Viabilidad mejorada para cultivos de hidrogel 3D Ex vivo de xenoinjertos derivados del paciente en una plataforma microfluídica perfundida

Resumen

Este protocolo demuestra métodos para permitir el cultivo in vitro extendido de xenoinjertos derivados del paciente (PDX). Un paso mejora la viabilidad general de los cultivos de racimos multicelulares en hidrogeles 3D, a través de la eliminación directa de células individuales no viables. Un paso secundario demuestra las mejores prácticas para el cultivo de PDX en una plataforma microfluídica perfundida.

Resumen

Los xenoinjertos derivados del paciente (PDX), generados cuando el tejido tumoral resecado del paciente se injerta directamente en ratones inmunocomprometidos, permanecen biológicamente estables, preservando así las características moleculares, genéticas e histológicas, así como la heterogeneidad del tumor original. Sin embargo, el uso de estos modelos para realizar una multitud de experimentos, incluyendo la detección de drogas, es prohibitivo tanto en términos de costo como de tiempo. Los sistemas de cultivo tridimensionales (3D) son ampliamente vistos como plataformas en las que las células cancerosas conservan su integridad biológica a través de interacciones bioquímicas, morfología y arquitectura. Nuestro equipo tiene una amplia experiencia en el cultivo de células PDX in vitro utilizando matrices 3D compuestas de ácido hialurónico (HA). Con el fin de separar las células estromales fibroblastas de ratón asociadas con los PDX, utilizamos el cultivo de rotación, donde las células estromales se adhieren a la superficie de las placas tratadas con cultivo de tejidos mientras flotan las células tumorales PDX disociadas y se autoasocien en cúmulos multicelulares. También flotan en el sobrenadante son células simples, a menudo muertas, que presentan un desafío en la recolección de clústeres PDX viables para la encapsulación aguas abajo en hidrogeles para el cultivo celular 3D. Con el fin de separar estas células individuales de los cúmulos de células vivas, hemos empleado centrifugación de gradiente de paso de densidad. El protocolo descrito aquí permite el agotamiento de células individuales no viables de la población sana de grupos celulares que se utilizarán para la experimentación in vitro. En nuestros estudios, incorporamos los cultivos 3D en placas microfluídicas que permiten la perfusión media durante el cultivo. Después de evaluar los cultivos resultantes utilizando un ensayo de viabilidad basado en imágenes fluorescentes de células purificadas frente a no purificadas, nuestros resultados muestran que este paso de separación adicional redujo sustancialmente el número de células no viables de nuestros cultivos.

Introducción

Durante la última década, el campo de la investigación del cáncer ha demostrado un renovado entusiasmo por los xenoinjertos derivados del paciente (PDX) como una herramienta para evaluar la dependencia de las vías de las células cancerosas y la susceptibilidad a los medicamentos¹. Los modelos PDX más comunes se establecen mediante implantación subcutánea u ortotópica de células tumorales humanas (un fragmento tumoral, un grupo de células derivadas de tumores disociadas o una muestra de células tumorales circulantes aisladas (CTC)) en un huésped de roedores. Si la "toma" tumora tiene éxito, las células del xenoinjerto proliferarán, vascularizarán e interactuarán de otra manera con el tejido huésped para crear un tumor, que puede ser cosechado en un tamaño óptimo, subdividido y reim implantado en otros huéspedes. Entre sus muchas ventajas como sistema modelo, los PDX suelen retener una parte sustancial de la heterogeneidad de la población de células tumorales nativas y permiten evaluar las vías específicas del ser humano y las respuestas celulares^2,,3. El contexto in vivo permite la interacción tumoral con vasculatura y otros estroma adyacentes y recapitula características tisulares como la dinámica de difusión de fármacos, la tensión de oxígeno y la matriz extracelular influyen en la progresión tumoral biológica y mecánicamente. Un aspecto negativo de los PDX es su dependencia de un huésped de roedores, tanto para la expansión del tumor como, en última instancia, para las pruebas de hipótesis. Debido a que muchos PDX no pueden adaptarse al cultivo bidimensional tradicional (2D) en el poliestireno del cultivo tisular sin perder muchas de sus características deseables, ha habido un mínimo de terreno medio para los investigadores entre este método in vitro relativamente controlado, y el aumento significativo en los requisitos de gasto, instalaciones y tiempo para el uso de PDX in vivo.

