Generación rápida y sin fisuras de poxvirus recombinantes utilizando el rango de host y la selección visual

Resumen

Este es un método para generar virus de vacuna recombinante "sin cicatrices" utilizando la selección del rango de host y la identificación visual de virus recombinantes.

Resumen

El virus de la vacuna (VACV) fue fundamental en la erradicación del virus de la variola (VARV), el agente causante de la viruela, de la naturaleza. Desde su primer uso como vacuna, vacv se ha desarrollado como vector para vacunas terapéuticas y como virus oncolítico. Estas aplicaciones aprovechan el genoma fácilmente manipulado de VACV y la amplia gama de hosts como una plataforma excepcional para generar virus recombinantes con una variedad de aplicaciones terapéuticas. Se han desarrollado varios métodos para generar VACV recombinante, incluyendo métodos de selección de marcadores y selección dominante transitoria. Aquí, presentamos un refinamiento de un método de selección de rango de host junto con la identificación visual de virus recombinantes. Nuestro método aprovecha la presión selectiva generada por la proteína quinasa antiviral huésped R (PKR) junto con un gen de fusión fluorescente que expresa mCherry con la etiqueta E3L, uno de los dos antagonistas de PKR VACV. El casete, incluyendo el gen de interés y la fusión mCherry-E3L está flanqueado por secuencias derivadas del genoma VACV. Entre el gen de interés y mCherry-E3L hay una región más pequeña que es idéntica a los primeros 150 nucleótidos del brazo de 3', para promover la recombinación homóloga y la pérdida del gen mCherry-E3L después de la selección. Demostramos que este método permite una generación eficiente y sin problemas de rVACV en una variedad de tipos de células sin necesidad de selección de fármacos o cribado extensivo de virus mutantes.

Introducción

El virus de la vacuna (VACV) fue fundamental para la primera erradicación exitosa de un patógeno humano, el virus de la variola (VARV), de la naturaleza. Desde el exterminio del virus de la variola, los poxvirus, incluido el VVAC, han seguido siendo virus terapéuticos útiles tanto para la medicina humana como para la medicina animal. Por ejemplo, una vacuna contra el virus de la rabia basada en VCVa ha sido muy eficaz para prevenir la transmisión de la rabia silvática en Europa¹ y los Estados Unidos². Más recientemente, los poxvirus recombinantes que expresan una variedad de moléculas antitumorales (por ejemplo, anticuerpos de cadena única o eritropoyetina humana) han visto un éxito alentador como agentes oncolíticos^3,4,5. VACV es particularmente atractivo como vector porque es fácilmente susceptible a la manipulación genética, posee una amplia gama de huéspedes, y es estable en una variedad de condiciones, lo que permite un fácil transporte y viabilidad de la vacuna en el campo^6,7. Si bien se han desarrollado múltiples técnicas para generar VACV recombinante para experimentos de laboratorio y generación de vacunas, las estrategias actuales para generar estos virus tienen limitaciones notables.

Debido a la utilidad de VACV, se han desarrollado múltiples estrategias para generar virus recombinantes. La primera estrategia emplea una recombinación homóloga para introducir un casete que incluya el transgén y un gen marcador seleccionable, como un gen de resistencia a los antibióticos. El cassette está flanqueado por dos nucleótidos de 500 o más grandes que dirigen el gen a un sitio específico en el genoma viral, que luego se integra de forma estable por eventos de doble cruce^8,9,10. Esta estrategia es rápida y eficiente; sin embargo, resulta en material genético extra en forma del gen marcador que puede producir efectos inesperados. Además, hay un límite superior práctico para el número de transgenes que se pueden introducir limitados por el número de marcadores seleccionables únicos disponibles. Las estrategias de selección dominante transitoria (TDS) han abordado esta cuestión facilitando la generación de virus recombinantes "sin cicatrices"¹¹. Usando esta estrategia, un plásmido que contiene un gen VAV mutante y un gen marcador seleccionable se integran en el genoma viral, pero sin ADN VAV de flanqueo adicional. Este enfoque da como resultado la integración transitoria de todo el plásmido y la duplicación del gen VACV como resultado de la integración por un solo evento cruzado. Este intermedio es estable siempre y cuando se mantenga bajo presión de selección, permitiendo el enriquecimiento de esta construcción. Cuando se elimina la selección, la duplicación vacv permite un segundo evento de cruce que da como resultado la eliminación del plásmido y la posterior formación del tipo salvaje (wt) o del virus recombinante en una proporción aproximada de 50:50. Mientras que tDS genera virus recombinantes sin requerir la introducción estable de ADN extraño, múltiples clones de virus deben ser examinados para detectar la mutación esperada mediante análisis de secuenciación, un paso potencialmente lento y costoso.

