Derribo condicional combinado y ensayo de formación de esferas adaptadas para estudiar un gen asociado a la stemness de células madre de cáncer gástrico derivadas del paciente

Resumen

En este protocolo, presentamos un diseño experimental utilizando un sistema de derribo condicional y un ensayo de formación de esferas adaptadas para estudiar el efecto de clusterin en el tallo de los GCSC derivados del paciente. El protocolo se puede adaptar fácilmente para estudiar la función in vitro e in vivo de genes asociados a la stemness en diferentes tipos de CSC.

Resumen

Las células madre cancerosas (CSC) están implicadas en la iniciación, el desarrollo y la recurrencia de tumores después del tratamiento, y se han convertido en el centro de atención de muchos estudios en las últimas décadas. Por lo tanto, es importante desarrollar métodos para investigar el papel de los genes clave involucrados en el tallo de las células cancerosas. El cáncer gástrico (GC) es uno de los tipos de cáncer más comunes y mortales. Se cree que las células madre del cáncer gástrico (GCSC) son la raíz de la recaída del cáncer gástrico, la metástasis y la resistencia a los medicamentos. Comprender la biología de los GCSC es necesario para avanzar en el desarrollo de terapias dirigidas y eventualmente para reducir la mortalidad entre los pacientes. En este protocolo, presentamos un diseño experimental utilizando un sistema de derribo condicional y un ensayo de formación de esferas adaptadas para estudiar el efecto de clusterin en el tallo de los GCSC derivados del paciente. El protocolo se puede adaptar fácilmente para estudiar la función in vitro e in vivo de genes asociados a la stemness en diferentes tipos de CSC.

Introducción

El cáncer gástrico (GC) es uno de los tipos de cáncer más comunes y mortales^1. A pesar de los avances en la cirugía combinada, la quimioterapia y la radioterapia en la terapia de GC, el pronóstico sigue siendo pobre y la tasa de supervivencia de cinco años sigue siendo muy baja^2. La recurrencia y la metástasis son las principales razones por las que las muertes después del tratamiento.

Las células madre cancerosas (CSC) son un subconjunto de células cancerosas que poseen la capacidad de autorre renovarse y generar los diferentes linajes celulares que reconstituyen el tumor^3. Se cree que las CSC son responsables de la recaída del cáncer y la metástasis debido a sus capacidades de auto-renovación y siembra de nuevos tumores, así como su resistencia a las quimios y radioterapias tradicionales⁴. Por lo tanto, la orientación a las CSC y la eliminación de las CSC proporcionan un potencial emocionante para mejorar el tratamiento y reducir la mortalidad de los pacientes con cáncer.

Los CSC se han aislado de muchos tipos de tumores sólidos⁵. En 2009, las células madre de cáncer gástrico (GCSC) aisladas de las líneas celulares de cáncer gástrico humano fueron descritas originalmente por Takaishi et al.⁶. Chen y sus colegas identificaron y purificaron en primer lugar los GCSC a partir de tejidos tumorales de adenocarcinoma gástrico humano (GAC)⁷. Estos hallazgos no sólo proporcionan una oportunidad para estudiar la biología de los GCSC, sino que también proporcionan una gran importancia clínica.

Una característica particular de las CSC es su capacidad para formar una esfera⁸. Las células individuales se chapan en condiciones no adherentes a baja densidad, y solo las células poseídas con la auto-renovación pueden crecer hasta convertirse en un grupo sólido y esférico llamado esfera. Por lo tanto, el ensayo de formación de la esfera ha sido considerado como el ensayo estándar de oro y ampliamente utilizado para evaluar el potencial de auto-renovación de células madre in vitro.