Hemos descrito múltiples modelos in vitro que implementan el cultivo celular 3D dentro de una matriz de apoyo, y recientemente ampliamos ese trabajo para demostrar el cultivo ex vivo de los PDX derivados del cáncer de próstata múltiple (PCa), tanto solos como en co-cultivo con fibroblastos derivados de médula ósea^4,,5. Las matrices de hidrogel a base de ácido hialurónico (HA) proporcionan un soporte personalizable y biológicamente relevante para ambos tipos de células, con control fácil sobre las características del hidrogel y claridad óptica para la toma de imágenes a través de la profundidad del hidrogel^6.

Los tejidos tumorales PDX maduros comprenden una mezcla variable de células cancerosas humanas heterogéneas y estroma de ratón (fibroblastos, células endoteliales, etc.). Para estudiar las contribuciones específicas de tipo celular a la progresión tumoral in vitro, puede ser ventajoso disociar tumores, separar las poblaciones celulares e incorporarlos experimentalmente de manera organizada para diseccionar vías de comunicación intercelular. Las poblaciones de células mixtas dentro de los digestatos de tejido tienen compatibilidad diferencial con condiciones específicas de cultivo. Por ejemplo, la viabilidad de los fibroblastos asociados al tumor requiere adherencia superficial o matrices 3D funcionalizadas con ligandos de integrina, mientras que las células PDX derivadas de la epitelial no suelen tener estos requisitos, sino que favorecen las interacciones entre células células. Estas diferencias se pueden aprovechar para lograr una separación efectiva de las células PDX de contaminar las células estromales del ratón. El cultivo de rotación de digestatos tisulares permite la adherencia de células estromales a la superficie de cultivo del tejido, mientras que las adherencias de células celulares impulsan las células PDX que flotan sobre la superficie de cultivo giratoria para formar cúmulos multicelulares en el sobrenadante en 24-48 h. Las características específicas de estos racimos varían con el PDX (por ejemplo, racimos grandes, apretados, altamente esféricos o agregados más pequeños y más sueltos que se asemejan a racimos de uva), pero suelen tener tamaños biológicamente relevantes (diámetro de 50 a 250 m), suficiente para evaluar las interacciones celulares que se basan en contactos intercelulares.

La recuperación y el procesamiento de tumores inevitablemente dan lugar a algún grado de muerte celular colateral, ya sea debido a daños a corto plazo por perturbación mecánica/enzimática, o incompatibilidad a largo plazo de subpoblaciones con las condiciones de cultivo elegidas. A pesar de la utilidad del cultivo de rotación como separación a granel inicial, las células muertas o moribundas inevitablemente se transfieren con los clústeres PDX y pueden influir en el cultivo resultante. Estas células muertas son a menudo células PDX individuales que no se integraron en un grupo, fibroblastos estromales de ratón que no pueden sobrevivir en condiciones de cultivo seleccionadas, o particularmente células endoteliales frágiles. Estas células moribundas pueden influir en los resultados experimentales de los "supervivientes" y pueden afectar sustancialmente a la cuantificación, por ejemplo, a través de ensayos de cribado de viabilidad basados en imágenes fluorescentes. Para mejorar la selección de células PDX vivas de este método, adaptamos los métodos de centrifugación con pasos de densidad para eliminar fácilmente las células muertas/moribundas individuales de las mezclas PDX y retener predominantemente cúmulos multicelulares vivos.