Aquí, presentamos un enfoque para generar poxvirus recombinantes combinando los mejores aspectos de cada uno de estos enfoques, similar a un enfoque que se ha descrito para la replicación incompetente modificada vaccinia Ankara^12,13,14. Esta estrategia combina la selección de rango visual y de host para generar rápidamente virus recombinantes mediante eventos cruzados dobles, y posteriormente eliminar el gen marcador seleccionable mediante recombinación homóloga. Este enfoque permite la rápida generación de mutantes mediados por la recombinación homóloga, con la naturaleza "sin cicatrices" de los enfoques TDS, sin necesidad de un paso de detección posterior para distinguir el tipo salvaje y los virus mutantes. Nuestro método también utiliza la selección de rango de huésped en lugar de la selección de antibióticos, eliminando el riesgo de cambios fenotípicos inducidos químicamente en la línea celular. Para este enfoque, hemos optado por utilizar la proteína quinasa antiviral huésped R (PKR) como agente selectivo para generar VACV recombinante. PKR se expresa como un monómero inactivo en la mayoría de los tipos de células¹⁵. Al enlazar el ARN de doble cadena (dsRNA) en los dominios de enlace dsRNA N-terminal, PKR dimerizes y se autofosforilated¹⁶. Esta forma activa de PKR fosforila la subunidad alfa del factor de iniciación eucariota 2 (eIF2), inhibiendo en última instancia la entrega de metaonil-tRNA de iniciador al ribosoma, evitando así la traducción intracelular e inhibiendo ampliamente la replicación de muchas familias de virus^17,,18.

En respuesta a la amplia y potente actividad antiviral de PKR, muchos virus han desarrollado al menos una estrategia para prevenir la activación de PKR. La mayoría de los poxvirus expresan dos antagonistas de PKR, codificados por los genes E3L y K3L en VACV, que antagonizan PKR a través de dos mecanismos distintos^19. E3 previene la homodimerización pkR mediante la unión de ARN de doble cadena^20,21, mientras que K3 actúa como un inhibidor de pseudosustrato mediante la unión directa a PKR activado y, por lo tanto, la inhibición de la interacción con su sustrato eIF2²². Es importante destacar que estos dos antagonistas de PKR no inhiben necesariamente pkR de todas las especies. Por ejemplo, el homólogo K3 del virus de la viruela ovina inhibió fuertemente la PKR de las ovejas, mientras que el homólogo e3 de la viruela ovina no mostró una inhibición considerable de PKR^23,24. En este estudio, presentamos un método para utilizar la presión selectiva mediada por PKR combinada con la selección de fluorescencia para generar un VACV recombinante eliminado para E3L y K3L (VC-R4), que no puede replicarse en células competentes PKR derivadas de diversas especies. Este virus recombinante proporciona un excelente trasfondo para la rápida generación de virus recombinantes que expresan genes bajo el control del promotor nativo de E3L.