La interferencia de ARN (ARNi) es una poderosa herramienta de investigación para estudiar la función genética mediante el derribo de un gen específico^9. Sin embargo, las tecnologías de derribo de genes estables a largo plazo tienen ciertas limitaciones, como el desafío de explorar la función de un gen que es esencial para la supervivencia celular. Los sistemas de ARNi condicional pueden ser útiles para la regulación descendente de los genes deseados de manera temporal y/o controlada especial por la administración de un agente inductor. Los sistemas inducibles de tetraciclina (Tet) son uno de los sistemas de ARNi condicional más utilizados¹⁰. Los sistemas inducibles Tet pueden inducir el silenciamiento del gen diana controlando la expresión de ARNh tras la adición de un inductor exógeno (preferentemente doxiciclina, Dox). Los sistemas inducibles Tet se pueden dividir en dos tipos: sistemas Tet-On o Tet-Off. La expresión de arnesco se puede activar (Tet-On) o desactivarla (Tet-Off) en presencia del inductor. En el sistema Tet-ON sin un inductor, el represor Tet (TetR) expresa constitutivamente se une a la secuencia del elemento sensible al Tet (TRE) que contiene un promotor dependiente de Pol III sensible a Tet para la expresión de ARNH, reprimiendo así la expresión del arnesón. Mientras que después de la adición de Dox, el TetR es secuestrado lejos del promotor dependiente de Pol III con respuesta tet. Esto facilita la expresión del ARNN y conduce a la reducción genética.

El protocolo descrito aquí emplea un sistema funcional de ARNN inducible de tetraciclina y un ensayo de formación de esferas adaptada para estudiar la función de clusterin en GCSC derivados del paciente. Clusterin ha sido identificado como una nueva molécula clave para mantener el tallo y la supervivencia de los GCSC en un estudio anterior¹¹. Utilizamos el protocolo descrito para estudiar los efectos de clusterin en la auto-renovación de GCSC. Esta metodología también es aplicable a otros tipos de células madre cancerosas.

Protocolo

Toda experimentación utilizando células madre de cáncer gástrico derivadas del paciente descritas en este documento fue aprobada por el comité ético local⁷.