Para mejorar el estudio de los clusters derivados de PDX resultantes en el cultivo 3D, utilizamos una plataforma de cultivo de perfusión basada en microfluidos, la OrganoPlate (Figura 1), que es una plataforma de órgano en chip de alto rendimiento que permite el cultivo simultáneo de hasta 96 cultivos 3D perfundidos individuales en una base de microtíter de 384 potes(Figura 1A)^7,8. En la placa microfluídica de 2 carriles, un solo chip de tejido está conectado por dos canales microfluídicos(Figura 1B,canal de gel: rojo, canal de perfusión: azul) que abarcan cuatro pozos seguidos. Los dos canales microfluídicos están separados por una cresta de plástico corta llamada Phaseguide que evita el desbordamiento de un canal en su canal vecino adyacente, y simultáneamente permite una interfaz libre de membrana entre el contenido del gel y el canal de perfusión^9. Debido a que la parte inferior de la placa microfluídica se compone de vidrio de grado microscopio, los cultivos se pueden ver en la ventana de observación a través de la parte inferior de la placa con un microscopio estándar o automatizado. La perfusión se establece en la placa microfluídica con un balancín programable, utilizando la gravedad para conducir medios a través de los canales microfluídicos, entre pozos de depósito (Figura 1C). El flujo de perfusión-imitación más estrechamente recapitula el microambiente tumoral que el cultivo estático, lo que permite la incorporación de estrés de cizallamiento y una mejor distribución de gases y nutrientes. Los beneficios de mantener un cultivo celular de cáncer perfundido en la placa microfluídica se han descrito previamente como cultivos perfundidos de cáncer de mama exhibieron una viabilidad óptima en comparación con un cultivo estático en 3D de las mismas células^7.

El presente informe describe un método de centrifugación de gradiente de densidad adaptado para aislar los racimos de PDX multicelulares en vivo y demuestra su utilidad para establecer cultivos 3D PDX dentro de placas microfluídicas perfuibles. Debido a que un número cada vez mayor de laboratorios de investigación están buscando métodos para facilitar el uso de PDX, anticipamos que los protocolos presentados aquí serán de utilidad inmediata.

Protocolo

El tejido tumoral se obtuvo con el consentimiento del paciente y de acuerdo con un protocolo aprobado de la Junta de Revisión Institucional (IRB). Los xenoinjertos fueron implantados, cultivados y cosechados de acuerdo con un protocolo aceptado del Comité Institucional de Cuidado y Uso animal (IACUC).

NOTA: Todo el trabajo debe realizarse en un armario de seguridad biológica estéril para mantener la esterilidad. Todos los pasos deben llevarse a cabo a temperatura ambiente a menos que se especifique lo contrario.

1. Preparación de materiales para el procesamiento DE PDX

1. Fórceps de autoclave y mango de bisturí o cuchillas de afeitar.
2. Solución enzimática de disociación de descongelación a 4oC durante la noche o a temperatura ambiente el mismo día que la disociación de tejidos.
   NOTA: No se recomienda descongelar a 37 oC, ya que esto puede inactivar algunas enzimas de disociación.
3. Preparar al menos 100 ml de medio de cultivo PDX (mezcla de nutriente medio Eagle modificada de Dulbecco F-12 [DMEM-F12] con penicilina de 100 U/ml y estreptomicina y 30% de suero bovino fetal [FBS]), y al menos 25 ml de medio de procesamiento PDX (DMEM-F12 con 100 U/ml de penicilina y estreptomicina y sin FBS). Conservar a 4oC hasta que esté listo para usar.

