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Resumen

Establecimos una forma eficaz de agotar las bacterias intestinales en tres días y, posteriormente, trasplantar la microbiota fecal mediante sonda nasogástrica de líquido fecal preparado a partir de contenido intestinal fresco o congelado en ratones. También presentamos un método optimizado para detectar la frecuencia de bacterias recubiertas de IgA en el intestino.

Resumen

La microbiota intestinal desempeña un papel pleiotrópico en la salud y la enfermedad humanas. El trasplante de microbiota fecal (TMF) es un método eficaz para investigar la función biológica de las bacterias intestinales en su conjunto o a nivel de especie. Se han publicado varios métodos diferentes de TMF. En este artículo, presentamos un protocolo de TMF que agota con éxito la microbiota intestinal en cuestión de días, seguido del trasplante de microbiota fecal a partir de contenido intestinal fresco o congelado de donantes a ratones convencionales. Se aplica PCR en tiempo real para probar la eficacia del agotamiento bacteriano. A continuación, se aplica la secuenciación del ARN ribosómico 16S (ARNr) para comprobar la abundancia relativa y la identidad de la microbiota intestinal en ratones receptores. También presentamos un método de detección basado en citometría de flujo de bacterias recubiertas de inmunoglobulina A (IgA) en el intestino.

Introducción

Una microbiota intestinal diversa desempeña un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis del huésped. Este microbioma ayuda en varios procesos fisiológicos que van desde la digestión y absorción de nutrientes de los alimentos, la defensa contra la infección de patógenos, la regulación del desarrollo del sistema inmunológicoy la homeostasis inmune. La alteración de la composición microbiana intestinal se ha relacionado con muchas enfermedades, como el cáncer2, las enfermedades autoinmunes3, la enfermedad inflamatoria intestinal4, las enfermedades neurológicas5 y las enfermedades metabólicas 6,7. Los ratones libres de gérmenes (GF) son herramientas poderosas en los modelos de trasplante de microbiota fecal para estudiar los efectos biológicos de la microbiota8. Sin embargo, el entorno de alojamiento de los GF es muy estricto y realizar un trasplante de microbiota fecal (TMF) en estos ratones es caro. Además, los ratones GF tienen diferentes propiedades de barrera y mucosas, que regulan la penetración bacteriana, en comparación con los ratones convencionales9. Estos factores limitan la amplia aplicación de ratones GF en los estudios. Una alternativa al uso de ratones GF es agotar la microbiota de los ratones convencionales mediante un cóctel de antibióticos seguido de TMF. Los métodos de TMF reportados anteriormente no están bien descritos y son inconsistentes; por lo tanto, es necesario establecer un protocolo factible, eficiente y reproducible para realizar TMF utilizando ratones convencionales.

Varios pasos son cruciales para el éxito de un FMT. La eficacia del agotamiento de la microbiota es el primer paso importante. Para la depleción de bacterias, se ha reportado el uso de un solo antibiótico de amplio espectro (por ejemplo, estreptomicina10) o un cóctel de antibióticos (tratamiento triple o cuádruple con antibióticos)11,12. El tratamiento cuádruple antibiótico, que incluye ampicilina, metronidazol, neomicina y vancomicina, ha demostrado ser el régimen más eficaz y ha sido utilizado en varios estudios 13,14,15. Además del tipo de antibiótico utilizado, la vía de administración, la dosis y la duración del tratamiento con antibióticos afectan a la eficacia de la depleción bacteriana. Algunos investigadores aplican antibióticos en el agua potable para eliminar las bacterias en el tracto gastrointestinal15. Sin embargo, es difícil controlar la dosis de antibióticos que recibe cada ratón de esta manera. Por lo tanto, en estudios posteriores, los investigadores han tratado a ratones con antibióticos por sonda oral durante 1-2 semanas12 para lograr un agotamiento satisfactorio. Sin embargo, el uso a largo plazo de antibióticos puede ser problemático, ya que los propios antibióticos pueden afectar a algunas enfermedades en modelos de roedores16. Por lo tanto, se justifican métodos más rápidos y eficientes para el agotamiento de la microbiota.

