Producción de partículas pseudotipadas de influenza infecciosa de alto valor con glicoproteínas envolventes de virus H5N1 altamente patógenos y aviares H7N9

Resumen

Este protocolo describe un proceso experimental para producir partículas seudotipos virales infecciosas de alto valor (pp) con glicoproteínas envolventes de dos cepas de gripe A y cómo determinar su infectividad. Este protocolo es altamente adaptable para desarrollar pps de cualquier otro tipo de virus envueltos con diferentes glicoproteínas envolventes.

Resumen

La transmisión directa ocasional del virus de la gripe aviar A altamente patógeno H5N1 (HPAI H5N1) y H7N9 a los seres humanos y su letalidad son graves problemas de salud pública y sugieren la posibilidad de una epidemia. Sin embargo, nuestra comprensión molecular del virus es rudimentaria, y es necesario estudiar las propiedades biológicas de sus proteínas envolventes como dianas terapéuticas y desarrollar estrategias para controlar la infección. Desarrollamos una plataforma sólida de partículas pseudotipo virales (pp) para estudiar el virus de la gripe aviar, incluyendo el análisis funcional de su hemagglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA) envuelve glicoproteínas, las características de reordenación de los HA y NA, receptores, tropismos, anticuerpos neutralizantes, diagnóstico, infectividad, con fines de desarrollo de fármacos y diseño de vacunas. Aquí, describimos un procedimiento experimental para establecer pps con las glicoproteínas envolventes (HA, NA) de dos cepas de gripe A (HAPI H5N1 y 2013 aviar H7N9). Su generación se basa en la capacidad de algunos virus, como el virus de la leucemia murina (MLV), para incorporar glicoproteínas de envoltura en un pp. Además, también detallamos cómo estos pps se cuantifican con RT-qPCR, y la detección de infectividad de pps de virus nativos y no coincidentes dependiendo del origen de los HA y NA. Este sistema es altamente flexible y adaptable y se puede utilizar para establecer pps virales con glicoproteínas envolventes que se pueden incorporar en cualquier otro tipo de virus envuelto. Por lo tanto, esta plataforma de partículas virales se puede utilizar para estudiar virus salvajes en muchas investigaciones de investigación.

Introducción

La misión de una partícula viral es transportar su genoma desde una célula huésped infectada a una célula huésped no infectada y entregarlo en el citoplasma o el núcleo en un^formulario1 competente para la replicación. Este proceso se desencadena inicialmente por la unión a los receptores celulares del huésped, seguido por la fusión de virión y membranas celulares. Para los virus envueltos, como los virus de la gripe, las glicoproteínas de pico son responsables de la unión de receptores y la fusión^1,2. Las glicoproteínas de sobrevirales (p. ej., pirógenos, antígenos), están implicadas en muchas propiedades y eventos importantes, como el inicio del ciclo de vida del virus (unión y fusión), la patogénesis viral, la inmunogenicidad, la apoptosis de células huésped y el tropismo celular, la vía endocytica celular, así como la transmisión y reordenación entre especies^1,3,4,5,6,7. La investigación sobre las glicoproteínas de sobres virales nos ayudará a comprender muchos aspectos del proceso de infección viral. Las partículas virales pseudotipo (pp), también denominadas pseudoviriones o pseudopartículas, se pueden generar a través de una técnica de pseudotipado^8,9,10. Esta tecnología se ha utilizado para desarrollar partículas pseudotipo de muchos virus, incluyendo hepatitis C^11,12,hepatitis B^13,virus de la estomatitis vesicular (VSV)^14,15, y virus de la gripe^16,17,18,19. Esta tecnología se basa en la proteína Gag-Pol de lentivirus u otros retrovirus.