2. Disociación PDX y purificación inicial de componentes estromales

1. Reunir utensilios autoclavedos, coladores celulares de 70 m (2 x 3), platos de cultivo de tejido redondo de 60 mm (2), placas de cultivo de tejido de 6 pocillos, tubos estériles de centrífuga cónica de 50 ml y solución salina estéril 1x tamponada fosfato (PBS). Cultivo cálido medio a 37 oC y permitir que la solución enzimática de disociación llegue a temperatura ambiente.
2. Cuando el tejido PDX haya alcanzado un diámetro de 1,0 x 1,5 cm en un huésped del ratón, extraiga quirúrgicamente el tumor del ratón por medios estándar (por ejemplo, bajo anestesia aceptada) y guárdelo sobre hielo en un tubo de 50 ml con medio de cultivo PDX (Figura 2A). Procesar el tejido con prontitud, a través de los pasos a continuación, para maximizar la viabilidad celular, preferiblemente dentro de 1 a 2 h después de la cosecha.
3. Transfiera el tejido tumoral a un tubo cónico estéril de 50 ml prepesado. Enjuague 6x con 30 ml de PBS estéril para eliminar sangre y contaminantes. Retire tanto líquido como sea posible y pese el tejido tumoral.
4. Transfiera el tejido tumoral a un plato de cultivo de tejido redondo de 60 mm y mince en trozos de 1 mm³ utilizando una cuchilla de afeitar estéril o bisturí.
5. Añadir 5 ml de medio de procesamiento PDX para recoger la suspensión tumoral y transferir a un nuevo tubo estéril de 50 ml. Enjuague el plato de cultivo con otros 5 ml de medio de procesamiento DE PDX, luego con solución enzimática de disociación (tumor de 10 ml/g, al menos 5 ml), añadiendo todos los enjuagues al tubo de 50 ml.
6. Incubar 20 min a 37oC con un suave temblor. Gire suavemente el tubo a mitad del tiempo de incubación.
7. Pipetear hacia arriba y hacia abajo suavemente con una pipeta serológica para romper los grumos. Filtrar las células con un colador celular de 70 m colocado sobre un nuevo tubo estéril de 50 ml.
   NOTA: Puede ser necesario más de un colador.
8. Centrifugar a 200 x g durante 5 min a células de pellet. Retire el sobrenadante y el resuspend en 2 x 3 ml del medio de cultivo PDX. Cuente las células utilizando un hemocitoómetro o un contador automático de células.
9. Utilice la Tabla 1 para estimar el número requerido de células derivadas de PDX disociadas necesarias para lograr la densidad de celdas deseada por chip.
   NOTA: Los valores de la Tabla 1 están pensados para ser un punto de partida. Los valores reales variarán debido a la viabilidad/celularidad del tejido y a la pérdida celular por congelación/recuperación. Los tumores PDX son individuos incluso dentro de un tipo de cáncer determinado, por lo que estos valores deben ajustarse empíricamente.
10. Del número calculado en el paso 2.9, placa 1-2 x 10⁶ células en 5 ml de medio de cultivo PDX por pozo de una placa de cultivo de tejido de 6 pozos. Incubar (37oC, 5% CO_2,95% de humedad) durante 48 h con agitación suave (50-55 rpm) para promover la formación del racimo(Figura 2B). Después de que se hayan formado el racimo, proceda a la sección 3 para la centrifugación.
11. Cryopreserve células PDX no utilizadas de la disociación inicial en 50% FBS + 40% DMEM-F12 + 10% sulfóxido de dimetil (DMSO) o un medio de congelación de células primarias disponible comercialmente.
    NOTA: Las células estromales de ratón adherentes también se pueden recuperar de la superficie de la placa de tejido, si se desea, enjuagando brevemente con medio de cultivo y expandiéndose por medios estándar.
12. Para el uso posterior de células tumorales PDX crioconservadas/estroma de ratón, descongelar las células en un baño de agua de 37 oC durante 2 minutos. Recuento y placa en una placa de cultivo de tejido de 6 pozos como se describe en el paso 2.10 antes de proceder a la sección 3. Aumente el número de células PDX en un 20 % para acomodar las pérdidas de viabilidad por criopreservación.

