Síntesis de nanopartículas magnéticas funcionalizadas, su conjugación con el Siderophore Feroxamine y su Evaluación para la Detección de Bacterias

Resumen

Este trabajo describe protocolos para la preparación de nanopartículas magnéticas, su recubrimiento con SiO_2,seguido de su funcionalización de amina con (3-aminopropil)trietilsilano (APTES) y su conjugación con deferoxamina utilizando una moiedad sucinil como enlace. También se describe en detalle una descripción estructural profunda y un ensayo de bacterias de captura utilizando Y. enterocolitica para todas las nanopartículas intermedias y el conjugado final.

Resumen

En el presente trabajo, se describe la síntesis de nanopartículas magnéticas, su recubrimiento con SiO_2,seguido de su funcionalización de aminas con (3-aminopropil)triexisilano (APTES) y su conjugación con deferoxamina, un sideroforo reconocido por Yersinia enterocolitica,utilizando una moieteidad sucinil como enlacedor.

Las nanopartículas magnéticas (MNP) de magnetita (Fe₃O₄) se prepararon mediante método solvotermal y se recubrieron con SiO₂ (MNP@SiO₂) mediante el proceso de Stéber seguido de la funcionalización con APTES (MNP@SiO₂@NH_2). Luego, la feroxamina se conjugaba con el MNP@SiO₂@NH_{2 por} acoplamiento de carbodímida para dar MNP@SiO₂@NH₂@Fa. La morfología y las propiedades del conjugado y los intermedios fueron examinadas por ocho métodos diferentes, incluyendo la difracción de rayos X en polvo (RDX), la espectroscopia infrarroja de transformación de Fourier (FT-IR), la espectroscopia de Raman, la espectroscopia de fotoelectrón de rayos X (XPS), la microscopía electrónica de transmisión (TEM) y el mapeo de rayos X dispersivos de energía (EDX). Esta caracterización exhaustiva confirmó la formación del conjugado. Finalmente, con el fin de evaluar la capacidad y especificidad de las nanopartículas, se probaron en un ensayo de bacterias de captura utilizando Yersinia enterocolitica.

Introducción

Los métodos de detección de bacterias que utilizan MNP se basan en el reconocimiento molecular de anticuerpos, aptámeros, bioproteínas, carbohidratos conjugados con MNP por la bacteria patógena^1. Teniendo en cuenta que los sideróforos son reconocidos por receptores específicos en la membrana externa de las bacterias, también podrían vincularse a MNP para aumentar su especificidad². Los sideróforos son pequeñas moléculas orgánicas implicadas en la absorción De Fe³⁺ por bacterias^3,,4. Todavía no se ha notificado la preparación de conjugados entre los sideróforos y MNP junto con su evaluación para la captura y aislamiento de bacterias.

Uno de los pasos cruciales en la síntesis de conjugados de nanopartículas magnéticas con moléculas pequeñas es la selección del tipo de enlace o interacción entre ellas para asegurar que la molécula pequeña esté unida a la superficie del MNP. Por esta razón, el procedimiento para preparar el conjugado entre nanopartículas magnéticas y feroxamina —el sideróforo reconocido por Yersinia enterocolitica—se centró en la generación de una superficie modificable del MNP para permitir vincularlo covalentemente al sideróforo por la química del carbodia. Con el fin de obtener una nanopartículas de magnetita uniforme (MNP) y para mejorar la nucleación y el control de tamaño, se llevó una reacción de solvolisis con alcohol bencílico en un bloque térmico sin sacudir⁵. A continuación, se generó un recubrimiento de sílice por el método St-ber para conferir protección y mejorar la estabilidad de la suspensión de nanopartículas en medios acuosos^6. Teniendo en cuenta la estructura de la feroxamina, la introducción de grupos de aminas es necesaria para producir nanopartículas adecuadas (MNP@SiO₂@NH₂₎que se conjugan con el sideroforo. Esto se logró mediante la condensación de (3-aminopropil)triexisilano (APTES) con los grupos de alcohol presentes en la superficie de las nanopartículas modificadas de sílice (MNP@SiO₂) utilizando un método sol-gel⁷.

