Gastrectomía de manga en ratones usando clips quirúrgicos

Resumen

La prevalencia de la diabetes y la obesidad está aumentando continuamente en todo el mundo. Es necesario seguir investigando los mecanismos entre la diabetes, la obesidad y sus morbilidades y coinmordías asociadas. Aquí, presentamos un protocolo para la gastrectomía de manga (SG) en animales como un modelo preclínico sin complicaciones de cirugía bariátrica.

Resumen

El número de personas con sobrepeso y obesidad está aumentando continuamente tanto en las poblaciones adultas como en las adolescentes. Esto coincide con el aumento del fenómeno universal de la diabetes tipo 2 (T2D) y otros problemas metabólicos. La cirugía bariátrica, como la SG, es actualmente uno de los tratamientos a largo plazo más eficaces y comúnmente utilizados para la obesidad y el T2D, pero la asociación entre ellos aún no se explora completamente. Los mecanismos subyacentes a los resultados observados después de la cirugía bariátrica en seres humanos se pueden investigar sobre la base de estudios preclínicos en animales. El SG reduce el peso corporal, los niveles de glucosa y muchos parámetros metabólicos, y es fácil de realizar con una baja incidencia de complicaciones. El objetivo de este trabajo es proporcionar un método simple y un modelo preclínico sin complicaciones de cirugía bariátrica en animales para investigadores.

Introducción

La prevalencia de la obesidad se ha multiplicado casi por tres en todo el mundo desde 1975. En 2016, más de 1.900 millones de adultos mayores de 18 años tenían sobrepeso y más de 650 millones de adultos eran obesos. La prevalencia de T2D en la población adulta también se ha duplicado del 4,7% al 8,5% y el número ha pasado de 108 millones a 422 millones de adultos entre 1980 y 2014 a nivel mundial¹. La mayoría de las cirugías bariátricas resultan en una pérdida de peso significativa, una reducción de la grasa corporal, y la mejora en la tolerancia a la glucosa, resistencia a la insulina y control de la diabetes². Además de la pérdida de peso y la remisión de T2D, la cirugía bariátrica produce además ventajas adicionales para la salud, como el control de la hipertensión y una menor incidencia de ciertos tipos de obesidad relacionada con el desarrollo y la progresión del cáncer^3. La cirugía bariátrica también induce una remisión completa y parcial duradera de T2D, y disminuye el riesgo de enfermedad coronaria mayor (CHD) de diez años y algún grado de riesgo cerebrovascular. Sin embargo, los mecanismos subyacentes no se entienden completamente⁴.

Existen varios procedimientos para la cirugía bariátrica/metabólica. Tanto las cirugías de bypass gastrointestinales como restrictivas proporcionan efectos positivos sobre el metabolismo⁵. De los modelos quirúrgicos bariátricos, SG y bypass gástrico Roux-en-Y modificado tienen mayor éxito y menores tasas de mortalidad y demuestran modelos confiables de cirugía de bypass gastrointestinal y restrictivo en ratones⁶. Aunque la cirugía de bypass gastrointestinal proporciona más pérdida de peso y una mejora significativa de la tolerancia a la glucosa y la esteatosis hepática que el procedimiento restrictivo a largo plazo, el SG todavía produce un buen control del peso corporal y los niveles de glucosa y es fácil de realizar con una baja incidencia de complicaciones⁶. La proporción de SG aumentó de 30% a 54% y la cirugía de bypass gástrico Roux-en-Y disminuyó de 52% a 32% de 2008 a 2014⁷. Actualmente, el SG laparoscópico es el procedimiento bariátrico más comúnmente realizado a nivel nacional dentro de los centros académicos en los Estados Unidos^8. Aunque ha habido muchos informes publicados sobre los procesos fisiopatológicos entre la cirugía bariátrica, la diabetes y la obesidad, necesitamos más experimentos con animales para explorar más mecanismos desconocidos.

Este protocolo tiene como objetivo producir un método animal para investigar los mecanismos subyacentes a los resultados vistos después de la cirugía bariátrica en seres humanos. El estudio traslacional actual puede proporcionar información sobre el mecanismo de obesidad y el tratamiento T2D del SG.

Protocolo

Todos los procedimientos de uso animal fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Nacional Yang-Ming y cumplieron con la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. ^8a edición, 2011". El procedimiento anestésico se realizó de acuerdo con las pautas para el control del dolor, anestesia, cuidado preoperatorio y postoperatorio para los animales experimentales de la Universidad Nacional Yang Ming, ICAUC-016, 2015,^1a edición.