La preparación de líquidos fecales es otro paso clave para garantizar el éxito del TMF. En el tracto gastrointestinal, el pH oscila entre 1 en el estómago y 7 en el intestino proximal y distal9. La microbiota en el estómago es limitada debido a la alta acidez e incluye Helicobacter pylori17. El intestino proximal produce ácidos biliares para la circulación hepático-intestinal y contiene microbiota asociada a la digestión de grasas, proteínas y glucosa. El tracto intestinal distal contiene abundantes bacterias anaerobias y exhibe una alta diversidad microbiana18. Dada la heterogeneidad espacial de la microbiota intestinal, es imperativo aislar el contenido intestinal de diferentes regiones del tracto intestinal para la preparación de líquidos fecales. Además, otros factores, como la naturaleza de la muestra del donante (p. ej., muestra fresca o congelada), la frecuencia y la duración del trasplante son cruciales a la hora de realizar el TMF. Las heces congeladas se utilizan con mayor frecuencia para colonizar ratones convencionales con microbiota intestinal humana19. Por el contrario, el TMF con heces frescas de donantes animales es más apropiado y se utiliza comúnmente en modelos animales20,21. La frecuencia y la duración del TMF varían en función del diseño experimental y de los modelos. En estudios previos, el TMF se realizaba diariamente o cada dos días. La duración del trasplante osciló entre 3 días22 y 5 semanas23. Además de los factores anteriores, mantener un entorno quirúrgico aséptico y el uso de instrumentos quirúrgicos esterilizados es crucial para evitar la contaminación bacteriana ambiental inesperada.

La microbiota intestinal tiene el potencial de regular la acumulación de células que expresan inmunoglobulina A (IgA). La IgA, un isotipo de anticuerpo predominante, es fundamental para proteger al huésped de la infección a través de la neutralización y la exclusión. La IgA de alta afinidad se transcita en la luz intestinal y puede unirse y recubrir los patógenos infractores. Por el contrario, el recubrimiento con IgA puede proporcionar una ventaja de colonización para las bacterias24. A diferencia de la IgA inducida por patógenos, la IgA inducida por comensales indígenas tiene menor afinidad y especificidad25. Se ha reportado que la proporción de bacterias intestinales recubiertas con IgA está significativamente aumentada en algunas enfermedades 25,26. Las bacterias recubiertas de IgA pueden iniciar un ciclo de retroalimentación positiva de la producción de IgA27. Por lo tanto, el nivel relativo de bacterias recubiertas de IgA puede predecir la magnitud de la respuesta inflamatoria en el intestino. De hecho, esta combinación se puede detectar mediante citometría de flujo28. Utilizando la clasificación basada en IgA, Floris et al.27, Palm et al.25 y Andrew et al.29 adquirieron bacterias fecales IgA+ e IgA- de ratones y caracterizaron la microbiota intestinal recubierta específica de taxones mediante secuenciación de ARNr 16S.

En este estudio, describimos un método optimizado para agotar eficientemente las bacterias intestinales dominantes y colonizar ratones convencionales con microbiota fecal fresca o congelada aislada del contenido del íleon y el colon. También demostramos un método basado en citometría de flujo para detectar bacterias que se unen a IgA en el intestino.

Protocolo

Los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las regulaciones éticas vigentes para el cuidado y uso de animales en China.

NOTA: Los animales se alojaron en un ambiente controlado libre de patógenos específicos (SPF) bajo ciclos de luz y oscuridad de 12 horas a 25 °C. La comida fue irradiada antes de ser alimentada a los ratones. El agua potable y las jaulas se esterilizaron en autoclave antes de su uso. En el estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6J de ocho semanas de edad después de 1 semana de aclimatación. Se dividieron en varios grupos en función del diseño del experimento. Cada grupo estaba formado por al menos tres ratones.

