora del VHB (HBx)³. Estudios recientes revelaron que HBx degrada el mantenimiento estructural de los cromosomas 5/6 (Smc5/6), un factor de restricción del host que bloquea la transcripción del VHB de cccDNA, mediante el secuestro de un complejo de ligasa de ubiquitina DDB1-CUL4-ROC1 E3^4,5,6. Por lo tanto, se cree que un paso crucial en la promoción de la transcripción viral de cccDNA es la interacción HBx-DDB1. Los compuestos capaces de inhibir la unión entre HBx y DDB1 pueden bloquear la transcripción viral, y de hecho nitazoxanida fue identificado como un inhibidor de la interacción HBx-DDB1 a través de un sistema de cribado desarrollado en nuestro laboratorio⁷.

Aquí, presentamos nuestro conveniente sistema de cribado utilizado para identificar inhibidores de la interacción HBx-DDB1, que utiliza un ensayo complementario de luciferasa dividida^7,8. Las subunidades de luciferasa divididas se fusionan a HBx y DDB1, y la interacción HBx-DDB1 acerca a formar una enzima funcional que genera una señal luminiscente brillante. Como la interacción entre las subunidades es reversible, este sistema puede detectar proteínas HBx-DDB1 que se disocian rápidamente (Figura 1). Usando este sistema, una gran biblioteca de compuestos se puede examinar fácilmente, lo que puede resultar en el descubrimiento de nuevos compuestos capaces de inhibir eficientemente la interacción HBx-DDB1.

Protocolo

NOTA: En la Figura 1Ase muestra una representación esquemática del ensayo de luciferasa dividida , y el proceso de ensayo se describe en la Figura 1B. La dinámica de interacción se puede medir en tiempo real sin lisis celular.

1. Preparación celular

1. Mantener las células HEK293T cultivadas en el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) complementada con suero bovino fetal 10% v/v (FBS), 1x penicilina/estreptomicina a 37oC en 20% O₂ y 5% CO₂.
2. Semilla 5 x 10⁶ células en un plato de 100 mm con 10 mL de DMEM e incubar a 37oC durante la noche.
3. Transfecto transitorio 1 g de HBx y DDB1 con luciferasas divididas en las células de acuerdo con el siguiente método.
   NOTA: La cantidad del plásmido ADN transctado puede depender del regente de transfección utilizado. La posición óptima de la luciferasa dividida fusionada con la proteína diana debe determinarse de antemano. En este caso, HBx fusionó a LgBit en el Término C de HBx (HBx-LgBit) y DDB1 fusionado a SmBit en el N-terminus de DDB1 (SmBit-DDB1) proporcionó los mejores resultados (es decir, las señales de luciferasa más brillantes). Este proceso se ha informado previamente en detalle⁷.
   1. Diluir 1 g de HBx-LgBit expresando plásmido de ADN y 1 g de Plásmido de ADN(Tabla de Materiales)en el tampón de condensación de ADN(Tabla de Materiales)a un volumen total de 300 l.
   2. Añadir 16 l de solución potenciadora(Tabla de materiales)y mezclar mediante vórtice durante 1 s.
   3. Incubar la muestra a temperatura ambiente durante 3 min.
   4. Añadir 60 l de reactivo de transfección(Tabla de materiales)a la muestra y mezclar mediante vórtice durante 10 s.
   5. Incubar la muestra a temperatura ambiente durante 8 min.
   6. Durante la incubación, aspirar el medio de cultivo del plato (preparado en el paso 1.2), y lavar las células con 5 ml de solución salina con fosfato (PBS). Retire PBS por aspiración y agregue 7 mL de DMEM.
   7. Añadir 3 ml de DMEM al tubo que contiene los complejos de transfección. Mezclar pipeteando y añadir los complejos de transfección a la celda en el plato de 10 cm.
4. Incubar las células a 37oC en una incubadora de menos del 5% de_CO2 durante 10 h.
5. Resembrar las células en una placa blanca de 96 pocillos a 5 x 10⁴ células/bien en 50 oL de medio/bien de acuerdo con el siguiente método.
   1. Retire el medio de cultivo celular gastado y lave las células con 5 ml de PBS.
   2. Retire el PBS por aspiración, agregue 1 mL de 0.25% trypsin-EDTA, e incuba a 37 oC durante 5 min para separar las células.
   3. Añadir 4 mL de DMEM y dispersar el medio mediante pipeteo sobre la superficie de la capa celular varias veces. Transfiera la suspensión celular a un tubo.
   4. Células centrífugas a 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
   5. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet celular en 1 ml de PBS.
   6. Centrifugar la suspensión celular a 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.
   7. Diluir el pellet celular con medio de cultivo celular tamponado(Tabla de Materiales)complementado con 10% FBS a una densidad de semilla de 1.0 x 10⁶ células/ml.
   8. Pipetear 50 l de suspensión celular en cada pocal de una placa de 96 pocillos y devolver las células a la incubadora.
6. Incubar células a 37oC por debajo del 5% de_CO2 durante 10 h.