3. Separación basada en la centrifugación de gradiente de densidad de racimos derivados de PDX de células individuales

1. Preparar 20 ml de solución de gradiente de densidad 100% mezclando a fondo 18 ml de solución de centrifugación de gradiente de densidad con 2 ml de solución de sal equilibrada (HBSS) de 10x Hanks estéril en un tubo cónico estéril de 50 ml. Haga soluciones de gradiente de densidad de 10 ml cada una de 20%, 30%, 40% y 55% al diluir esta solución del 100% con HBSS estéril 1x y mezclar bien.
   NOTA: Estos volúmenes son suficientes para dos gradientes de 15 ml que se pueden utilizar para separar 15 x 10⁶ celdas cada uno. Si se separan menos de 15 x 10⁶ celdas, el segundo gradiente se debe utilizar como equilibrio para la centrifugación.
2. Añadir 3 ml de solución de gradiente de densidad del 55% en la parte inferior de un tubo cónico de 15 ml. Sosteniendo el tubo en un ángulo, muy suavemente capa 3 mL de 40% solución de gradiente de densidad en la parte superior de la capa del 55%, dispensando lentamente el líquido en el lado angular del tubo para evitar mezclar las capas. Repita con la solución de gradiente de densidad del 30%.
3. Recoger el sobrenadante de cultivos de rotación PDX con una pipeta serológica de 5 ml, superficie de la placa de enjuague suavemente. Centrifugar a 200 x g durante 2 min a células de pellet.
4. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 3 ml de 20% solución de gradiente de densidad de acuerdo con el número de gradientes necesarios para separar las células. Capa cuidadosamente 20% solución de gradiente de densidad con celdas en la parte superior de los degradados. Si solo utiliza un tubo de degradado para las células, encima del tubo de gradiente de equilibrio con una solución de gradiente de densidad del 20% libre de células.
5. Tapar los tubos y centrífuga en una centrífuga de rotor de cucharón oscilante durante 30 minutos a 4 oC, 2.000 x gy 0 freno.
6. Después de la centrifugación, las fracciones serán visibles(Figura 2C). Recoger 2 x 3 ml de fracciones en tubos frescos de 15 ml. Agregue 3 x 4 volúmenes de 1 hbSS estéril a cada fracción e invierta para mezclar a fondo.
7. Centrifugar a 1.000 g durante 3 min a células de pellet. Retire el sobrenadante y resusppend el pellet celular en 1 x 2 ml del medio de procesamiento PDX.
   NOTA: Los clústeres de células PDX viables se encuentran típicamente en la interfaz de solución de gradiente de densidad de 40-55% (Figura 2D) con células muertas/moribundas únicas que se acumulan en la interfaz de solución de gradiente de densidad de 20 x 40% para la mayoría de los PDX probados.
8. Retire una alícuota pequeña y representativa (50-100 l) para la re-disociación con un volumen igual de solución enzimática de disociación para evaluar el número de células en la suspensión celular agrupada. Recuento de células con un hemocitoómetro o un contador de células automatizado.