1. Cultivo de células madre de cáncer gástrico

1. Preparación de los GCSC medio de cultivo completo
   1. Preparar el medio de cultivo completo de los GCSC añadiendo un medio fresco DME/F12 con los siguientes ingredientes esenciales: 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, 1% Insulina/Transferrina/Selenita de sodio, 0,2% de glucosa, 0,5% B27, 1% Glutamax, 1% de aminoácidos no esenciales, 10 m 2-mercaptoetanol, 0,75 mg/ml NaHCO₃, 10 m de tioglucerol, 100 UI/ml de penicilina y 100 g/mLcecina. Filtrar y esterilizar con un filtro de 0,22 m.
      NOTA: Se recomienda que el medio de cultivo completo de GCSC se almacene preferiblemente no más de dos semanas a 4 oC.
2. Recuperación de gcsC y cultura
   NOTA: Los GCSC se obtuvieron de la siguiente manera: Las muestras tumorales se sometieron a una disociación mecánica y enzimática. Las suspensiones de una sola célula se obtuvieron filtrando con red de nylon de una suspensión bien dispersa. Las células cancerosas resultantes se cultivaron en GCSCs Complete Culture Medium, y algunas células crecieron hasta formar esferas. Estas esferas fueron sometidas a disociación enzimática, y los GCSC se pueden obtener mediante la clasificación citofluorométrica de la población celular teñida con marcadores CD44/CD54. Se han notificado el protocolo detallado y los ensayos funcionales de los GCSC⁷.
   1. Precalegado GCSC completo medio de cultivo a 37 oC durante no más de 30 min.
   2. Descongelar los GCSC del almacenamiento de nitrógeno líquido y descongelar rápidamente los crioviales en un baño de agua de 37 oC. Siga arremolinando los viales hasta que todo el contenido se derrita totalmente.
      NOTA: Descongelar las células congeladas rápidamente (<1 min) en un baño de agua de 37 oC.
   3. Transfiera todo el contenido de los crioviales a un tubo centrífugo de 15 ml que contenga 10 ml de GCSC medio de cultivo completo. Centrífuga a 800 x g durante 5 min en RT.
   4. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y suspender el pellet celular en 10 ml de GCSC fresco medio completo. Placa la suspensión celular en un plato Petri de 100 mm. Incubar la placa a 37oC en una incubadora de 5%_co-2 y añadir 5 ml de medio fresco completo al tercer día.
3. Subcultura de tumoresferas de GCSC
   NOTA: Los GCSC del centro de las tumoresferas solo tienen nutrientes suficientes antes de que el tamaño de las esferas crezca hasta 80-100 m de diámetro. Una vez que aparecen esferas oscuras y de baja refractividad (alrededor de 6 días de cultura), es necesario subculturar las tumoresferas.
   1. Agitar el plato suavemente y transferir el medio de cultivo de la tumorsfera GCSC (el medio y las tumoresferas no adherentes) a un tubo de centrífuga estéril de 15 ml. Para volúmenes medios más grandes, pueden ser necesarios tubos centrífugos más grandes.
   2. Centrifugar a 600 x g durante 5 minutos y deseche cuidadosamente el sobrenadante. Después de la centrifugación, un pellet blanquecino será visible.
   3. Añadir 2 ml de solución de disociación celular para resuspender el pellet para la disociación mecánica y enzimática a 37 oC. Suavemente pipetear hacia arriba y hacia abajo 10 veces cada 2-3 min en el procedimiento de digestión para romper las esferas hasta que las tumoresferas se dispersen en la suspensión de una sola célula. Se recomienda que este proceso de disociación total sea inferior a 15 min.
      NOTA: Realice una comprobación visual bajo el microscopio para confirmar que no quedan esferas grandes ni agregados celulares.
   4. Añadir 10 ml de GCSC precalentado fresco medio de cultivo completo (5 veces el volumen de la solución de desprendimiento celular) para terminar el procedimiento de digestión y centrífuga a 800 x g en RT durante 5 min.
   5. Deseche el sobrenadante y resusppend las células con 1 ml de GCSC precalentado fresco medio de cultivo completo. Siembra un número adecuado de células en un nuevo plato de Petri de 100 mm con 10 ml de GCSC precalentados frescos completos medio de cultivo e incubar a 37oC, 5% CO₂.
   6. Realimentar los cultivos de tumoresferas después de 3 días añadiendo 5 ml de medio completo precalentó fresco. Después de 6 días, las células de paso cuando las tumoresferas crecen hasta 80-100 m de diámetro.
4. Criopreservación de GCSC
   NOTA: No criopreserve las células GCSC añadiendo directamente medios a las tumoresferas. Las tumoresferas de LOS GCSC deben digerirse en células individuales para que el agente protector celular pueda entrar en cada célula para asegurar el almacenamiento estable a largo plazo de las células. Asegúrese de que las células estén en situación saludable y sin contaminación.
   1. Cosechar las tumoresferas de gcSC. Centrífuga a 600 x g durante 5 min.
   2. Deseche el sobrenadante y agregue 2 ml de solución de disociación celular para disociar las tumoressferas GCSC a 37 oC. Finalice el procedimiento de digestión añadiendo 10 ml de GCSC completo medio de cultivo.
   3. Centrifugar a 800 x g durante 5 min y recoger GCSC individuales.
   4. Suspenda suavemente los GCSC con un medio criopreservador sin suero. La concentración final recomendada es de 5 x 10⁵ - 5 x 10⁶ células/ml.
   5. Dispensar la suspensión celular en 1 ml de alícuotas en viales criogénicos marcados.
   6. Coloque inmediatamente los crioviales que contienen las células en una cámara de isopropanol y guárdelas a -80 oC. Transfiera los viales al nitrógeno líquido al día siguiente para su almacenamiento a largo plazo.

2. Generación de líneas DE GCSC de derribo inducibles

ADVERTENCIA: Los lentivirus recombinantes han sido designados como organismos de Nivel 2 por el Instituto Nacional de Salud y el Centro para el Control de Enfermedades. El trabajo relacionado con el lentivirus requiere el mantenimiento de una instalación de nivel 2 de Bioseguridad, teniendo en cuenta que los sobrenadantes virales producidos por estos sistemas lentivirales podrían contener virus recombinantes potencialmente peligrosos.