Paralelamente, el complejo de hierro de feroxamina(III) se preparó mediante la complejidad de la deferoxamina disponible comercialmente con acetil acetil de hierro en solución acuosa. N-succinilferoxamina, que lleva grupos sucintos que actuarán como enlaces, se obtuvo por la reacción de la feroxamina con anhídrido succínico.

La conjugación entre MNP@SiO₂@NH₂ y N-succinilferoxamina para dar MNP@SiO₂@NH_Fase llevó a cabo a través de la química de carbodiimida utilizando como reactivos de acoplamiento benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate (BOP) y 1-hydroxybenzotriazol (HOBt) en un medio básico suave para activar el grupo de ácido terminal en N-succinylferoxamine⁸.

Una vez que los MNP se caracterizaron, evaluamos las capacidades de las nanopartículas magnéticas desnudas y funcionalizadas para capturar el tipo salvaje (WC-A) y un mutante de Y. enterocolitica carente de receptor de feroxamina FoxA (FoxA WC-A 12-8). Los MNP simples, los MNP funcionalizados y el MNP@SiO conjugado₂@NH_Fase les permitió interactuar con cada cepa de Y. enterocolitica. Los agregados bacteria-conjugados fueron separados de la suspensión bacteriana por la aplicación de un campo magnético. Los agregados separados se enjuagaron dos veces con solución salina tamponada de fosfato (PBS), re-suspendido en PBS para preparar diluciones en serie y luego, fueron chapados para el conteo de colonias. Este protocolo demuestra cada paso de la síntesis de MNP@SiO₂@NH@Fa, la caracterización estructural de todos los intermedios y el conjugado, y un ensayo de captura de bacterias como una manera fácil de evaluar la especificidad del conjugado en relación con los intermedios. ⁹

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Protocolo

NOTA: Para las reacciones realizadas en condiciones de atmósfera inerte, toda la cristalería se secó previamente en un horno a 65oC, sellada con un tabique de goma y purgada con argón tres veces.