4. Preparación de hidrogeles y siembra de placas microfluídicas

1. Reconstituir soluciones de hidrogel HA (HA modificado con tiol, HA-SH; diacrilato de polietilenglicol de tiol reactiva, PEGDA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
2. Usando una pipeta multicanal, agregue 50 l de HBSS a todos los pocillos en columnas de ventanas de observación (columna 3, 7, 11, 15, 19, 23) de una placa microfluídica de 2 carriles para mantener la humedad del cultivo y las condiciones óptimas de imagen.
3. Calcule el volumen de la suspensión celular a partir de la sección 3 necesaria para 50 ml de hidrogel con la densidad celular deseada (es decir, 5.000 células/L). Para sembrar una placa microfluídica, aliquot el volumen calculado en cada uno de 4 tubos estériles de centrífuga de 1,5 ml.
   NOTA: Los hidrogeles HA tienen un tiempo fijo para la gelización. Ajuste el volumen de las alícuotas de la solución de gel para la eficiencia del usuario en la dosificación si se produce una gelación prematura.
4. Ajuste el pH de la solución HA-SH a 8.0 con 1 N NaOH inmediatamente antes de su uso. Realice una gelificación de prueba mezclando 40 s de HA-SH con 10 ml de PEGDA y controlando la gelización a lo largo del tiempo. La geleración normalmente comienza de 5 a 8 minutos después de mezclar HA-SH con el reticulante PEGDA.
5. Alícuotas de suspensión de células centrífugas durante 2 min (200 x g,temperatura ambiente) a células de pellet. Retire cuidadosamente las células sobrenadantes y resuspendidas en el volumen adecuado de HA-SH.
   NOTA: El hidrogel final es una solución HA-SH:PEGDA de 4:1 (por volumen), por lo que las células deben ser resuspendidas en 40 oL de HA-SH para un volumen final de 50 l.
6. Añadir 10 l de PEGDA a una alícuota de células en HA. Mezclar bien y esperar de 1 a 3 min (dependiendo del tiempo de gelización del paso 4.4) antes de sembrar la placa microfluídica.
   NOTA: Permitir la reacción de gelización del inicio antes de la siembra ayuda a minimizar la sedimentación celular.
7. Fije una punta para dispensar volúmenes de 1,5 ml a una pipeta de repetición de un solo canal y cargue con células en la solución de hidrogel HA. Recuerde mantener la alícuota de hidrogel bien mezclada para asegurar una distribución uniforme de la célula.
8. Para sembrar la placa microfluídica, alinee la punta de la pipeta perpendicular a la placa mientras coloca suavemente la punta en el centro de la entrada de gel (columnas 1, 5, 9, 13, 17, 21) para garantizar el contacto pero sin presión al dispensar la solución de hidrogel. Trabajando rápidamente para prevenir la solidificación prematura de hidrogeles, dispensar 1,5 l de solución de gel en cada entrada de gel.
9. Observe el estado de llenado de los canales microfluídicos visualizando desde la parte superior de la placa, la parte inferior de la placa o por microscopio, y evalúe la carga, utilizando la Figura 3 como guía (carga exitosa en la Figura 3A, guía de posicionamiento de pipetas en la Figura 3B, carga perdida en la Figura 3C, no rellenada para terminar en la Figura 3D, desbordamiento en la Figura 3E). Identifique los ajustes necesarios en la técnica que puedan mejorar el éxito de llenado para la siguiente ronda de chips (consulte la discusión para obtener consejos de solución de problemas).
10. Repita los pasos 4.6 a 4.9 con las 3 alícuotas restantes de las celdas en la solución HA. Invierta la placa mientras prepara la siguiente alícuota (1 min).
    NOTA: El tiempo de espera de 1 minuto y la inversión de la placa mejoran la distribución 3D de las células al reducir la sedimentación celular a medida que se produce la geleración.
11. Una vez llenados todos los chips, incubar la placa a 37oC en una incubadora humidificada hasta que se complete la geleración (45 min).
12. Utilizando el manual suministrado, asegúrese de que el balancín de perfusión esté instalado en la incubadora de cultivo celular con los ajustes de perfusión correctos (ángulo de 14o, intervalos de 4 min).
13. Agregue 50 l de medio de cultivo PDX a todas las entradas medianas (columnas 2, 6, 10, 14, 18, 22) y compruebe si los canales se llenaron correctamente volteando la placa. Toque suavemente la placa contra una superficie para animar al líquido a llenar los canales microfluídicos.
14. Añadir 50 l de DMEM-F12 (10% FBS) para todos los puntos de venta medios (columna 4, 8, 12, 16, 20, 24). Si alguna burbuja de aire está atrapada en el canal de perfusión, retírela tocando suavemente la placa contra una superficie.
15. Usando un microscopio y una forma de diseño de placa(Figura Suplementaria 1),registre el éxito del llenado de virutas. Excluya las virutas mal rellenadas del uso experimental adicional.
16. Coloque la placa sobre un balancín basculante en una inclinación de 14o y un ciclo de 4 minutos para comenzar la perfusión. Reemplazar el medio de cultivo PDX cada 2 días (primero 50 ml en la entrada, luego 50 l en la salida).

5. Tinción celular, imágenes y cuantificación de imágenes

1. Preparar una solución de ensayo de viabilidad celular que contenga tres colorantes fluorescentes (Hoechst 33342, ethidium homodimer-1, calcein acetoxymethyl [AM]).
   1. Preparar las soluciones de stock de cada tinte de la siguiente manera: Hoechst 33342 a 1,6 mM (1 mg/ml) en agua desionizada; calceína AM a 4 mM en DMSO anhidro; ethidium homodimer-1 a 2 mM en DMSO/H₂O (1:4, v/v).
      NOTA: Las soluciones de calceína AM y ethidium homodimer-1 se proporcionan en el kit señalado en Tabla de materiales.
   2. Preparar una única solución de trabajo en HBSS o medio libre de fenol, que contenga los tres tintes. Optimice la concentración de trabajo final para cada tipo de célula y matriz, dentro de los rangos de 1,6 a 8,0 m para Hoechst 33342, 0,1 a 10 m para la calceína AM y de 0,1 a 10 m para el homodimermer de etitio-1.
2. Retire el medio de cultivo y aplique la solución de tinte de viabilidad de trabajo a los chips microfluídicos deseados (75 ml en la entrada, 25 l en la salida) y vuelva a colocar en el balancín de perfusión en la incubadora de cultivo celular durante 1 h.
3. Imagen de las ventanas de observación de los cultivos manchados utilizando un microscopio confocal manual o automatizado (Tabla de materiales) con filtros fluorescentes (listados como longitudes de onda de excitación/emisión, en nm) observar todos los núcleos (Hoechst 33342, 350/461), núcleos de células muertas (ethidium homodimer-1, 528/617) y citoplasma de células vivas (calcein AM, 494/517).
4. Captura pilas Z de 140 m con un tamaño de paso de ≤1 m utilizando un objetivo de aire de 20x. Se necesitan tres campos de visión para poner en imagen todo el microcanal con una pequeña cantidad de superposición. Para evitar el doble muestreo, imagine solo dos campos de visión por chip.
   NOTA: Las condiciones de imagen deben optimizarse para garantizar un muestreo adecuado de NyQuist. En la experiencia de los autores, un sistema de imagen rápido, basado en la desconvolución de una fuente convencional de epifluorescencia o modo de escaneo de resonancia en un confocal, es necesario para ensayar completamente una pila Z completa, con tres colores láser, a través de 96 chips en una placa dentro de una cantidad razonable de tiempo (aproximadamente 3,5 h con imágenes automatizadas, incluida la configuración).
5. Mediante el software de análisis de imágenes, anba las imágenes de la pila Z para los datos cuantificados deseados, como morfología, estado de agregación u otras características. Para cuantificar la viabilidad celular, cuente el número de células muertas (rojo) y los núcleos celulares totales (azul).

