Uso de Bioink de hidrogel multicapa en bioimpresión tridimensional para distribución celular homogénea

Resumen

Aquí, desarrollamos una novedosa estrategia modificada multicapa para bioenergitis similares a líquidos (gelatina con baja viscosidad) para evitar la sedimentación de células encapsuladas.

Resumen

Durante el proceso de bioimpresión tridimensional basado en la extrusión, los bioenergientes similares a líquidos con baja viscosidad pueden proteger las células del daño de la membrana inducido por el estrés de cizallamiento y mejorar la supervivencia de las células encapsuladas. Sin embargo, la rápida sedimentación celular impulsada por gravedad en el depósito podría conducir a una distribución celular inhomogénea en estructuras bioimpresas y, por lo tanto, obstaculizar la aplicación de bioenergías similares a líquidos. Aquí, desarrollamos una novedosa estrategia modificada multicapa para bioinks similares a líquidos (por ejemplo, metacriloilo de gelatina con baja viscosidad) para evitar la sedimentación de células encapsuladas. Múltiples interfaces líquidas fueron manipuladas en el bioenergía multicapa para proporcionar retención interfacial. En consecuencia, la acción de sedimentación celular que atravesaba capas adyacentes en el sistema multicapa se retrasó en el depósito de bioenlatado. Se encontró que la retención interfacial era mucho mayor que el tirón sedimentario de las células, demostrando un papel crítico de la retención interfacial en la prevención de la sedimentación celular y la promoción de una dispersión más homogénea de células en el bioenlaz multicapa.

Introducción

La bioimpresión tridimensional (3D) ha sido un método prometedor para fabricar réplicas arquitectónicas y funcionales complejas de tejidos nativos en biofabricación y medicina regenerativa^1,,2,,3. Las estrategias comunes de bioimpresión, incluyendo inyección de tinta, extrusión e impresión estereolitografía, tienen pros y contras desde diferentes perspectivas^4. Entre estas técnicas, el procedimiento de extrusión se utiliza más comúnmente debido a su rentabilidad. Bioink desempeña un papel clave en la estabilidad del proceso de la bioimpresión de extrusión. El bioenlace celular ideal no sólo debe ser biocompatible, sino también adecuado para las propiedades mecánicas⁵. Los bioinks con baja viscosidad se presentan típicamente como un estado de forma líquida. Estos bioenergiendos se pueden depositar fácil y rápidamente y evitar daños en la membrana celular inducidos por alta tensión de cizallamiento durante la extrusión. Sin embargo, en casos complejos que requieren períodos de impresión a largo plazo, la baja viscosidad a menudo da lugar a la sedimentación inevitable de las células encapsuladas en el depósito de bioenlace, que generalmente es impulsada por la gravedad y conduce a una dispersión celular inhomogénea en el bioenlace^6,7. En consecuencia, un bioenlace con dispersión celular inhomogénea obstaculiza la bioimpresión in vitro de una construcción de tejido funcional.

Varios estudios recientes centrados en bioenergicos han reportado la promoción de la dispersión homogénea de células encapsuladas. Para la bioimpresión de extrusión se utilizó un bioenergiente de alginato modificado basado en el reticulación⁸de doble etapa. Un polímero de alginato fue modificado con péptidos y proteínas en este estudio. Las células presentaban una distribución más homogénea en este alginato modificado que en el alginato comúnmente utilizado debido a los sitios de unión proporcionados por los péptidos y las proteínas. Alternativamente, bioinks mezclados se han utilizado para resolver la sedimentación de células en el bioenergía. En otro^estudiose utilizó un bioenlace mezclado que contiene polietilenglicol (PEG) y gelatina o gelatina de metacriloilo (GelMA) con mayor robustez mecánica. Las células encapsuladas presentaban una distribución homogénea principalmente porque se mejoró la viscosidad del bioenergía mezclado. En general, hay varios factores que influyen en la dispersión de las células encapsuladas en el bioendo, como la viscosidad del bioenlociente, la gravedad de las células, la densidad de las células y la duración del período de trabajo. Entre estos factores, la gravedad de las células desempeña un papel crítico en la promoción de la sedimentación. La flotabilidad y fricción proporcionadas por el bioenergía viscosa se han investigado como las principales fuerzas contra la gravedad hasta la fecha¹⁰.