1. Síntesis de nanopartículas magnéticas conjugadas con feroxamina

1. Síntesis de nanopartículas magnéticas Fe₃O₄ (MNP)
   1. Añadir 0,5 g de Fe(acac)₃ en un vial de vidrio de 20 ml y luego mezclar con 10 ml de alcohol bencílico.
   2. Sonicar esta mezcla durante 2 min, luego transferir a un bloque de calentamiento y calentar a 180 oC durante 72 h.
   3. Una vez completada la reacción, deje que los viales se enfríen, enjuague las nanopartículas con 96% de etanol y centrífuga a 4000 x g durante 30 min. Repita la centrifugación al menos dos veces.
   4. Separe las nanopartículas del sobrenadante por atracción magnética utilizando un imán de neodimio (NdFeB) y deseche el disolvente residual.
   5. Enjuagar con 96% de etanol repitiendo paso 1.1.4. y desechar el sobrenadante alternando con sonicación en un baño durante 1 min a 40 kHz hasta que el disolvente se vea claro.
2. Recubrimiento de nanopartículas magnéticas SiO₂ (MNP@SiO₂)
   1. Preparar una suspensión de 2 g de MNP en 80 ml de isopropanol y luego añadir 4 ml de amoníaco al 21%, 7,5 ml de agua destilada y 0,56 ml de ortósitil tetraetilo (TEOS) (en este orden) en un matraz inferior redondo con una barra de agitación magnética.
   2. Calentar la mezcla a 40 oC durante 2 h con agitación continua y luego sonicar durante 1 h.
   3. Separe el MNP con un imán, deseche el sobrenadante y disperse en 30 ml de isopropanol.
   4. Repita los pasos 1.2.1. y 1.2.2.
   5. Retire y lave la barra de agitación magnética con 96% de etanol para recuperar todo el material.
   6. Separe las nanopartículas del sobrenadante por atracción magnética usando un imán.
   7. Deseche el sobrenadante y enjuague las nanopartículas con 96% de etanol tres veces alternando con sonicación.
   8. Seque las nanopartículas al vacío a temperatura ambiente durante 12 h.
3. Funcionalización de MNP@SiO₂ con (3-aminopropil)triexisilano (APTES)
   1. Enjuagar 500 mg del MNP@SiO₂ obtenidos del paso anterior con N,N-dimetilformamida (DMF) en atmósfera inerte y luego sonicar durante 1 min a 40 kHz. A continuación, deseche el sobrenadante y repita este proceso tres veces.
   2. Vuelva a suspender las partículas en un matraz inferior redondo, bajo agitación con una barra de agitación magnética y añada 9 ml de APTES.
   3. Revuelva la mezcla a 60oC durante 12 h.
   4. Deseche el sobrenadante y enjuague las nanopartículas con 96% de etanol tres veces alternando con sonicación.
4. Síntesis de feroxamina
   1. Disolver 100 mg (0,15 mmol) de sal desferoxamina de mesilato y 53,0 mg (0,15 mmol) de Fe(acac)₃ en 5 ml de agua destilada y agitar la mezcla durante la noche a temperatura ambiente.
   2. Lave el producto resultante tres veces con 20 ml de EtOAc en un embudo de separación y, a continuación, retire el disolvente orgánico al vacío utilizando un evaporador rotatorio.
   3. Seque la fase acuosa para pagar la feroxamina como un sólido rojo.
5. Síntesis de N-succiniferoxamina
   1. Añadir 350 mg (3,50 mmol) de anhídrido succínico a una solución de 100 mg (0,17 mmol) de feroxamina en 5 ml de piridina en un matraz de fondo redondo de 50 ml bajo atmósfera inértea.
   2. Revuelva la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 16 h. Después de ese tiempo, eliminar el exceso de piridina bajo presión reducida en un evaporador rotatorio para dar un sólido de color rojo oscuro.
   3. Disolver el crudo de reacción en 3 ml de metanol.
   4. Transfiera la solución metanol a una columna sephadex (20 cm de Sephadex en una columna de 20 mm de diámetro) y elula a 0,5 ml/min.
   5. Recoger la fracción roja y retirar el metanol bajo vacío utilizando un evaporador rotatorio.
6. Síntesis del MNP@SiO conjugado₂@NH@Fa
   1. Enjuagar 30 mg de MNP@SiO seco₂@NH₂ dos veces con DMF y sonicar las nanopartículas en un matraz Erlenmeyer de 100 ml durante 30 minutos bajo atmósfera inerte.
   2. Preparar una solución de N-succinilferoxamina (200 mg, 0,30 mmol), benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-hexafluorofosfato de fosfonio (BOP, 173 mg, 0,45 mmol), 1-hidroxibenzotriazol (HOBt, 46 mg, 0,39 mmol) y N,N-diisopropylethylamine (DIPEA, 128,8 mg, 1,21 mmol) en 10 ml de DMF (Mix A) en un matraz de fondo redondo de 50 ml bajo atmósfera inert.
   3. Suspenda el MNP@SiO previamente enjuagado₂@NH₂ en 3 ml de DMF bajo sonicación en seco en condiciones libres de oxígeno utilizando una atmósfera de gas de argón (Mix B).
   4. Agregue la mezcla A para mezclar B dropwise.
   5. Agitar la mezcla final con un agitador orbital a temperatura ambiente durante la noche.
   6. Separe el conjugado resultante (MNP@SiO₂@NH@Fa) de la suspensión utilizando un imán.
   7. Enjuagar el sólido resultante y luego sonicarlo cinco veces con 10 ml de etanol.
   8. Seque el sólido al vacío durante 24 h.

2. Ensayo bacteriano con cepas de Y. enterocolitica para cuantificar la captura de bacterias patógenas con nanopartículas