2. Detección de compuestos

1. Durante la incubación, diluir los compuestos de cribado(Tabla de materiales)y el disolvente (dimetil sulfóxido [DMSO]) a una concentración de 13,5x. Por ejemplo, si el stock es de 10 mM y la concentración de cribado es de 10 m, añada 1 l de solución de stock a 73,1 l de medio de cultivo de celdas tamponadas.
2. Añadir 12,5 éL de sustrato luminiscente(Tabla de Materiales)a cada pocal e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
   NOTA: Como controles negativos, los pozos en ambos extremos de la placa (es decir, las columnas 1 y 12) no deben contener ningún sustrato luminiscente.
3. Mida la luminiscencia basal utilizando un luminómetro(Tabla de materiales).
4. Inmediatamente después de la medición inicial, añadir 5 s l de compuestos y controlar DMSO diluido en el paso 2.1 a cada poca.
   NOTA: La concentración final será de 10 m.
5. Mida los valores de luminiscencia cada 30 min durante 2 h.
   NOTA: La placa debe ser incubada en la oscuridad a temperatura ambiente.
6. Calcule los efectos inhibitorios en comparación con el tratamiento de DMSO de control después de la normalización con las señales basales.
   NOTA: La detección de cada compuesto en duplicado o triplicado puede reducir la variación.

Resultados

Los resultados representativos después del uso de este protocolo se muestran en la Figura 2A,B. La relación señal-fondo fue mayor que 80 y el factor Z⁹ (el índice de calidad estándar de oro para el cribado de alto rendimiento) fue mayor que 0,5, lo que indica que este sistema de ensayo era aceptable para el cribado de alto rendimiento. Con el umbral establecido en >40% de inhibición en comparación con el control...

Discusión

Desarrollamos un método de cribado conveniente utilizando un ensayo de luciferasa dividida para encontrar inhibidores de unión HBx-DDB1. La dinámica de interacción se puede detectar en tiempo real en células vivas sin necesidad de lisis celular. La inhibición de la interacción HBx-DDB1 conduce a la restauración de Smc5/6, lo que resulta en la supresión de la transcripción viral, la expresión de proteínas y la producción de ADNc^ccc7. Este novedoso mecanismo de acción antiviral puede s...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM	Greiner-Bio-One GmbH	655098
DMEM	Sigma Aldrich	D6046
DMSO	Tocris Bioscience	3176
Effectene transfection reagent	Qiagen	301425	Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent
FBS	Nichirei	175012
GloMax 96 microplate luminometer	Promega	E6521
HBx–LgBit expressing DNA plasmid	Our laboratory		Available upon request
HEK293T cells	American Type Culture Collection	CRL-11268
NanoBiT PPI starter systems	Promega	N2015	Includes Nano-Glo Live Cell Reagent
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	11058021	Described as "buffered cell culture medium" in the manuscript
PBS	Takara	T900
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	P0781
Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0	Enzo Life Sciences	BML-2841	Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate·HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine·HCl, micafungin, miconazole, midodrine·HCl, miglitol, milnacipran·HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril·HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin·Na, naftifine·HCl, naratriptan·HCl, natamycin, nebivolol·HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline·HCl, olsalazine·Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline·HCl, paliperidone, palonosetron·HCl, paromomycin sulfate, pazopanib·HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox
SmBit–DDB1 expressing DNA plasmid	Our laboratory		Available upon request
Trypsin-EDTA	Sigma Aldrich	T4049