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  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí, presentamos protocolos para analizar la remodelación ósea dentro de una plataforma de laboratorio en un chip. Un dispositivo de carga mecánica impreso en 3D se puede emparejar con la plataforma para inducir la transducción de mechanostratos de osteocitos deformando la matriz celular. La plataforma también se puede utilizar para cuantificar los resultados funcionales de remodelación ósea de osteoclastos y osteoblastos (resorción/formación).

Resumen

La remodelación ósea es un proceso estrictamente regulado que se requiere para el crecimiento y la reparación esquelética, así como para adaptarse a los cambios en el entorno mecánico. Durante este proceso, los osteocitos mecanosensibles regulan las respuestas opuestas entre los osteoclastos catabólicos y los osteoblastos anabólicos. Para comprender mejor las vías de señalización altamente intrincadas que regulan este proceso, nuestro laboratorio ha desarrollado una plataforma fundamental de laboratorio en chip (LOC) para analizar los resultados funcionales (formación y resorción) de la remodelación ósea dentro de un sistema a pequeña escala. Como la remodelación ósea es un proceso largo que se produce en el orden de semanas o meses, desarrollamos protocolos de cultivo celular a largo plazo dentro del sistema. Los osteoblastos y osteoclastos se cultivaron en sustratos de actividad funcional dentro del LOC y se mantuvieron hasta siete semanas. Posteriormente, las virutas se desmontaron para permitir la cuantificación de la formación y resorción ósea. Además, hemos diseñado un dispositivo de carga mecánica impreso en 3D que se empareja con la plataforma LOC y se puede utilizar para inducir la transducción de mecanocitos de osteocitos deformando la matriz celular. Hemos optimizado los protocolos de cultivo celular para osteocitos, osteoblastos y osteoclastos dentro de la plataforma LOC y hemos abordado las preocupaciones de esterilidad y citotoxicidad. Aquí, presentamos los protocolos para fabricar y esterilizar el LOC, sembrar células en sustratos funcionales, inducir la carga mecánica y desmontar el LOC para cuantificar los resultados de los endpoints. Creemos que estas técnicas sentan las bases para desarrollar un verdadero órgano en un chip para la remodelación ósea.

Introducción

El hueso es un tejido altamente dinámico que requiere una coordinación intrincada entre los tres tipos principales de células: osteocitos, osteoblastos y osteoclastos. Las interacciones multicelulares entre estas células son responsables de la pérdida ósea que se produce durante la parálisis y la inmovilidad a largo plazo y de la formación ósea que se produce en respuesta al crecimiento y al ejercicio. Los osteocitos, el tipo de célula ósea más abundante, son altamente sensibles a los estímulos mecánicos aplicados al hueso. La estimulación mecánica altera la actividad metabólica de los osteocitos y conduce a un aumento de las moléculas clave de señalización1,2. A través de este proceso, conocido como mecanotransducción, los osteocitos pueden coordinar directamente las actividades de osteoblastos (células formadoras de huesos) y osteoclastos (células resorteantes óseas). Mantener la homeostasis ósea requiere una regulación estricta entre la formación ósea y las tasas de resorción ósea; sin embargo, las alteraciones en este proceso pueden resultar en estados de la enfermedad como osteoporosis u osteopetrosis.

La complejidad de las interacciones entre estos tres tipos de células se presta bien a la investigación utilizando tecnologías microfluídicas y de laboratorio en chip (LOC). Para ello, nuestro laboratorio ha establecido recientemente una prueba de concepto de una plataforma LOC para analizar la resorción ósea y la formación (resultados funcionales) en el proceso de remodelación ósea. La plataforma se puede utilizar para el estudio de interacciones celulares, entornos de carga alterados y pruebas de detección de drogas en investigación. En los últimos años, se han desarrollado varios dispositivos microfluídicos para investigar las vías de señalización molecular que regulan la remodelación ósea; sin embargo, muchos de estos sistemas cuantifican la remodelación a través de marcadores indirectos que son indicativos de la actividad funcional3,4,5,6,7. Una ventaja de nuestro sistema es que se puede utilizar para la cuantificación directa de los resultados funcionales. La remodelación ósea es un proceso a largo plazo. Como tal, la cuantificación directa de la resorción y formación ósea requiere un sistema de cultivo que se pueda mantener durante un mínimo de varias semanas a meses8,9,10,11. Por lo tanto, al desarrollar la plataforma LOC, establecimos protocolos de cultivo a largo plazo necesarios para la formación y resorción y hemos mantenido células dentro del sistema hasta siete semanas11. Además, incorporamos sustratos de cultivo apropiados para ambos tipos de células en la plataforma; los osteoclastos se cultivaban directamente en los huesos, y los osteoblastos, que se sabe que eran adherentes plásticos, se cultivaban en discos de poliestireno. Además, abordamos cuestiones relativas a la esterilidad, la citotoxicidad a largo plazo y el desmontaje de virutas para el análisis de remodelación11,12.