Aquí, desarrollamos una estrategia novedosa para promover la dispersión homogénea de las células encapsuladas en el bioenergía mediante la manipulación de múltiples interfaces líquidas en el depósito de bioenergía. Estas interfaces líquidas creadas por la modificación multicapa del bioenlaz no sólo pueden proporcionar retención interfacial, lo que retrasa la sedimentación de las células, sino que también mantienen una biocompatibilidad adecuada y un comportamiento reológico del bioenlatado. En la práctica, modificamos la solución GelMA acuosa (5%, p/v) con fibroína de seda (SF) de forma multicapa para producir longitudinalmente cuatro interfaces, proporcionando tensiones interfaciales en el bioenergía mezclado. Como resultado, la carga por gravedad en las células fue compensada por la tensión interfacial artificial, y se obtuvo una dispersión casi homogénea de las células encapsuladas en el bioenlaz debido a una menor sedimentación a través de las capas adyacentes de las células. Hasta la fecha no se ha notificado ningún protocolo similar para frenar la sedimentación de células encapsuladas manipulando la retención interfacial en bioenquisas líquidas. Aquí presentamos nuestro protocolo para demostrar una nueva forma de resolver la sedimentación celular en la bioimpresión.

Protocolo

1. Preparación de SF-GelMA cargado de células

1. Esterilice todos los materiales utilizando unidades de filtro de jeringa de 0,22 m. Realice todos los pasos en un armario de seguridad biológica.
2. Caliente 1x PBS a 50oC, y disuelva la gelatina en el 1x PBS calentado con agitación. La concentración final de gelatina en PBS debe ser del 10% (p/v).
3. Añadir anhídrido metacrílico en la solución de gelatina (relación de peso del anhídrido metacrílico a gelatina de 0,6 a 1) lentamente con la agitación, y mezclar el complejo durante al menos 1 h (50 oC). Típicamente, preparar 200 ml de 10% solución de gelatina con 12 g de anhídrido metacrílico; el volumen depende de las necesidades del estudio.
4. Transfiera la solución mixta que contiene gelatina y anhídrido metacrílico a un tubo estéril de 50 ml.
5. Centrifugar la solución mixta a 3.500 x g. Por lo general, se tarda 3-5 minutos para obtener dos capas. Recoger la capa superior (GelMA) y desechar la capa inferior (anhídrido metacrílico no reaccionado).
6. Diluir la solución de capa superior obtenida en el paso 1.5 con dos volúmenes de agua desionizada (40-50 oC).
7. Dialyze la solución obtenida en el paso 1.6 con una membrana de diálisis de peso molecular de 12-14 kDa contra agua desionizada durante 5 x 7 días (40-50 oC). Cambie el agua dos veces al día.
8. Recoja y congele la solución de GelMA a 80 oC durante la noche.
9. Liofilizar la solución de GelMA durante 3 x 5 días en un secador de congelación con la temperatura ajustada a -45 oC y la presión ajustada a 0,2 mbar.
10. Disolver el GelMA liofilizado (grado de sustitución de aproximadamente 75%) en 1x PBS que contiene 10% de FBS (suero bovino fetal, v/v), 25 mM HEPES (N-2-hidroxietitilpiperazina-N-ácido etano-sulfónico) y fotoiniciador (0,5%, p/v) para obtener la preparación de bioendorgido GelMA.
    NOTA: El grado de sustitución de GelMA se puede calcular mediante un ensayo de ninhidrina³.
11. Mezclar la solución GelMA (10%, p/v) con diferentes volúmenes de solución SF inicial (5%, p/v) y diferentes volúmenes de 1x PBS para obtener bioenergitos SF-GelMA con diferentes concentraciones de SF. La proporción por 1 ml de solución de GelMA y SF en los diferentes bioenergitos se presenta en la Tabla 1.
    NOTA: Todos los bioenergitos deben contener una concentración final de 5% (p/v) GelMA, pero la concentración de SF varía: 0.5, 0.75, 1.0, 1.25 y 1.5% (p/v) en los diferentes bioenergiendos SF-GelMA. Utilice SF-M-Layered-GelMA para denominar el bioenlatado GelMA modificado con SF de una manera capa por capa. Utilice SF-X-GelMA para denominar a aquellos GelMA modificados con SF de manera homogénea (por ejemplo, GelMA con modificación de 1% SF fue llamado SF-1-GelMA).
12. Sonicar todos los bioenergitos durante 10-20 min.
13. Cultivar células NIH3T3 usando DMEM (medio águila modificado de Dulbecco) que contiene 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina en una incubadora (37oC con 5% DE CO_2). Pasaje de las celdas a una proporción de 1:3 cuando la densidad alcanza el 80%.
14. Centrifugar la suspensión de las células NIH3T3 a 1500 rpm durante 5 min. Retire el sobrenadante con succión y resuspenda el pellet celular con solución de bioenergía fresca en un tubo estéril de 15 ml.
    NOTA: La concentración de las células encapsuladas en el bioenlatado debe ser de 1 x 10⁶ células/ml, y la concentración debe calcularse con un citómetro.
15. Utilice 2 ml de diferentes bioenergitis SF-GelMA para suspender los gránulos celulares para obtener diversos bioenergitis cargados de células.