1. Preparar una suspensión de todas las nanopartículas intermedias y el conjugado final en PBS a 1 mg/ml en tubos estériles de 2 ml.
2. Preparar un cultivo de Y. enterocolitica en 5 ml de caldo de Luria Bertani (LB) durante la noche incubando a 37 oC.
3. Preparar un caldo de soja triprítico (TSB) de 5 ml añadiendo 50 ml de 10 ml 2,2o-bipiril.
4. Inocular los 5 ml de TSB deficiente en hierro con 50 ml del cultivo nocturno de Y. enterocolitica y luego, incubar a 37 oC con agitación hasta alcanzar un OD₆₀₀ a 0,5-u20120.8.
5. Tomar 100 l del cultivo obtenido en el paso 2.4 y diluir en un tubo de 2,0 ml que contenga 900 l de PBS para obtener una primera dilución de 1/10. Luego, prepare una dilución 1/100 de la primera dilución utilizando el mismo procedimiento para obtener una concentración de células bacterianas a 1 x 10⁶ Unidades Formadoras de Colonias (CFU)/ml aproximadamente.
6. Añadir 100 l de suspensión de nanopartículas a 1 mg/ml a 1 ml de la dilución 1/100 de la suspensión bacteriana en un tubo de 2,0 ml, y homogeneizar con vórtice.
7. Incubar el cultivo a 20oC durante 1 h.
8. Separe los agregados MNP/bacterias utilizando un imán y deseche cuidadosamente el sobrenadante.
9. Enjuague las nanopartículas separadas dos veces con 1 ml de PBS utilizando un vórtice.
10. Suspenda las nanopartículas en 1 ml de PBS para contar la cantidad de captura bacteriana en CFU/ml.
11. Preparar cuatro diluciones sucesivas 1/10 de la suspensión anterior hasta alcanzar una dilución de 1 x^{10 -4.}
12. Placa de 10 l de cada dilución sobre placas de agar TS e incubarlas a 37oC durante la noche.
13. Fotografía la placa con un digitalizador de gel en modo epi blanco. Procesar la imagen con un software adecuado para amplificar un lugar para contar el número de colonias individuales.
    NOTA: Cada intermedio MNP se caracterizó para dar seguimiento al progreso de la síntesis. En primer lugar, los MNP desnudos fueron estudiados por XRD para comprobar la estructura cristalina. Entonces, el espectro FT-IR de cada intermedio fue ejecutado para marcar los cambios que ocurrieron en la reacción correspondiente. También se llevó a cabo un análisis de espectroscopia raman de cada intermedio con el fin de confirmar las conclusiones deducidas de los espectros FT-IR. El análisis TGA nos permitió estimar el peso de pérdida de los intermedios que llevan material orgánico en su estructura. La morfología y el tamaño de cada intermedio fueron estudiados por TEM. Finalmente, el análisis de XPS fue crítico para determinar los estados de oxidación del átomo en cada superficie intermedia de MNP y para confirmar la formación de unión covalente en el MNP@SiO conjugado₂@NH@Fa.

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Resultados

Se lleva a cabo una caracterización estructural exhaustiva para determinar la morfología y las propiedades de cada conjugado intermedio y final. Para ello, se utilizan las técnicas XRD, FT-IR, Espectroscopia Raman, TGA, TEM, mapeo EDX y XPS para demostrar la formación del conjugado. Los estados de oxidación de los átomos en la superficie de las nanopartículas adquiridas por espectroscopia de fotoelectrón de rayos X (XPS) son los datos más relevantes para confirmar la formación de enlaces covalentes entre la nan...

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Discusión

Este protocolo describe la síntesis de un conjugado entre nanopartículas magnéticas y la feroxamina siderofore mediante unión covalente. La síntesis de magnetita se llevó a cabo utilizando el protocolo reportado por Pinna et al.⁵ seguido de recubrimiento de sílice para proteger el núcleo magnético de la corrosión en sistemas acuosos, minimizar la agregación y proporcionar una superficie adecuada para la funcionalización⁶. Se modificó el proceso de recubrimiento...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Hydroxybenzotriazole hydrate HOBT	Acros	300561000
2,2′-Bipyridyl	Sigma Aldrich	D216305
3-Aminopropyltriethoxysilane 99%	Acros	151081000
Ammonium hydroxide solution 28% NH3	Sigma Aldrich	338818
Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent	Acros	209800050
Benzyl alcohol	Sigma Aldrich	822259
Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC)	Sigma Aldrich	D9533
Ethanol, anhydrous, 96%	Panreac	131085
Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical
Iron(III) acetylacetonate 97%	Sigma Aldrich	F300
LB Broth (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022
N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal	Acros	459591000
N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal	Acros	326871000
Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal	Acros	339421000
Sephadex LH-20	Sigma Aldrich	LH20100
Succinic anhydride >99%	Sigma Aldrich	239690
Tetraethyl orthosolicate >99,0%	Sigma Aldrich	86578