La plataforma LOC también se puede utilizar para inducir la mecanotransducción de mecanocitos osteocitos a través de la deformación de la matriz. Se desarrolló un dispositivo de carga mecánica impreso en 3D para emparejarse con el LOC y aplicar una distancia estática fuera del plano para estirar las celdas13. Para acomodar esta carga mecánica, se incrementó la profundidad del pozo dentro del LOC. Este dispositivo de carga mecánica simple a pequeña escala puede ser fácilmente producido por laboratorios con experiencia de ingeniería limitada, y hemos compartido previamente dibujos de los componentes impresos en 3D13. En el trabajo actual, demostramos algunas de las técnicas novedosas necesarias para el uso exitoso del LOC. Específicamente, demostramos la fabricación de virutas, la sembrado celular en sustratos funcionales, la carga mecánica y el desmontaje de virutas para la cuantificación de remodelación. Creemos que la explicación de estas técnicas se beneficia de un formato visual.

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Protocolo

1. Preparación de la máscara de chip

NOTA: Los pasos 1.1 - 1.3 solo deben realizarse una vez al recibir la máscara de chip inicial. Aseguran que la máscara no se incline durante el uso. El diseño de las máscaras microfluídicas fue descrito previamente11,14. Las máscaras fueron diseñadas internamente y fabricadas comercialmente utilizando estereolitografía de alta resolución(Figura 1A).

  1. Cubra la superficie superior de la máscara con láminas de plástico para proteger esta superficie del adhesivo. Fije la máscara de viruta a una hoja de acrílico de igual tamaño utilizando adhesivo en aerosol. Sujete las piezas durante la noche para permitir que el adhesivo se cure por completo. Después de que el adhesivo esté seco, retire las láminas de plástico de la parte superior de la máscara.
  2. Fije la parte inferior de la hoja de acrílico a una caja de nivelación impresa en 3D(Figura Suplementaria 1, Archivos Suplementarios 1-4) utilizando cinta adhesiva de doble cara. Presione firmemente para asegurar un enlace apretado.
  3. Selle las aberturas pequeñas cerca de la pared desmontable de la caja nivelada con un sellador impermeable. Deje que el sellador se cure durante 24 horas.
  4. Limpie la superficie de la máscara con un 70% de etanol (EtOH). Coloque la caja de nivelación con la máscara de viruta deseada en el horno. Utilice un transportador digital para asegurarse de que la parte superior de la máscara está nivelada. Ajuste los tornillos de nivelación si es necesario.

2. Fabricación de PDMS

NOTA: Un diseño de viruta de pozo poco profundo (1 mm) se utiliza para ensayos de actividad funcional (formación y remordición), y un diseño de viruta de pozo profundo (10 mm) se utiliza para estudios de carga mecánica. La parte inferior del pozo profundo se forma mediante la fijación de una membrana DELGADA independiente PDMS(Figura 1B).