Protocolo

1. Generación del vector de recombinación

1. Diseñe imprimadores para generar el casete de selección. Diseñe cada amplificador individual con secuencias superpuestas con amplicons vecinos y el vector para facilitar el ensamblaje enzimático isotérmico de moléculas de ADN, también llamado ensamblaje Gibson, utilizando cualquiera de varias herramientas de diseño de imprimación en línea.
   NOTA: Este protocolo también se puede completar utilizando métodos tradicionales de clonación basados en en endonucleasas de restricción. En ese caso, diseñe imprimaciones con los sitios de restricción apropiados en lugar de con secuencias superpuestas.
2. Utilizando las imprimaciones diseñadas en el paso 1.1, la PCR amplifica los siguientes elementos en orden de 5' a 3'(Figura 1):500 nucleótidos de la región genómica VACV 5' del brazo E3L (5'), EGFP o el gen de interés, 150 nucleótidos de la región genómica del VAV inmediatamente 3' de E3L (brazo corto de 3'), un sintético promotor de poxvirus temprano/tardío²⁵, el gen de fusión mCherry-E3L, y 500 nucleótidos de la región genómica VACV 3' de E3L incluyendo el brazo corto de 3' (brazo largo de 3').
   1. En un tubo de PCR, añada los reactivos en el siguiente orden para cada amplificador: 17 l de agua libre de DNase, 1,2 l de cada imprimación (concentración inicial de 10 m, concentración final a 0,5 m), 5 ml de tampón de reacción PCR de 5x, ADN de plantilla (10 ng para amplicons amplificados a partir de plásmidos: EGFP y casete E/L promoter-mCherry-E3L; 100 ng para amplicons amplificado a partir de ADN genómico: 5' y 3' brazos), y 0,5 áml de adn. Ajuste el volumen de agua añadido para un volumen de reacción final de 50 l.
      NOTA: La concentración de ADN de la plantilla debe determinarse empíricamente, pero generalmente comenzamos con 10 ng/reacción.
   2. Colocar el tubo o tubos en un termociclador, y derretir el ADN a 98 oC durante 30 s, y luego utilizar 25 rondas de un protocolo pcR de tres pasos: 98 oC para 5 s, 55 oC para 10 s y 72 oC durante 1 min.
      NOTA: Determine la temperatura de fusión en función de la Tm sugerida por el fabricante para cada conjunto de imprimación. Determine el tiempo de extensión adecuado en función de la longitud de cada amplificador (1 minuto/kb).
3. Visualice los productos de amplificación en un gel de agarosa del 1%. Añadir 10 l de cada producto de ADN y 2 l de tampón de carga a cada poca, y correr a 8 V/cm durante 1 h.
4. Gel purifica cada amplicon usando un kit de extracción de gel de ADN y el protocolo del fabricante. Eluye los amplicons de la columna añadiendo 50 sl de agua libre de DNase e inmediatamente centrifugando.
5. Linealizar el vector de clonación pUC19 utilizando la digestión endonucleasa EcoRI. A un tubo, añadir 1 g de pUC19, agua a un volumen de 17 l, 2 L de tampón de reacción y 1 l (20 unidades) de EcoRI. Incubar a 37oC durante 1 h.
   1. Visualizar los productos de amplificación en un gel de agarosa del 1% a 8 V/cm durante 1 h. Exituir la banda del gel, y purificar el producto utilizando el kit de extracción de gel de ADN como se describe en el paso 1.4.
6. Ligar todos los amplicons individuales, gel purificado y el vector linealizado utilizando un kit de mezcla maestro.
   1. A un tubo PCR, añadir 0.2 pmol de pUC19 linealizado y cada amplicon (brazo de 5', EGFP, brazo corto de 3', e/L promotor-mCherry-E3L cassette, 3'brazo). Agregue agua libre de DNase a un volumen final de 10 l y, a continuación, agregue 10 ml de mezcla maestra de ensamblaje de ADN. Incubar muestras a 50oC durante 1 h.
7. Transformar E. coli químicamente competente con 2 ml del producto ensamblado a partir del paso 1.6 como se describió anteriormente^26,27. Placa 100 l de las células transformadas en placas de agarosa LB que contienen 100 g/ml de ampicilina. Incubar las placas durante la noche a 37oC.
8. Recoger colonias bien aisladas y transferir colonias individuales a tubos que contengan caldo de Luria con ampicilina de 100 g/ml. Incubar los tubos durante la noche a 37 oC mientras agita a 225 rpm.
9. Aísle los plásmidos del cultivo nocturno utilizando un kit de minipreparación de plásmido. Compruebe la concentración y pureza del ADN utilizando un espectrofotómetro. Una relación A260/A280 entre 1,8 y 2,0 es aceptable.
10. Envíe los plásmidos para la secuenciación de Sanger para determinar si el producto de clonación deseado es correcto. Almacenar el ADN a -20 oC.