Las partículas virales pseudotipo se pueden obtener utilizando un sistema de tres plásmidos mediante la cotransfección de un plásmido de expresión de glicoproteína enenvolvente viral, un plásmido de envase saqueviral que falta el gen envolvente env, y un plásmido reportero separado en células productoras de pp. El retrovirus se ensambla por su proteína Gag, y brota de una membrana celular infectada que expresa la proteína envolvente del virus^1. Por lo tanto, es posible obtener pps de gripe de alto titer utilizando la proteína gag retrovirus para producir cogollos en una membrana celular que expresa la gripe HA y NA. En nuestros estudios anteriores, los HAs/NAs en todas las combinaciones eran funcionales y capaces de realizar sus correspondientes funciones en el ciclo de vida viral^{16,17,18,20,21}. Estos pps se utilizan para investigar las características biológicas de la gripe, incluyendo la hemaglutinación, la actividad de la neuraminidasa, el tropismo de unión a los receptores HA e infectividad. Debido a que HA y NA son proteínas funcionales superficiales importantes en el ciclo de vida viral, los HA y NA no coincidentes derivados de diferentes cepas de gripe pueden demostrar en parte un reordenamiento entre ellos. Aquí, generamos ocho tipos de pps de gripe combinando dos ABA y dos NA (derivadas de la cepa HPAI H5N1 y la mancha H7N9), utilizando un sistema de pseudotipado de tres plásmidos. Estos ocho tipos de pps incluyen dos pps nativos, H5N1pp, H7N9pp; dos pps no coincidentes, (H5+N9)pp, (H7+N1)pp; y cuatro pps que sólo albergan una sola glicoproteína (HA o NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. Los estudios sobre el virus de la gripe, como H5N1 y H7N9, están limitados por los requisitos de bioseguridad. Todos los estudios de las cepas del virus de la gripe silvestre deben realizarse en un laboratorio de nivel 3 de bioseguridad (BSL-3). La tecnología de partículas virales pseudotipo se puede utilizar para empaquetar un virión artificial en un ajuste de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2). Por lo tanto, pps representa una herramienta más segura y útil para estudiar los procesos del virus de la gripe dependiendo de sus dos principales glicoproteínas: la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA).

Este protocolo describe la generación de estos pps con una estrategia de cofección de tres plásmdos (generalmente en la Figura 1),cómo cuantificar pps y detección de infectividad. La producción de pp implica tres tipos de plásmidos(Figura 1). El gen gag-pol, que codifica la proteína retrovirus Gag-Pol, fue clonado a partir de un kit de empaquetado de retrovirus e insertado en el plásmido pcDNA 3.1 y nombrado pcDNA-Gag-Pol. El gen mejorado de la proteína fluorescente verde (eGFP), que codifica la proteína fluorescente verde, fue clonado a partir del vector pTRE-EGFP, insertado en el plásmido pcDNA 3.1, y llamado pcDNA-GFP. Durante la clonación, se añadió una secuencia de señal de embalaje (o) a través de una imprimación. Los genes HA y NA fueron clonados en un plásmido pVRC, llamado pVRC-HA y pVRC-NA, respectivamente. El último plásmido codifica la proteína de fusión y puede ser reemplazado por cualquier otra proteína de fusión de interés. Nuestra plataforma de pseudotipado incluye dos plásmidos de expresión de glicoproteína: pVRC-HA y pVRC-NA. Esto puede simplificar la investigación sobre el resurtido entre diferentes cepas de virus en un entorno BSL-2.