2. Carga, recalentamiento y bioimpresión del SF-M-Layered-GelMA

1. Cargue 0,4 ml de SF-0.5-GelMA cargado de células en la capa inferior de la jeringa.
   NOTA: Utilice una jeringa de 2 ml como depósito de bioenlacús en este estudio. Cargue diferentes bioenergidos SF-GelMA en la jeringa de una manera capa por capa.
2. Colocar la jeringa en un baño de agua helada (0 oC) durante 5 minutos para hacer que el bioenergía de la capa inferior se transforme en un estado de gel.
3. Cargue 0,4 ml de bioenlace SF-0.75-GelMA cargado de células por encima de la capa inferior.
4. Coloque la jeringa con las dos capas de bioenergidos en un baño de agua helada (0 oC) durante 5 minutos para hacer que las dos capas de bioenergitos se transformen en un estado de gel.
5. Ciclo de los pasos de carga y refrigeración otras 3 veces con los 3 tipos restantes de bioenergientes (SF-1-GelMA, SF-1.25-GelMA, SF-1.5-GelMA) para obtener un sistema de bioenlatado multicapa con diferentes concentraciones de SF en las diferentes capas. El volumen utilizado para la carga de todos los bioenergidos debe ser de 0,4 ml.
6. Recalentar el bioenergía multicapa colocando la jeringa en una incubadora (37oC) durante 30 minutos antes de la bioimpresión.
7. Utilice una jeringa de 2 ml como depósito de bioenlacús con una boquilla de impresión de 27 G. Ajuste la velocidad de flujo a 50 ml/min, la velocidad de movimiento de la boquilla a 2 mm/s y la altura de la boquilla a 1 mm. Realice el procedimiento de bioimpresión a temperatura ambiente (aproximadamente 20 oC).
   1. Imprima la construcción de tejido de forma extrusión utilizando una bioimpresora a medida bajo los parámetros adaptados de nuestros estudios anteriores^11,12.
8. Utilice luz ultravioleta (365 nm, 800 mW) durante 40 s para reticular la construcción del tejido bioimpreso.
9. Cultivo de la construcción de tejido reticulado en DMEM (medio águila modificado de Dulbecco) que contiene 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina en una incubadora (37 oC con 5% de CO₂). El medio se cambió cada 8 h durante los primeros 2 días y cada 2-3 días a partir de entonces.

Resultados

En la Figura 1se muestra un esquema de la preparación de bioenergitis cargados de células. Después de la preparación de los diferentes bioenergías, se realizaron la carga, el recalentamiento y la bioimpresión (Figura 2). Para evaluar la distribución de las células encapsuladas en el depósito de bioenlaces, se realizó un procedimiento de bioimpresión utilizando tres bioenergitis diferentes cargados de células en tres placas de 96 pozos (

Discusión

La estabilidad del sistema multicapa es un punto clave para realizar este protocolo con éxito. Teóricamente calculamos la difusión de moléculas SF en la solución GelMA basada en el estudio^{de Nauman 13}. Se encontró que la difusión de proteínas en solución estaba relacionada con su peso molecular. El peso molecular medio (MW) de la albúmina sérica bovina (BSA) es de 66,5 kDa, y su coeficiente de difusión es de 64-72 m²/s. El MW medio de fibrinógeno es de 339,7 kDa, y su coefi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959)	TCI	M64BK-QD
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Gibco	15630080
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Gibco	10569044
fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10091
Gelatin	Sigma-Aldrich	V900863MSDS
Methacrylic anhydride (MA)	Sigma-Aldrich	276685MSDS
Penicillin–streptomycin antibiotics	Gibco	15140163
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	10010049
Silk fibroin	Advanced BioMatrix	5154