2. Generación del virus recombinante

1. Infectar una monocapa confluente de células adecuadas con el virus para ser recombinado en una multiplicidad de infección de 1.0 (MOI 1.0) en una placa de 6 pocillos. Incubar las células infectadas a 37oC y 5% de_CO2 durante 1 h. A continuación, aspirar el medio y reemplazarlo con DMEM fresco. Incubar las células infectadas a 37oC y 5% de_CO2.
   NOTA: Para la replicación de virus competentes como un virus de la vacuna que carece de K3L²², una línea celular como la línea de células renales de conejo europeo RK13 (ATCC #CCL-37) o BSC-40 es apropiado. Sin embargo, para los virus deficientes de replicación, como el virus descrito en este artículo que carece de los antagonistas de PKR E3L y K3L, se requiere una línea celular complementaria que exprese estos dos genes en células de derribo o desconexión trans o PKR.
2. Transfectar las células infectadas con 500 ng del vector generado y validado en el paso 1.10 utilizando un reactivo de transfección disponible comercialmente siguiendo el protocolo del fabricante. Incubar las células a 37oC y 5%_co2 durante 48 h.
   NOTA: Si se utiliza un virus de la vacuna que carece de E3L y K3L, la presión selectiva mediada por PKR impulsará la selección de virus recombinados y mantendrá la expresión de la proteína de fusión mCherry-E3L en estas células. Si se desea, también debería ser posible amplificar PCR sólo el inserto para usar para la transfección en lugar de todo el plásmido.
3. 48 horas después de la infección, cosechar la monocapa infectada. En algunos casos, las células se pueden cosechar pipeteando, pero si todavía están bien adheridas, cosecharlas con un rascador de células. Congele las células tres veces y luego sonice los lysates durante 15 s a una amplitud del 50%. Conservar este lisado a -80oC hasta que esté listo para usar.
4. Serialmente 10 veces diluir el lisato cosechado en el paso 2.3 de 10^-1 a 10^-6 añadiendo 120 l del lisado a 1080 l de DMEM (10^-1), y luego agregando 120 ol de esta dilución a 1080 s de DMEM (10^-2), y repitiendo este proceso cuatro veces más. Agregue 1 ml de cada dilución a un individuo, pozo confluente de una línea celular competente PKR, en este caso células RK13.
   1. Incubar las células infectadas a 37oC y 5% de_CO2 durante 1 h. A continuación, aspirar el medio y reemplazarlo con DMEM fresco Incubar las células infectadas a 37 oC y 5% CO₂.
5. 24 a 48 horas después de la infección, identificar virus recombinantes mediante microscopía de fluorescencia. Las placas de los virus recombinantes expresan la fluorescencia roja debido a la integración del gen de fusión mCherry-E3L(Figura 2). Si inicialmente se utilizó un virus carente de inhibidores de PKR, todas las placas contendrán virus recombinantes.
6. La placa purifica los virus recombinantes tres veces en las células RK13. Después de la ronda final de purificación de la placa, todas las placas deben expresar fluorescencia roja.
7. Infectar una placa confluente de 6 pocillos de células RK13 que expresan los inhibidores de LA PKR VACV E3L y K3L (células RK13+E3L+K3L²⁸⁾con el virus de fluorescencia roja purificado por placa del paso 2.6. Apunta a aproximadamente 50-100 placas por pozo.
   NOTA: Estas células proporcionan a los antagonistas de LA PKR VACV en trans y alivian la presión selectiva mediada por PKR para mantener el gen de fusión mCherry-E3L, promoviendo así la generación "sin cicatrices" del virus recombinante.
8. Identifique los virus colapsados mediante microscopía de fluorescencia utilizando un microscopio EVOS2 y un cubo de filtro GFP (Excitación: 470/22, Emisión: 525/50) y un cubo de filtro RFP (Excitación: 531/40, Emisión: 593/40).
   NOTA: La frecuencia con la que se pierde el gen de fusión mCherry-E3L es de aproximadamente 2,5%(Tabla 2). Si EGFP no se incluye como un gen marcador, las placas de virus mutantes que han perdido el gen de fusión mCherry-E3L serán incoloras.
9. La placa purifica las placas de solo verde (VC-R4) o incoloras (E3L) tres veces en las células RK13+E3L+K3L. Asegúrese de que no haya placas de color rojo fluorescencia.
10. Confirmar la pérdida de mCherry-E3L y la presencia de la mutación esperada por PCR y secuenciación de Sanger.
    NOTA: Si el gen o la mutación de interés no tiene actividad inhibitoria de PKR, se deben cultivar virus recombinantes en células RK13+E3L+K3L o en una línea celular deficiente o equivalente inhibida por PKR(Figura 3).