Protocolo

1. Día 1: Cultivo celular y sembrado

1. Cultivar células de riñón embrionario humano (HEK) 293T/17 en platos de 60 mm con el medio esencial modificado (DMEM) de Dulbecco complementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS) y 100 U/ml de penicilina-estreptomicina (DMEM Complete Medium, DCM) en una incubadora de 37 oC, 5% dióxido de carbono (CO_2).
   NOTA: Se recomiendan las células de paso bajo HEK 293T/17.
2. Lave cuidadosamente las células con 5 ml de solución salina tamponada de fosfato (PBS) 1x.
   NOTA: El manejo manual de las células HEK 293T/17 debe ser muy suave, ya que se separan fácilmente.
3. Retire PBS y disocia las células con 1 ml de 0,25% de solución de ácido tetraacético de trippsina-etileno diamina (EDTA). Colocar el plato en una incubadora de CO₂ de 37oC, 5% durante no más de 5 min hasta que las células se disocien.
4. Desactive la trippsina añadiendo 5 ml de DCM. Disperse las células en una suspensión de una sola célula pipeteando varias veces.
5. Transfiera las suspensiones celulares a un tubo centrífugo pretallado de 15 ml. Recoger las células por centrifugación a 250 x g durante 5 min a 4 oC.
6. Decantar tanto del sobrenadante como sea posible. Resuspenda el pellet celular con 6 ml de medio DCM y cuente las células. Diluir las células a 1 x 10⁶ células/ml con medio DCM.
7. Sembrar las células en una placa de 6 pozos con 1 ml de suspensión celular por pozo. Toque suavemente la placa para distribuir uniformemente las células. Incubar la placa durante la noche (14-16 h) en una incubadora de CO₂ de 37oC, 5%.

2. Día 2: Cotransfección de cuatro plásmidos mediada por lipofección

1. Compruebe la morfología y la densidad celular bajo un microscopio de luz invertida. Idealmente, las células deben ser aproximadamente 85% confluente en la transfección. Sustituya el medio por 1 ml de medio DMEM sin suero por poca y, a continuación, vuelva a colocar la placa en la incubadora.
   NOTA: El manejo manual de las células HEK 293T/17 debe ser muy suave, ya que se separan fácilmente.
2. Para cada pozo de células cultivadas que se va a transfitar, diluir 8 l del reactivo de transfección a un volumen de 150 ml con medio sérico reducido (tubo 1). Mezclar suavemente e incubar durante 5 min a temperatura ambiente (RT, aproximadamente 20 oC).
   NOTA: Para cada muestra de transfección, prepare dos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, numerados 1 y 2.
3. En el tubo 2, diluir 2,5 g de ADN plásmido en 150 ml de medio sérico reducido.
   NOTA: En el tubo 2, diluya cada ADN plásmido como se muestra en la Tabla 1. Se utilizó un plásmido que codifica el virus de la estomatitis vesicular (VSV) G glicoproteína (plásmido pLP-VSVG) como un control positivo, porque VSV es capaz de infectar una amplia gama de células. Las partículas de control negativas que carecen de glicoproteínas de sobre de la gripe (env pps) se generaron utilizando plásmidos pcDNA-Gag-Pol y pcDNA-GFP.
4. Después de una incubación de 5 minutos, combine el ADN diluido con el reactivo de transfección diluido. Mezclar suavemente e incubar durante otros 15 minutos a RT.
5. Agregue el complejo de lípidos de ADN al pozo correspondiente que contiene las células y el medio libre de suero. Mezcle suavemente meciéndose la placa de ida y vuelta.
6. Después de la incubación durante 4-6 h en una incubadora de 37oC, 5%_co2, retire el medio y reemplácelo por 2 ml de DMEM. Incubar durante otros 36-48 h en una incubadora de CO₂ de 37oC, 5%.
   NOTA: Reemplace por DMEM libre de suero y anticuerpos. En este protocolo, dos HA y dos ABA se pueden utilizar para generar ocho tipos de pps (mostrados en el Cuadro 1).

3. Día 3: Sembración de células susceptibles

1. Para el ensayo de infectividad, semilla cada tipo de células susceptibles a 1 x 10⁴ células por pozo en una placa de 96 pocillos.
   NOTA: Utilice dos tipos de célulaobjetivo para realizar el ensayo de infectividad en este artículo: una línea celular humana derivada del alveolar (células A549) y las células del riñón canino Madin-Darby (MDCK). Las células MDCK son ampliamente utilizadas en la investigación de la gripe y pueden ser un buen control. Este paso es flexible. Cualquier otra línea celular objetivo se puede utilizar de acuerdo con los requisitos de investigación.
2. Incubar la placa durante la noche (14-16 h) en una incubadora de CO₂ de 37oC, 5%.