  1. Capa de tapa (Capa 1)
    1. Combine 63 g de prepolímero PDMS y 6,3 g de agente de curado (10:1 de proporción) en una taza de plástico. Mezclar bien con una espátula de celda desechable y desgasen se despide en un desecador al vacío durante 30 min.
    2. Vierta lentamente la mezcla en la caja de nivelación preparada. Deje que el PDMS se quede durante 30 minutos y luego hornee a 45 oC durante 18 h.
    3. Afloje los bordes del PDMS con una espátula de laboratorio cónica y retire la hoja de polímero de la caja de nivelación.
    4. Corte las tapas individuales a medida (70 mm x 34 mm) utilizando un bisturí y una plantilla impresa en 3D.
    5. Perforar los orificios de acceso a través de cada tapa con un punzón de biopsia (1 mm de diámetro).
    6. Limpie las tapas de la superficie con cinta adhesiva.
      NOTA: Si las tapas no se utilizan inmediatamente, envuelva cada una en cinta de embalaje y guárdelas a temperatura ambiente (RT).
  2. Capa de pozo y microcanal (Capa 2)
    1. Combine el prepolímero PDMS y el agente de curado (10:1 de proporción) en una taza de plástico. El diseño de pozos poco profundos requiere 43 g de prepolímero y 4,3 g de agente de curado, y el diseño de pozo profundo requiere 227 g de prepolímero y 22,7 g de agente de curado. Mezclar el polímero vigorosamente y desgasificación durante 30 min.
      NOTA: Esto supone una dimensión de máscara de 152,4 mm x 152,4 mm.
    2. Vierta lentamente la mezcla sobre la mascarilla prenivelada apropiada. Deje que el PDMS se quede durante 30 minutos y luego hornee a 45 oC durante 18 h.
    3. Afloje los bordes del PDMS con una espátula de laboratorio cónica y pele cuidadosamente el polímero lejos de la máscara. Utilice un bisturí y una plantilla impresa en 3D para cortar virutas individuales.
      NOTA: Para los estudios de carga es importante que las dimensiones de la viruta (70 x 34 mm) sean precisas y que el pozo se encuentre en el centro del chip.
    4. Limpie el PDMS con cinta adhesiva.
      NOTA: Si los chips no se utilizan inmediatamente, envuelva cada chip en cinta de embalaje y guárdelos en RT.
  3. Membrana Thin PDMS (Capa 3)
    NOTA: Esta capa solo se utiliza para el diseño de pozos profundos.
    1. Añadir 12,7 g de prepolímero PDMS y 1,3 g de agente de curado (10:1 de proporción) a una taza de plástico. Mezclar vigorosamente y desgasifigas durante 30 min.
    2. Vierta lentamente el polímero en la caja de nivelación preparada y raspe completamente la taza de plástico para eliminar tanto PDMS como sea posible.
    3. Utilice la espátula celular para distribuir PDMS en toda la superficie.
      NOTA: Si el polímero no se extiende manualmente, la tensión superficial será suficiente para evitar que el polímero forme una lámina uniforme.
    4. Deje que el PDMS se quede durante 30 minutos y luego hornee a 45 oC durante 18 h.
    5. Afloje los bordes del PDMS con una espátula cónica y retire cuidadosamente la hoja PDMS de la caja de nivelación. Corte membranas individuales que coincidan con las dimensiones de la capa 2.
    6. Mida el espesor de la membrana en el centro de la membrana utilizando pinzas. Deseche las membranas que estén fuera del espesor deseado (0,5 mm a 0,1 mm).
    7. Limpie cuidadosamente las membranas con cinta adhesiva de embalaje y colóquelas en una pieza de película de parafina.
      NOTA: Si las membranas no se utilizan inmediatamente, cubra la parte superior de la membrana con cinta adhesiva de embalaje y guárdelas en RT.

3. Sustratos de actividad funcional

NOTA: Los discos de poliestireno y las obleas óseas deben estar unidos a la parte inferior de los pozos que se utilizarán para los cultivos de osteoblastos y osteoclastos, respectivamente.