Resultados

Usamos el procedimiento diagramado en la Figura 1 para generar un VACV que carece de ambos antagonistas PKR E3L y K3L, reemplazando E3L por EGFP en un virus ya eliminado para K3L (vP872). La Figura 2 muestra placas fluorescentes rojas en células RK13 competentes de PKR indicativas de la expresión viral de mCherry-E3L, así como EGFP expresada en células RK13+E3L+K3L que confirman la pérdida de E3L y el colapso del marcador de selección mCherry-E3L.

Discusión

Aquí presentamos una variación de una estrategia de selección de marcadores transitorios ³² para generar virus de vacuna recombinante sin retener ADN extraño en el virus recombinante final. Nuestra estrategia utiliza presión selectiva mediada por la proteína antiviral huésped PKR en lugar de otras formas de presión selectiva como los antibióticos. El uso de genes antivirales de huésped elimina la posibilidad de cambios fenotípicos inducidos químicamente en las células, o un mayor ries...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2X-Q5 Master Mix	NEB	M0492L	High-fidelity polymerase used in PCR
Ampicillin	ThermoFisher Scientific	11593027	Bacterial selective agent
Disposable Cell Scrapers	ThermoFisher Scientific	08-100-242	Cell scraper to harvest infected cells
EVOS FL Auto 2 Cell imaging system	ThermoFisher Scientific	AMAFD2000	Fluorescent microscope
EVOS Light Cube, GFP	ThermoFisher	AMEP4651	GFP Cube
EVOS Light Cube, RFP	ThermoFisher	AMEP4652	RFP Cube
GenJet	SignaGen Laboratories	SL100489	Transfection reagent
Luria Bertani (LB) Broth	Gibco	10855021	Bacterial growth medium
Monarch DNA gel extraction kit	NEB	T1020L	Gel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors
Monarch Plasmid Miniprep kit	NEB	T1010L	Miniprep kit ussed to purify plasmids
NanoDrop One	ThermoFisher Scientific	ND-ONE-W	Spectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration
NEBuilder Master Mix	NEB	E2621L	Isothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector
Q500 Sonicator	Qsonica	Q500-110	Sonicator for virus lysates
RK13 cells	ATCC	CCL-37	Rabbit kidney cells
VWR Multiwell Cell Culture plates	VWR	10062-892	Cell culture plates