1. Agotamiento de la microbiota intestinal

  1. Preparación de cóctel de antibióticos
    1. Prepare una solución antibiótica en solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) con 0,5 mg/ml de clorhidrato de vancomicina, 1 mg/ml de metronidazol, 1 mg/ml de sal sódica de ampicilina y 1 mg/ml de sulfato de neomicina.
      NOTA: Almacene los antibióticos a una temperatura de 2 a 8 °C y evite la luz directa. Prepare la solución de cóctel antibiótico fresca y úsela inmediatamente.
  2. Régimen de tratamiento
    1. Durante 3 días, administre por vía oral 200 μL de cóctel de antibióticos preparado con una aguja #10 a un ratón. Sostenga el mouse verticalmente con una mano mientras usa la otra mano para ajustar el ángulo de la aguja y evitar llegar al estómago.
      NOTA: El ratón debe manipularse con cuidado para evitar forcejear, ya que el daño superficial del esófago y el estómago puede provocar inflamación o la muerte.
    2. Añada antibióticos al agua potable en las mismas concentraciones indicadas en el paso 1.1.1.
    3. Tres días después, sacrifica al ratón por asfixia con CO2 .
    4. Diseccionar el abdomen asépticamente con instrumentos estériles. A una distancia de 2 cm del ciego, corte un tramo de 2 cm del íleon. Usando pinzas estériles para sujetar un extremo del tracto, exprima el contenido fresco del tracto en tubos previamente pesados.
    5. Para recoger el contenido del ciego, córtelo por la mitad con unas tijeras quirúrgicas. Exprima el contenido de cada mitad del ciego en tubos previamente pesados.
  3. Evaluar la eficacia del agotamiento de la microbiota intestinal.
    1. Pesar el contenido intestinal aislado del íleon o ciego de ratones naïve y ratones tratados con cócteles de antibióticos, y extraer el ADN de la microbiota de las heces utilizando un kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Determine la concentración de ADN de acuerdo con la fórmula:

      concentraciónde la muestra (μg/mL) = OD260 x 50
       
    2. Construya una curva estándar.
      1. Amplifique los genes de E. Coli con una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores específicos V3-V4. Predesnaturalización a 95 °C durante 1 min, amplificar durante 40 ciclos de 95 °C durante 10 s, 60 °C durante 30 s, 72 °C durante 30 s.
      2. Construya un plásmido uniendo el producto amplificado a un vector TA. Clone el cultivo con un kit de vectores TA de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      3. Mida la concentración de plásmidos (ng/μL) en función del valor OD260 como se describe en el paso 1.3.1.
        NOTA: La unidad para la concentración de plásmidos es diferente de la unidad para la concentración de ADN.
      4. Calcule el número de copias utilizando la siguiente fórmula, donde MW representa el peso molecular:

        copias en 1 μL = concentración (ng/μL) x 10-9 x 6,02 x 1023/(MW plásmido x 660)
         
      5. Reconstituya el plásmido con agua bidestilada hasta una concentración final de 40 μg/μL. Prepare una serie de dilución en gradiente 10x con ocho etapas. Construya una curva estándar trazando el valor CT (eje Y) contra log (plásmido de copias) (eje X) después de la amplificación por PCR, donde CT representa el ciclo de umbral para la amplificación objetivo. Extrae la ecuación de la gráfica (en este caso, fue y = -3.07x + 45.07, R2 = 0.994).
    3. Amplificar 1 μL de las muestras de ADN obtenidas en el paso 1.3.1 extraídas del íleon o ciego de un grupo control previo y del grupo de tratamiento con cóctel de antibióticos mediante PCR en tiempo real como se describe en el paso 1.3.2.1. Calcule el número de copias en 1 μL de las muestras de ADN basándose en la curva estándar del paso 1.3.2.5 y, a continuación, calcule el número total de copias utilizando la siguiente fórmula:
      Número total de copias (por mg) en las muestras ponderadas = número de copias × volumen total de ADN/peso inicial de la muestra
  4. Analizar el ADN de la microbiota secuenciando las regiones 16S rRNA V3 y V4.