1. Generación de partículas de lentivirus
   1. Sintetizar 2 vectores lentivirales que transportan el ARNmo inducible dirigido a clusterin humano y un vector lentiviral de control no focalista (GV307) de GeneChem basado en el diseño de la Tabla 1 (el vector GV307 contiene: TetIIP-TurboRFP-MCS(MIR30)-Ubi-TetR-IRES-Puromycin).
   2. Semilla 4 x 10⁶ 293T lenti-viral células de envasado en un plato de 100 mm Petri con 10 ml de DMEM complementado con 10% de suero bovino fetal.
   3. Incubar células 293T durante la noche a 37oC, 5% CO₂. Asegúrese de que la densidad celular 293T es de aproximadamente 50-80% confluente el día de la transfección.
   4. Lleve el medio sérico reducido a temperatura ambiente y prepare el tubo A y el tubo B como se describe en la Tabla 2.
   5. Transfiera el tubo A al tubo B, mezcle bien e incubar los complejos durante 20 minutos a temperatura ambiente para preparar complejos de lípidos-ADN.
   6. Retirar 5 ml de medio, antes de añadir complejo de lípidos-ADN, dejando un total de 5 ml.
   7. Añadir 5 ml de complejo de lípidos-ADN en el plato de cultivo gota y suavemente agitar el plato para distribuir el complejo.
      NOTA: Dispensar cuidadosamente el líquido contra la pared del plato para evitar perturbar las células 293T.
   8. Incubar el plato de cultivo durante 24 h a 37oC, 5% CO₂.
   9. Después de 24 horas después de la transfección, retire cuidadosamente el medio de transfección y reemplace suavemente con 10 ml de DMEM precalentó complementado con 10% de FBS. Incubar durante 24 h a 37oC, 5% CO₂.
      NOTA: Todo el sobrenadante y las puntas deben tratarse con un 10% de lejía antes de su eliminación.
   10. Aproximadamente después de 48 horas después de la transfección, cosechar 10 ml de sobrenadantes que contienen lentivirus.
       NOTA: Todos los recipientes y puntas de cultivo celular deben tratarse con un 10% de lejía antes de su eliminación.
   11. Filtrar el sobrenadante lentiviral usando un filtro de poro de 0,45 m para eliminar los desechos celulares.
       NOTA: Todos los filtros y jeringas deben tratarse con un 10% de lejía antes de su eliminación.
   12. Transfiera el sobrenadante clarificado a un recipiente estéril, agregue Lenti-X Concentrator (1/3 volumen de sobrenadante clarificado) para mezclar por inversión suave.
   13. Incubar la mezcla a 4oC durante la noche.
   14. Centrifugar muestras a 1.500 x g durante 45 min a 4oC. Después de la centrifugación, y el pellet blanquecino será visible. Retire cuidadosamente el sobrenadante, teniendo cuidado de no molestar el pellet.
       NOTA: Todo el sobrenadante y las puntas deben tratarse con un 10% de lejía antes de su eliminación.
   15. Resuspender suavemente el pellet en 1 ml de DMEM complementado con 10% FBS como stock de virus, almacenar a -80 oC.
2. Generación de líneas celulares trans infectadas estables
   1. Semilla 6 x 10⁶ GCSC en un plato de Petri de 100 mm con 10 ml dmEM complementado con 10% de FBS durante 24 h a 37 oC, 5% CO₂ (70-80% de confluencia antes de la infección).
   2. Aspirar el medio en el plato, añadir las partículas lentivirales concentradas diluidas con 4 ml de medio DMEM completo que contenga reactivo de polibrena (5 g/ml) en el plato. Incubar durante 18 h a 37oC, 5% CO₂.
      NOTA: La concentración óptima de polibrena depende del tipo de célula y puede ser necesario probar en diferentes concentraciones para decidir las concentraciones efectivas. De lo contrario, puede determinarse empíricamente, generalmente en el rango de 2-10 g/ml. Todos los tubos y puntas deben tratarse con un 10% de lejía antes de su eliminación.
   3. Cambiar el medio, sustituirlo por 10 mL de DMEM por un 10% de FBS medio e incubar durante 24 h a 37oC, 5% CO₂.
      NOTA: Todo el medio y las puntas deben tratarse con un 10% de lejía antes de su eliminación.
   4. Aspirar el sobrenadante con residuos celulares, sustituirlo con DMEM fresco complementado con un medio FBS al 10% que contenga puromicina (2,5 g/ml) e incubar durante 24 h a 37oC, 5%_co-2. A continuación, sustituya el DMEM fresco complementado con un 10% de medio FBS que contenga puromicina (5 g/ml) e incubar a 37 oC, 5% de_CO2 durante 24 h adicionales.
   5. Enjuague los GCSC adherentes dos veces con 5 ml de DPBS sin calcio ni magnesio.
   6. Disociar GCSC con 1 ml de solución de disociación celular precalentada e incubar 2-3 min a 37oC.
   7. Añadir 5 ml de GCSC precale calentados frescos medio de cultivo completo a la suspensión celular.
   8. Dispensar 3 ml en un tubo centrífugo de 15 ml (tubo A) para crioconservar las células, y los otros 3 ml en un tubo centrífugo de 15 ml (tubo B) para inducir por doxiciclina.
   9. Tubo de centrífuga A y tubo B a 800 x g durante 5 min.
   10. Resuspender el pellet del tubo A con 1 ml de medio criopreservador libre de suero, transferir el vial a -80 oC durante la noche, y eliminarlo en el almacenamiento de nitrógeno líquido.
   11. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células del tubo B en 1 ml de GCSC precalentado fresco medio de cultivo completo. Siembra un número adecuado de células en un nuevo plato de Petri de 100 mm de 10 ml de GCSC precalentado fresco de 10 ml completo medio de cultivo completo con doxiciclina (Dox) (2,5 g/ml) e incubar durante 48 h a 37 oC, 5% CO₂.
       NOTA: La concentración óptima de Dox puede variar entre las líneas celulares. Cada línea celular debe probarse en diferentes concentraciones de Dox para decidir las concentraciones efectivas de KD y de toxicidad en las células.
   12. Confirmar la represión estable de clusterin en gcSC por hinchazón occidental.