4. Día 4: Colección de partículas virales pseudotipo, cuantificación y ensayo de infectividad

1. Colección de partículas virales pseudotipo
   1. Compruebe el color del medio. Idealmente, debe ser de color rosa claro o ligeramente naranja. Examine las células con un microscopio biológico fluorescente invertido de menos de 440–460 nm.
   2. A 36-48 h después de la transfección, cosechar el pps pasando a través de un filtro de membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) de 0,45 m para eliminar los desechos celulares.
   3. Divida los pps en alícuotas de pequeño volumen.
   4. Almacene el pps a -80 oC.
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Sin embargo, esto no se recomienda, porque la infectividad de los pps disminuirá bruscamente después de congelar y descongelar.
2. Cuantificación de partículas virales pseudotipo
   1. Transfiera 20 ml de pps purificados a un tubo de microcentrífuga libre de ribonucleasa de 1,5 ml .5 ml.
   2. Añadir 1 l de nucleasa de benzonasa de 0,24 U/ml. Incubar a 37oC durante 1 h para eliminar cualquier contaminación por ADN y ARN.
      NOTA: El ARN objetivo, comúnmente el cytomegalovirus regulado (CMV)-GFP, se empaqueta en el PPs y puede evitar ser degradado por nucleasa de benzonase.
   3. Congele la muestra a -70 oC para inactivar la nucleasa de benzonase.
   4. Añadir 2 l de proteinasa K. Incubar a 50 oC durante 30 min para digerir las proteínas de envolvente y liberar el ARN CMV-GFP. Inactivar la proteinasa K a 100oC durante 3 min.
   5. Cuantifique el pps mediante la transcripción inversa cuantitativa en tiempo real (qRT)-PCR con un kit RT-qPCR de un solo paso de la sonda universal, utilizando la imprimación delantera 5'-AACAAAAGCTGGAGCTCGTTTAA-3', la imprimación inversa 5'-GGGTCTCCTCAGAGTGATTTACGAC-3', y la sonda 5'-FAM-CCCCCAAATGAAAGACCCCCCGAG-TAM-3', en un termociclador PCR en tiempo real. Normalizar el pps para el número de copia de ARN antes de la infectividad.
3. Ensayo de infectividad
   1. Diluir cada tipo de pps en términos de los datos qRT-PCR a 4 x 10⁵ copias/ml (normalización pp).
   2. Añadir Tosil-Fenilalanina Clorometil-Cetona (TPCK)-trippsina a una concentración final de 40 g/ml en pps que albergan H7N9 HA. Incubar a 37oC durante 1 h para formar sus subunidades funcionales HA1 y HA2.
      NOTA: No hay necesidad de tratar los pps que albergan H5 con TPCK-trippsin, porque tienen múltiples residuos de arginina y lisina en el sitio de escisión HA1-HA2. Este sitio de escote multibásico puede ser cleaved por proteasas celulares omnipresentes.
   3. Mezclar pps normalizados con medio DMEM (sin suero) en una relación 1:1 (volumen/volumen).
   4. Lleve la placa que contiene células susceptibles al gabinete de bioseguridad.
   5. Aspirar el sobrenadante y lavar las células una vez con 0,1 ml de PBS precalentado.
   6. Añadir 0,1 ml de mezcla pps-DMEM a un pozo. Triplicar las pruebas de infectividad de cada tipo de pps a una línea celular susceptible (vista general en la Figura 2).
   7. Incubar la placa de 96 pocillos durante 4-6 h en una incubadora de CO₂ de 37oC, 5%.
   8. Aspirar el sobrenadante y reemplazar con 0,1 ml de DCM.
   9. Incubar la placa de 96 pocillos durante otras 24–36 h en una incubadora de 37oC, 5% co_2.