2. Trasplante de microbiota fecal

  1. Preparación de líquido fecal para muestras de heces frescas y congeladas
    NOTA: Todos los instrumentos se empapan en alcohol al 75% antes de su uso para evitar la contaminación bacteriana preexistente. Es crucial evitar la contaminación cuando se recoge el contenido del íleon y el colon.
    1. Sacrificar de 3 a 5 ratones donantes por asfixia con CO2 .
    2. Recoja el contenido del íleon como se describe en el paso 1.2.4.
    3. Para recoger el contenido en el colon, haga la primera incisión cerca del ano y corte el tracto superior de 2 cm. Extraiga el contenido como se explica en el paso 1.2.4. Recoja las muestras en 1 minuto para reducir la exposición al aire.
    4. En el caso de líquido fecal congelado, recoja el contenido del íleon o del colon como se describe en los pasos 2.1.2 y 2.1.3, y congele rápidamente el contenido en nitrógeno líquido.
    5. Almacene las muestras en un congelador a -80 °C hasta que estén listas para su uso.
  2. Agrupe y pese el contenido, agregue tubos estériles frescos con cuentas. En el caso de las muestras congeladas, descongele los gránulos fecales en hielo antes de pesarlos.
  3. Añada PBS estéril en el tubo y vuelva a suspender los gránulos fecales en PBS (1 ml de PBS/0,2 g de gránulos fecales) con una aguja de jeringa de 5 ml. Homogeneizar completamente el pellet fecal con perlas y vórtice 3x durante 1 min cada uno.
  4. Centrifugar a 800 x g durante 3 min, luego filtrar los sobrenadantes pasando a través de un filtro de células de 70 μm. Recoja el líquido fecal filtrado en un tubo estéril y utilícelo para el TMF inmediatamente.

3. Procedimiento de trasplante de microbiota fecal

  1. Administrar 200 μl de líquido fecal preparado a los ratones con depleción de microbiota por vía oral por sonda nasogástrica cada dos días durante 7 días. Ratones de control por sonda nasogástrica con 200 μL de PBS estéril.
  2. Sacrificar los ratones por asfixia con CO2 y recolectar el contenido del íleon y el colon de acuerdo con los pasos 2.1.2 y 2.1.3. Almacene las muestras a -80 °C hasta su posterior procesamiento.
  3. Extraiga el ADN de la microbiota del íleon y del contenido del colon como se describe en el paso 1.3.1. Verificar la composición de la microbiota en el intestino de ratones trasplantados mediante secuenciación de ARNr 16S.

4. Medición de bacterias recubiertas de IgA

  1. Preparación de la muestra
    1. Recoja 50 mg de gránulos fecales de ratones donantes, tal como se describe en los pasos 2.1.2 y 2.1.3, e incube en 1 ml de PBS estéril a 4 °C durante 1 h. Homogeneizar los pellets con un batidor de cuentas durante 5 s.
    2. Centrifugar la solución a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Recoja el sobrenadante después de filtrarlo a través de un colador de 70 μm.
      NOTA: Evite la centrifugación a alta velocidad.
    3. Añadir 5 μL del sobrenadante a 1 mL de albúmina sérica bovina (BSA) al 1% en PBS (tampón FACS). Pellet a 8.000 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
    4. Vuelva a suspender el pellet en 1 mL de tampón FACS, centrifugue a 8.000 x g durante 5 min a 4 °C y deseche el sobrenadante.
      NOTA: Es posible que sea necesario optimizar el volumen utilizado aquí. Una cantidad excesiva del sobrenadante en este paso puede enmascarar la señal positiva de las bacterias recubiertas de IgA.
    5. Vuelva a suspender el pellet en 100 μL de PBS que contenga un 10% de suero de cabra e incube en hielo o a 4 °C durante 30 min. Añadir 1 mL de tampón FACS en el tubo y centrifugar a 8.000 x g durante 5 min a 4 °C hasta pelletizar.
  2. Citometría de flujo
    1. Vuelva a suspender el pellet obtenido en el paso 4.1.5 con 200 μL de tampón FACS que contenga anticuerpo IgA anti-biotina de ratón (1:100) y anticuerpo anti-biotina conjugado con APC (1:100) e incube durante 30 min a 4 °C.
    2. Añadir 1 mL de tampón FACS en el tubo y centrifugar a 8.000 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
    3. Teñir el pellet del paso 4.2.2 añadiendo 200 μL de tampón FACS que contiene tinción de ácido nucleico fluorescente verde (1:200) e incubar a 4 °C durante 5 min.
    4. Añadir 1 mL de tampón FACS y centrifugar a 8.000 x g durante 5 min a 4 °C para pelletizar.
    5. Vuelva a suspender el pellet en 250 μL de tampón FACS antes de la medición.
    6. Adquiera los datos utilizando un citómetro de flujo y analícelos con el software FlowJo.