1. Preparación de animales

1. Obtenga 20 ratones macho salvajes de 8 semanas de edad tipo C57BL/6 del Centro Nacional de Animales de Laboratorio (NLAC) que pesen alrededor de 16-18 gramos. Asigne aleatoriamente estos ratones al SG o al grupo de operaciones falsas con 10 ratones cada uno.
2. Comience a los ratones con comida o una dieta alta en grasas (ver Archivo Suplementario)antes de las cirugías bariátricas o falsas⁹. Producir obesidad inducida por la dieta con al menos 2 semanas preoperatorias de la HFD.
3. Aloje a los ratones en el Centro Animal del Laboratorio de la Universidad Nacional Yang-Ming bajo un ciclo claro-oscuro de 12:12 con inicio de luz a las 07:00 A.M. y permita la alimentación gratuita a la comida estándar de roedores y agua.
4. Restringir todos los animales de los alimentos, pero permitir el acceso gratuito al agua en la noche antes de la cirugía.

2. Preparación preoperatoria general

1. Ayune los ratones durante al menos 6 horas antes de la cirugía. Inducir anestesia en una cámara de inducción con 5% de isoflurano y oxígeno (ambos 3-4 L/min).
   1. Compruebe la profundidad de la anestesia asegurándose de que la estimulación de pellizcar (micro-fórceps lisos serrados curvados contundentes) de la pata trasera, la pata delantera y la oreja no evoca ningún reflejo motor. Administrar antibióticos (25 mg/kg de cefazolina) mediante inyecciones subcutáneas antes de la operación.
2. Asigne una zona de trabajo determinada para procedimientos quirúrgicos. Limpie el área quirúrgica y rocíe la mesa quirúrgica con una solución de alcohol al 75% antes de una operación.
3. Coloque el ratón en el cono nasal y mantenga la anestesia con 2% de isoflurano (2 L/min) y oxígeno (4 L/min).
4. Para la gastrectomía de manga y la operación falsa, después de confirmar la profundidad adecuada de la anestesia por estimulación del dedo del dedo del dedo del dedo delfín, aplique el gel para el ojo 0.2% Carbomer en los ojos del ratón para prevenir la sequedad de los ojos.
5. Usa una maquinilla de afeitar eléctrica para afeitar el cabello desde el abdomen hasta el esternón. Retire y limpie el cabello restante con una crema depilatoria. Coloque y fije el ratón sobre la mesa quirúrgica en una posición supina.
6. Desinfectar la pared abdominal del ratón con soluciones de povidona-yodo alternando con 75% de alcohol para 3 aplicaciones.

3. Gastrectomía de manga y procedimientos falsos

1. Laparotomía mediana
   1. Utilice una micro-tijera para hacer una incisión de línea media de 1-1,5 cm de longitud en la parte superior del abdomen.
2. Externalización estomacal e intestinal
   1. Realice el procedimiento SG con la ayuda de un microscopio de disección de aumento o lupa según sea necesario para evitar el sangrado impredecible y el shock hipovolémico.
   2. Utilice dos micro-fuerzas serradas lisas curvadas para mover suavemente el estómago y completamente externalizarlo.
   3. Divida cuidadosamente el ligamento gastrospánico que conecta el estómago izquierdo con el bazo usando una sonda con punta de algodón y electrocauterización según sea necesario, diseccionando así el fondo gástrico del bazo circundante y otros órganos internos.

4. Aislamiento del estómago y clip

NOTA: El SG para ratones se realizó utilizando la nueva técnica de aplicación de clip como se publicó anteriormente¹⁰.

1. Estire el fondo y el píloro del estómago suavemente y lateralmente con fórceps, identifique la línea media(Figura 1 y Figura 2),y aplique cuidadosamente clips quirúrgicos a la mitad del lado medial de la línea media del estómago desde la unión gastroesofágica de forma inferior y el polo inferior superiormente. Sujetar y excluir alrededor del 75-80% del estómago, creando así toda la manga lateral del estómago(Figura 1 y Figura 2).
2. Mueva el intestino a la piel desnuda en el lado y cúbralo con una gasa humedecida de agua caliente y realizar la hidratación intraperitoneal según sea necesario para prevenir la deshidratación y la hipotermia.
3. Resecar el estómago recortado lateralmente, quitar la manga excluida del estómago con microscisores y luego esterilizar el borde cortado del estómago con solución de povidona-yodo.
4. Sobrepasar la línea del clip con una sutura monofilamento no absorbible de 5-0 para garantizar que no haya fugas. Con nudo de los extremos de la sutura y anclaje a los clips en cada extremo.
5. Devuelva el estómago y el intestino a la posición adecuada en la cavidad abdominal y cierre el abdomen con un monofilamento no absorbible de 5-0 a la fascia y a la pared abdominal.
6. Administrar analgésicos con cetoprofeno (2-5 mg/kg) y antibióticos con cefazolina (25 mg/kg) intraperitonealmente después de todo el procedimiento.

5. Procedimiento Sham de SG

1. Realice un procedimiento similar como se describió anteriormente con una laparotomía de línea media, y externalice el intestino y el estómago usando una cobertura de gasa salina húmeda de 37 oC durante 5 minutos.
2. Devuelva el estómago y el intestino a los sitios adecuados de estos órganos internos.
3. Cierre la pared abdominal cuidadosamente como se describió anteriormente con 2 capas de cierre continuo y discontinuo a la fascia y la piel utilizando suturas de monofilamento lentas o no absorbibles. Administrar analgésicos con cetoprofeno (2-5 mg/kg) y antibióticos con cefazolina (25 mg/kg) intraperitonealmente después de todo el procedimiento.