  1. Discos de poliestireno (Figura 1C)
    1. Coloque la cinta de enmascaramiento en la parte posterior de un cubreobjetos de poliestireno tratado con cultivo de tejido. Corte los discos circulares de la cubierta con un perfil de corcho afilado (5,4 mm de diámetro). Sumerja los discos en 70% EtOH y déjelos pasar la noche.
    2. Frota suavemente la superficie superior del disco con un aplicador con punta de algodón empapado en 70% EtOH. Asegúrese de que el borde exterior del disco esté bien limpiado.
    3. Con dos pares de fórceps, sostenga el disco y retire el respaldo de cinta adhesiva. Coloque el disco tratado hacia abajo y limpie la parte posterior con un aplicador con punta de algodón.
    4. Sumerja el extremo de madera de un aplicador con punta de algodón en una mezcla desgasifada de PDMS sin curar y coloque una pequeña cantidad del polímero en la parte inferior del pozo deseado.
      NOTA: Los PDMS no curados restantes se pueden almacenar a -20 oC.
    5. Coloque el disco de poliestireno, tratado hacia arriba, en el pozo y presione suavemente hacia abajo sobre el disco con un hisopo de algodón. Asegúrese de que ningún PDMS no curado entre en contacto con el lado tratado del disco.
      NOTA: Si PDMS entra en contacto con la superficie tratada del disco, extraiga el disco del pozo y repita los pasos 3.1.4 y 3.1.5 con un disco nuevo.
    6. Deje que la viruta se sitúe en una superficie nivelada durante 30 minutos y luego hornee a 65 oC durante 4 h.
  2. Obleas óseas
    1. Utilice fórceps para colocar una oblea ósea (6 mm de diámetro, 0,4 mm de espesor) en la parte inferior de un plato de 100 mm. Mantenga la oblea firme con los fórceps y encienda suavemente una 'X' en la parte posterior de la oblea con un bisturí.
      NOTA: Durante el proceso de toma de imágenes, la 'X' se utiliza para distinguir entre la parte posterior de la oblea y la superficie en la que se sembraron las células.
    2. Utilice el extremo de madera de un aplicador con punta de algodón para añadir una pequeña cantidad de PDMS sin curar a la parte inferior del pozo deseado. Coloque la oblea ósea, marcada hacia abajo, en el pozo y use un aplicador de punta de algodón para presionar la oblea hacia abajo.
    3. Deje que la viruta se sitúe en una superficie nivelada durante 30 minutos y luego hornee a 65 oC durante 4 h.

4. Montaje y esterilización de virutas

  1. Active las superficies de la capa 1 y la capa 2 con un limpiador de plasma durante 30 s utilizando un ajuste de potencia de radiofrecuencia media (RF) (equivalente a aproximadamente 10,2 W).
  2. Alinee los orificios de acceso en la capa 1 con los microcanales de la capa 2 y presione firmemente las dos capas juntas.
  3. Para el diseño de pozo profundo, repita el paso 4.1 con la capa 2 y la capa 3. Durante el tratamiento de plasma, utilice cinta adhesiva de doble cara para unir la película de parafina de la capa 3 a una superficie plana.
  4. Utilice un bisturí para recortar el exceso de material de la membrana PDMS. Retire cuidadosamente la hoja de película de parafina de la parte inferior del chip
  5. Hornee el chip a 65 oC durante 10 minutos para aumentar la resistencia de la unión entre las capas de PDMS.
  6. Inserte las puntas dosificadoras en ángulo (18 Gauge, 0.5 in, 90o) en los orificios de acceso de la tapa. Fije las puntas dosificadoras a la tapa con un epoxi de dos partes. Utilice una punta de micropipette para aplicar el epoxi alrededor de cada punta dispensadora.
  7. Después de que el epoxi se haya curado completamente, limpie la superficie con un 70% de EtOH y colóquelo en un gabinete de bioseguridad. Realice todos los pasos posteriores dentro del gabinete de bioseguridad.
  8. Conecte una jeringa de 5 ml a las puntas dosificadoras con tubos de silicona estériles (1/32'' ID, 10 cm de longitud) y llene todo el chip con 70% EtOH durante al menos 30 s. Para el diseño de pozos poco profundos, administre todos los líquidos con una bomba de jeringa establecida a un caudal de 4 ml/h. Para el diseño de pozo profundo, administre todos los líquidos dispensando lentamente la jeringa a mano.
  9. Retire el EtOH del chip y esterilice el chip con luz UV durante la noche.
  10. Lavar el chip 3 veces con dH2O. Llenar el chip con dH2O, retirar el tubo de las puntas dosificadoras e incubar durante al menos 48 h a 37 oC.

5. Montaje del dispositivo de carga mecánica

NOTA: Los procesos de diseño y fabricación para el dispositivo de carga mecánica impreso en 3D(Figura 2A-C)se describieron previamente y se han proporcionado previamente13.