Resultados

El horario del TMF utilizado en este estudio se describe en la Figura 1. Tras el tratamiento con el cóctel de antibióticos, se analizó la eficacia de la depleción de la microbiota intestinal mediante la secuenciación de la región del ARNr 16S. Detectamos 196 especies en el íleon de ratones naïve, mientras que el tratamiento con antibióticos de 3 días redujo rápidamente las especies bacterianas a 35 (Figura 2A). Se det...

Discusión

Los antibióticos utilizados en el procedimiento de depleción tienen diferentes propiedades antibacterianas. La vancomicina es específica para bacterias grampositivas30. La doxiciclina oral puede inducir cambios significativos en la composición de la microbiota intestinal en ratones hembra C57BL/6NCrl31. La neomicina es un antibiótico de amplio espectro que se dirige a la mayoría de las bacterias residentes en el intestino

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo se llevó a cabo bajo el patrocinio del Proyecto interdisciplinario Sobresaliente del Hospital de China Occidental, la Universidad de Sichuan (Subvención Nr: ZYJC18024) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención: 81770101 y 81973540).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
5 mL syringe needleSheng guang biotech5mL
70 µm cell strainerBD biosciences352350
Ampicillin sodium saltAMERESCO0339
APC StreptavidinBD biosciences554067
Biotin anti-mouse IgA antibodyBiolegend407003
Bovine serum albiumin (BSA)SigmaB2064-50G
C57BL/6J miceChengdu Dashuo
CO2Xiyuan biotech
E.Coil genome DNATsingKe
Eppendorf tubesAxygenMCT150-C
Fast DNA stool mini HandbookQIAGEN51604
MetronidazoleShyuanyeS17079-5g
Neomycin sulfateSIGMAN-1876
Oral gavage needleYuke biotech10#
pClone007 Versatile simple TA vector kitTsingKe007VS
Phosphate Buffer Saline (PBS)HycloneSH30256
Precellys lysing kitPrecellysKT03961-1-001.2
RT PCR SYBR MIXVazymeQ411-01
SYTO BC green Fluorescent Nucleic Acid StainThermo fisher scientificS34855
V338 F primerTsingKeACTCCTACGGGAGGCAGCAG
V806 R primerTsingKeGGACTACHVGGGTWTCTAAT
Vancomycin hydrochlorideSigmaV2002
Equipments
BD FACSCalibur flow cytometerBD biosciences
Bead beater vortxScilogex
BIORAD CFX ConnectBIORAD
Centrifuge machineEppendorf
Illumina MiSeqIllumina
Nanodrop nucleic acid measurements machineThermo fisher scientific
Surgical instrumentsYuke biotech
Software
Adobe Illustrator CC 2015Version 2015
BIORAD CFX qPCR SOFTWARE
FlowJo software
Graphpad prism 7
Database
Silva (SSU132) 16S rRNA database

Referencias

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