Resultados

Se preparó un balancín de perfusión programable en una incubadora de cultivo celular de agua estándar, y se prepararon placas microfluídicas de dos carriles en un gabinete de bioseguridad estándar para la carga (Figura 1). Un tumor MDA-PCA-118b PDX se amplió in vivo, se recolectó cuando había alcanzado un tamaño máximo, y se disociaba como se describe en la sección 2 del protocolo para crear una suspensión de lodos de las células, en aproximadamente un estado de una sola célul...

Discusión

Aquí describimos un método para procesar y cultivar células tumorales derivadas de PDX viables en un sistema de cultivo 3D perfundido y de alto rendimiento. Mientras que este protocolo utiliza tejido PCa PDX, es igualmente eficaz para otros tumores de origen epitelial. Las características tumorales varían entre las líneas PDX individuales incluso dentro del mismo tejido de origen (próstata, mama, etc.). Algunas líneas PCa PDX son más fibrosas y difíciles de aislar las células viables, mientras que otras son m?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1N NaOH			any suitable tissue culture grade
60 mm round tissue culture dishes			any suitable
6-well tissue culture plates			any suitable
70 µm cell strainers	Corning	431751	or equivalent
Centrifuge	Eppendorf	5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes	or equivalent
Density gradient centrifugation solution	Millipore Sigma	P1644	Percoll
Dimethylsulfoxide			any suitable tissue culture grade
Dissociation enzyme solution	StemCell Technologies	07921	ACCUMAX
DMEM-F12	ThermoFisher Scientific	11039021	or equivalent
Forceps			any suitable
HA hydrogel kit	ESI BIO	GS311	HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA)
Hanks Balanced Salt Solution	Lonza	10-527F	or equivalent
Heat-inactivated fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11150
Hemocytometer	Fisher Scientific	02-671-51B Hausser BrightLine	or equivalent
Hoechst 33342	ThermoFisher Scientific	H1398	or equivalent
Image processing software	Oxford Instruments	Imaris 9.3	or equivalent
LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1)	ThermoFisher Scientific	L3224	or equivalent
Microfluidic culture plate	Mimetas	9603-400-B	2-lane OrganoPlate
Microscope	Nikon	A1R	or equivalent
Multichannel pipette	Eppendorf	3125000036	or equivalent
PDX-derived tumor tissue			obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host
Penicillin-streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140-122	or equivalent
Perfusion rocker	Mimetas	OrganoPlate Perfusion Rocker Mini
pH strips (pH 5-9)			any suitable
Phosphate-buffered saline solution	Lonza	17-516F	or equivalent
Razor blades			any suitable
Rotating xy-shaker	VWR	Advanced 3500 Orbital Shaker	or equivalent
Scalpel handle			any suitable
Single channel repeating pipette	Eppendorf	22260201
Sterile, 15mL conical centrifuge tubes			any suitable
Sterile, 50mL conical centrifuge tubes			any suitable