  1. Autoclave todos los componentes del dispositivo de carga durante 30 min a 121 oC.
    NOTA: Para evitar la deformación de los componentes impresos, envuelva cada pieza individualmente en papel de aluminio y colóquela sobre una superficie plana dura durante el proceso de autoclave. El hardware metálico se puede envolver juntos. Complete todos los pasos posteriores dentro de un gabinete de bioseguridad.
  2. Coloque un muelle de compresión alrededor del eje de la platina e inserte la platina en el orificio central en la parte inferior de la base (Figura 2D).
  3. Fije el bloque de esfera a la parte inferior de la base utilizando cuatro tornillos autorroscantes.
  4. Coloque un segundo resorte de compresión alrededor del tornillo central. Inserte el tornillo en el orificio en forma hexagonal en la parte inferior de la esfera y atornille el ensamblaje en el orificio roscado en el centro del bloque de marcado.
  5. Atornille cuatro separaciones hombre-mujer en la parte inferior de la base.
  6. Retire la holgura del dispositivo girando el dial en sentido antihorario hasta que la parte superior de la platina esté por debajo de la parte superior de la base. A continuación, gire lentamente el dial en el sentido de las agujas del reloj hasta que la parte superior de la platina esté nivelada con la parte superior de la base.

6. Experimentación

NOTA: Los protocolos para experimentos de actividad funcional se proporcionaron anteriormente11,12.

  1. Estudios de carga (Figura 3)
    1. Siguiendo el paso 4.9, utilice una jeringa de 5 ml para extraer dH2O del chip de pozo profundo. Recubrir la parte inferior del pozo con 200 ml de colágeno tipo I de 0,15 mg/ml (CTI) en 0,02 M de ácido acético durante 1 h.
    2. Enjuague el chip tres veces con la solución salina con fosfato de Dulbecco con calcio y magnesio (DPBS++).
    3. Coloque el chip en el soporte de virutas y la semilla con osteocitos MLO-Y4 a una densidad de 2 x 104 células/ml en un medio alfa esencial mínimo (MEM) complementado con un 5% de suero de ternera, un 5% de suero bovino fetal y un 1% de penicilina/estreptomicina.
    4. Retire el tubo de las puntas dosificadoras y coloque el chip en un plato de cultivo de pozo profundo (150 mm x 25 mm). Incubar células a 37oC y 5%co2 durante 72 h.
    5. Coloque el tubo estéril en las puntas de dosificación y utilice una jeringa de 5 ml para eliminar el medio de cultivo gastado de la viruta. Dispensar lentamente en un medio de cultivo fresco para rellenar la viruta.
    6. Coloque el soporte de la viruta en el retén rectangular en la parte superior de la base del dispositivo de carga. Alimente el tubo a través de las ranuras situadas en la tapa del dispositivo de carga y fije la tapa a la base con cuatro tornillos de cabeza de sartén y tuercas hexagonales.
      NOTA: Para asegurarse de que la tapa permanece nivelada, primero fije dos tornillos que se encuentran diagonalmente entre sí antes de fijar los dos tornillos restantes.
    7. Aplique la carga a las células girando el dial en el sentido de las agujas del reloj hasta que se alcance el desplazamiento deseado de la platina.
      NOTA: El dispositivo está diseñado para que una rotación de la esfera equide a un desplazamiento de platina de 1 mm. El campo de deformación unitaria generado en la parte superior de la membrana PDMS se modeló previamente como una función de desplazamiento de platina utilizando el análisis de elementos finitos (FEA)13.
    8. Coloque el dispositivo de carga en una caja de punta de micropipeta P1000 vacía. Incubar las células con la carga aplicada durante 15 min.
      NOTA: El período de tiempo de carga utilizado aquí sirve de ejemplo. Se pueden utilizar tiempos de carga alternativos.
    9. Después de la incubación, retire la carga de las celdas girando el dial en sentido antihorario hasta que la platina vuelva a la posición inicial original. Retire la tapa del dispositivo y coloque el soporte de la viruta en la placa de cultivo de pozo profundo. Incubar las celdas durante un período de recuperación posterior a la carga de 90 minutos.
      NOTA: Una vez más, el período de tiempo de recuperación utilizado aquí sirve como ejemplo. Se pueden utilizar tiempos de recuperación alternativos. Para estudios a largo plazo, alimentar las células cada 72 h.
    10. Utilice una jeringa de 5 ml para extraer el medio acondicionado del chip.
      NOTA: Este medio se puede guardar y almacenar a -80 oC.
    11. Retire el chip del soporte de la viruta y utilice una espátula cónica para romper el vínculo entre la tapa PDMS y la capa de pozo.
      NOTA: Los ensayos celulares ahora se pueden realizar siguiendo cualquier protocolo establecido para una placa de cultivo celular.