5. Día 5 o 6: Detección de infectividad

1. Lleve la placa de pozo 96 al gabinete de bioseguridad.
2. Aspirar el sobrenadante y lavar las células 1x con 0.2 mL de PBS precalentado.
3. Retire PBS y disocia las células con 0,1 ml de solución de trippsina-EDTA al 0,25%.
4. Colocar el plato en una incubadora de CO₂ de 37oC, 5% durante 3 min hasta que las células se disocien.
   NOTA: Evite incubar durante más de 5 minutos, ya que esto conducirá a la acumulación de células.
5. Desactive la trippsina añadiendo 0,4 ml de DCM.
6. Disperse las células en suspensión de una sola célula pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces.
7. Transfiera las suspensiones celulares a un tubo de microcentrífuga refrigerado de 1,5 ml.
8. Determinar las células positivas del reportero gFP con clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).
   NOTA: Para determinar la proporción de celdas de destino positivas de reportero de GFP, establezca compuertas de citómetro de flujo utilizando las muestras de control (células A549 no tratadas o células MDCK) y, a continuación, cuente las celdas positivas de reportero de GFP de 10.000 celdas por muestra.

Resultados

Dependiendo del procedimiento general descrito anteriormente, hemos generado 10 tipos de pps combinando dos HAs/NAs de grupo o glicoproteína VSV-G o glicoproteínas sin sobre (mostradas en la Tabla 1). Siete de ellos son infecciosos. Los pps que albergan glicoproteína sin sobre o sólo puerto NA no mostraron ninguna infectividad aquí. El procedimiento de producción de influenza pp se ofrece en la Figura 1. Las micrografías electrónicas de transmisión de pps (por ejemp...

Discusión

En este protocolo, describimos un método para producir partículas pseudotipo del virus de la gripe (pp) en un ajuste BSL-2. El reportero plásmido pcDNA-GFP se incorpora en el pps y se puede utilizar para cuantificar pps por FACS en un ensayo de infectividad. Elegimos dos tipos de líneas celulares susceptibles porque son ampliamente utilizadas en la investigación de la gripe. Las células MDCK proporcionarían un buen control a las células humanas inmortalizadas variables utilizadas en estos estudios.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Benzonase Nuclease	Millipore	70664	Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions
Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well)	Corning	3599	Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic Individual alphanumeric codes for well identification
Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells)	Costar	3516	Individual alphanumerical codes for well identification Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma irradiation
Dulbecco's modified essential medium (DMEM)	Gibco	11965092	A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells
Fetal bovine serum	Excell	FND500	fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays
Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)	Beckman coulter	cytoflex
Human alveolar adenocarcinoma A549 cells	ATCC	CRM-CCL-185
Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells	ATCC	CRL-11268	A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines
Inverted fluorescent biological microscope	Olympus	BX51-32P01-FLB3
Inverted light microscope	Olympus	CKX31-12PHP
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen	11668019	Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets.
Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit	NEB	E3006L	Will withstand up to 14,000 RCF RNase-/DNase-free Nonpyrogenic
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells	ATCC	CCL-34
MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL)	Axygen	MCT-150-C	33 mm, gamma sterilized
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF	Millipore	SLHV033RS	an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	11058021	The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria.
penicillin-streptomycin	Gibco	15140122	Maximum RCF is 12,500 xg Temperature range from -80 °C to 120 °C RNase-/DNase-free Sterile
PP Centrifuge Tubes (15 mL)	Corning	430791	a stable and highly reactive serine protease
Proteinase K	Beyotime	ST532	Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic
TC-treated Culture Dish (60mm)	Corning	430166	Trypsin from bovine pancreas TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein
TPCK-trypsin	Sigma	T1426	This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056