3. Ensayo de formación de esferas

1. Descongelar las líneas GCSC de derribo inducibles congeladas (ver paso 1.2).
2. Determinar la densidad de celdas viable de una muestra de 10 l utilizando un contador de celdas automatizado.
3. Ajuste el volumen con GCSC precalegado medio de cultivo completo para obtener una concentración de 2 x 10⁴ células viables/ml.
4. Dispensar en 3 nuevos pozos de placa de cultivo de ultra-bajo accesorio de 96 pozos (0,1 ml/pozo) cada grupo.
5. Incubar las células en una incubadora a 37oC con 5% de CO₂. La formación de la esfera debe ocurrir dentro de 3-10 días. Monitorear y registrar la visualización de la formación de tumoresferas cada 2 días.
   NOTA: No se recomienda cambiar el medio en caso de alteración de la formación de las tumoresferas. Estas tumoresferas deben distinguirse fácilmente de las células simples y agregadas.
6. Determinar los resultados de la formación de tumoresfera mediante la evaluación del tamaño de las tumoresferas formadas utilizando software de imágenes.

Resultados

Las células madre del cáncer gástrico del adenocarcinoma gástrico humano primario se cultivaron en un medio de cultivo libre de suero. Después de 6 días, las células se expandieron desde el fenotipo similar a una célula única (Figura 1A) para formar esferas grandes (Figura 1B).

Para evaluar la función de clusterin en GCSC, las...

Discusión

GC es la tercera causa de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo. Los GCSC son críticos en la recaída del cáncer gástrico, la metástasis y la resistencia a los medicamentos. El uso de GCSC de pacientes con cáncer gástrico nos permitirá explorar su punto débil y desarrollar los medicamentos de orientación para el tratamiento de pacientes con GC.

El ensayo de formación de la esfera es un método útil para examinar el potencial de auto-renovación de células madre cancero...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Millipore	SLGP033RB
1-Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145
2-Mercaptoethanol	Gibco	2068586
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Sigma-Aldrich	CLS3474
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10228
Countess II Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAX1000
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G6152
DMEM/F-12, HEPES	Gibco	11330032
DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate	Gibco	10569044
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190250
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia	Gibco	10099141
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061
Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X	Gibco	41400045
lentiviral vector	GeneChem	GV307
Lenti-X Concentrator	Takara	631232
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Invitrogen	L3000015
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X	Gibco	11140050
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized	Millipore	SLHV033RB
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes	Thermo Scientific	5000-1020
Nunc Cell Culture/Petri Dishes	Thermo Scientific	171099
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985070
Penicillin-Streptomycin, Liquid	Gibco	15140122
pHelper 1.0 (gag/pol component)	GeneChem	pHelper 1.0
pHelper 2.0 (VSVG component)	GeneChem	pHelper 2.0
Polybrene	Sigma-Aldrich	H9268
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium	ZENOAQ	11890
StemPro Accutase Cell Dissociation Solution	Gibco	A1110501
UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5	Invitrogen	15567027
ZEISS Inverted Microscope	ZEISS	Axio Vert.A1