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Resultados

La configuración de pozos poco profundos se puede utilizar para analizar la actividad funcional de osteoblastos y osteoclastos. La formación ósea a través de osteoblastos y resorción a través de osteoclastos requiere tiempos de cultivo en el orden de varias semanas a meses. La formación ósea a partir de preosteoblastos MC3T3-E1 se cuantificó utilizando rojo alizarin y manchas de von Kossa11,15. En el día 49, la superfici...

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Discusión

Este artículo describe los fundamentos para fabricar una plataforma LOC de remodelación ósea para el cultivo de osteocitos, osteoclastos y osteoblastos. Al alterar la profundidad y el tamaño del pozo dentro del chip, se desarrollaron múltiples configuraciones para estimular los osteocitos con carga mecánica y cuantificar los resultados funcionales de la remodelación ósea(Figura 1B).

Durante el montaje de la viruta, la optimización del pro...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la National Science Foundation bajo Grant No. (CBET 1060990 y EBMS 1700299). Además, este material se basa en el trabajo apoyado por el Programa de Becas de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias bajo la Beca No. (2018250692). Todas las opiniones, hallazgos, conclusiones o recomendaciones expresadas en este material son las de los autores y no reflejan necesariamente las opiniones de la Fundación Nacional de Ciencias.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Acrylic sheetOptix--3.175 mm thick
Angled dispensing tipsJensen GlobalJG18-0.5X-90Remove plastic connector prior to use
Biopsy punchRobbins InstrumentsRBP-101 mm diameter
Bone wafersBoneslices.com0.4 mm thickBovine cortical bone
Bovine calf serumHycloneSH30072
CalipersGlobal IndustrialT9F534164
Cell spatulaTPP99010
Chip maskProtoLabsCustom-designedPrint material: Accura SL 5530
Cork borerFisher Scientific07-865-10B
Cotton tipped applicatorPuritan806-WCL
Culture dish (100 mm)Corning430591Sterile, Non-tissue culture treated
Culture dish (150 mm)Corning430597Sterile, Non-tissue culture treated
Double sided tape3M CompanyScotch 237
Fetal bovine serumHycloneSH30910
ForcepsFisher Scientific22-327379
Leveling boxCustom-made--3D printed
Masking tape3M CompanyScoth 2600
MC3T3-E1 preosteoblastsATCCCRL-2593Subclone 4
Mechanical loading deviceCustom-made--3D printed
Minimum essential alpha mediumGibco12571-063
MLO-Y4 osteocytes----Gift from Dr. Lynda Bonewald
Packaging tapeDuck Brand--Standard packaging tape
Paraffin filmBemis ParafilmPM999
Penicillin/streptomycinInvitrogenp4333
Plasma cleanerHarrick PlasmaPDC-001Expanded plasma cleaner
Polydimethylsiloxane kitDow CorningSylgard 184
Polystyrene coverslipsNunc Thermanox174942Sterile, tissue culture treated
OvenQuincy Lab12-180
RAW264.7 preosteoclastsATCCTIB-71
ScalpelBD Medical372611
Silicone tubingSaint-Gobain TygonABW00001ID: 1/32" (0.79 mm), OD: 3/32" (2.38 mm)
SolidWorks softwareDassault Systèmes--Used to generate 3D printed models and perform FEA
Spray adhesiveLoctite2323879Multi-purpose adhesive
Syringe (5 ml)BD Medical309646Sterile
Syringe pumpHarvard Apparatus70-2213Pump 11 Pico Plus
Tapered laboratory spatulaFisher Scientific21-401-10
Two-part expoxyLoctite13953915 minute quick set
Type I collagenCorning354236Rat tail collagen
Vacuum desiccatorBel-ArtF42010-0000
Waterproof sealantGorilla8090001100% silicone sealant

Referencias

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