6. Atención postoperatoria general

1. Detenga el isoflurano y continúe con un flujo de aire de la habitación de 3-5 L/min hasta que el ratón esté completamente despierto.
2. Sigue observando al ratón mientras recupera la movilidad y comienza a caminar alrededor de la jaula.
3. Coloque el ratón en una incubadora independiente de 30oC durante 5 días. Asegúrese de que sólo haya un ratón por jaula para evitar que los ratones se lastienten unos a otros.
4. Regrese libremente a un alimento dietético para gel (dieta de gel alto en grasa: 10% de manteca de cerdo, 10% de azúcar líquido, 57% de agua) durante 3 días después de la cirugía y reintroducir la dieta asignada anterior 3 días después de la cirugía.
5. Inyectar por vía subcutánea o intraperitoneal cetoprofeno (2-5 mg/kg) y cefazolina (25 mg/kg) durante 1 día después de la operación.
6. Evalúe el peso corporal del ratón semanalmente durante todo el período de estudio. Proporcionar ketoprofeno (2-5 mg/kg) por inyección intraperitoneal para el control del dolor una vez al día según sea necesario si el animal está en apuros después de la operación.
   NOTA: Aquí, la tasa de supervivencia de SG fue del 90% después del período de aprendizaje.

7. Evaluación de parámetros metabólicos

1. Ratones rápidos durante 6 h, y tomar muestras de sangre basales (0 min). Obtener todas las muestras de sangre de la punta de la vena de la cola de ratones en movimiento libre^11,12.
2. Entregar 1 mg/g de 50% dextrosa por inyección intraperitoneal para la prueba de tolerancia a la glucosa.
3. Mida la glucosa en sangre de las puntas de las venas de la cola de los ratones que se mueven libremente a 0, 5, 15, 30, 60 y 120 minutos después de la administración de glucosa en muestras duplicadas utilizando glucómetros y tiras reactivas.
4. Mantenga toda la muestra de sangre (n a 10 para cada grupo) a temperatura ambiente con coagulación durante 30 minutos.
5. Centrifugar la muestra de sangre a 3.000 x g durante 10 minutos a 4 oC.
6. Transfiera el plasma a tubos separados sin alterar los coágulos sanguíneos y guárdelo a -80 oC.
7. Estudiar las muestras de plasma al final del estudio utilizando ratones comerciales KITS ELISA para hemoglobina A1c (HBA1c), glucosa, colesterol, y los niveles de insulina de acuerdo con las directrices del fabricante.

Resultados

Los resultados de la operación se muestran en la Figura 3 y la Figura 4. La tasa de supervivencia del estudio fue del 90%. Un ratón murió en el grupo falso debido a la debilidad y otro ratón murió en el grupo SG al tercer día después de la operación por razones desconocidas. Los resultados obtenidos en la pérdida de peso (Figura 3A) después de la operación (en la semana 3) en ratones alimentados con HFD fueron bastante si...

Discusión

La mayoría de los estudios prospectivos de cohortes han confirmado que el aumento del índice de masa corporal está relacionado con el aumento de la mortalidad. La obesidad se asocia con un mayor riesgo de diabetes, enfermedades cardiovasculares (ECV) y la muerte en ambos sexos. Los procesos patéticos específicos han establecido un vínculo entre la diabetes, la obesidad y la mortalidad¹⁴. Las revisiones sistemáticas indican los beneficios de la cirugía bariátrica en la reducción de los fa...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% normal saline	China Chemical & Pharmaceutical Co., Ltd.
5-0 monofilament suture	Shineteh Inc. Taiwan		Ethicon
Alm	Shineteh Inc. Taiwan	ST-A072PK	UNIK
Animal Anesthesia	Step Technology	0712VAP11076	Matrx
Barraqer-Troutman forceps	Shineteh Inc. Taiwan	ST-N309(H-4410)	UNIK
cefazolin	Taiwan veteran pharmacy company
Chow diet	Research Diets
Glucose strips and glucometer	BeneCheck	BKM13-1	BeneCheck
HbA1c kit	Level	OKEH00661
Hematology system	Fuji	FUJI DRI-CHEM 4000i	Europe
High Fat diet	Research Diets	1810724	LabDiet
Iris Forceps	Shineteh Inc. Taiwan	ST-1210	UNIK
Iris Scissors	Shineteh Inc. Taiwan	ST-S011	UNIK
Isoflurane	Panion & BF biotech INC	8547	Panion & BF
Ketoprofen	Sigma	22071154	Sigma-Aldrich
Stereo microscope	MicroTech	SZ-5T	MicroTech
Surgical clip (M)	Echicon Inc., Somerville, NJ		Size M, 5mm
Vidisic gel	Dr. Gerhard Mann Chem.-pharm. Fabrik GmbH