Optimización de la Técnica del Manguito para el Trasplante cardíaco murino

Resumen

Introducimos un enfoque de tubo interno para la técnica del manguito para el trasplante de corazón heterotópico cervical del ratón para ayudar a mantener el vaso sobre el brazalete. Encontramos que la cooperación entre dos cirujanos experimentados acorta notablemente el tiempo de operación.

Resumen

El trasplante cardíaco murino se ha realizado durante más de 40 años. Con los avances en microcirugía, se han utilizado ciertas nuevas técnicas para mejorar la eficiencia quirúrgica. En nuestro laboratorio, hemos optimizado la técnica del manguito con dos pasos principales. En primer lugar, utilizamos la técnica del tubo interno para insertar un tubo interno temporal en la vena yugular externa y el vaso sanguíneo de la arteria carótida para facilitar la eversión del vaso sobre el manguito. En segundo lugar, realizamos un trasplante heterotópico completo a través de la colaboración de dos cirujanos experimentados. Estas modificaciones redujeron efectivamente el tiempo de operación a 25 minutos, con una tasa de éxito del 95%. En este informe, describimos estos procedimientos en detalle y proporcionamos un video complementario. Creemos que este informe sobre la técnica mejorada del manguito ofrecerá orientación práctica para el trasplante de corazón heterotópico murino y mejorará la utilidad de este modelo de ratón para la investigación básica.

Introducción

El establecimiento de un trasplante de corazón heterotópico de ratón a través de la anastomosis de extremo a extremo dentro del abdomen en 1973 fue un hito importante en la investigación básica de inmunología de trasplantes^1. Este modelo proporcionó una herramienta importante y válida para analizar los mecanismos de la lesión por reperfusión de isquemia^2,rechazo inmunológico, y tolerancia^3,,4. Sin embargo, la naturaleza compleja y lenta de la cirugía, así como el potencial de infecciones pueden resultar en adherencias abdominales perioperatorias graves y reacciones inflamatorias, lo que resulta en una baja eficiencia para el modelo de trasplante de corazón heterotópico.

La técnica de trasplante de corazón heterotópico cervical fue descrita por primera vez por Chen en 1991⁵. En este modelo, la vena yugular externa del receptor se anastomosa a la arteria pulmonar del injerto y la arteria carótida se anastomos a la aorta ascendente. Las principales ventajas de este método son la conveniencia de monitorear y reducir el traumatismo al receptor. En el mismo año, Matsuura describió una técnica mejorada, en la que el extremo de la vena yugular externa y la arteria carótida se disponen sobre un manguito de teflón y se fijaron con una ligadura de seda circunferencial⁶. Algunos investigadores también fijan el manguito a la arteria pulmonar derecha en el corazón del donante antes de insertar el manguito en la vena yugular externa del receptor^7. Hasta ahora, la técnica del manguito se ha aplicado ampliamente en varios modelos de trasplante de pediculo vascular, incluyendo los de trasplante de pulmón^8,hígado⁹y renal^10.

Hasta la fecha, hay varias dificultades asociadas con la técnica del manguito. Por ejemplo, la arteria carótida es difícil de sobrepasar el manguito debido a la elasticidad adicional, lo que resulta en que el tejido se voltea hacia atrás. Por lo tanto, se puede requerir una práctica adicional y un dilatador microquirúrgico para completar este paso. Además, la preparación del vaso cervical puede tardar hasta 25 minutos.

Para resolver estos problemas, introducimos la técnica del tubo interno, que se basa en la técnica del manguito e incluye la fijación del manguito en la vena yugular externa y la arteria carótida utilizando un tubo interno para ayudar con la eversión de la pared del vaso. Además, con un entrenamiento sencillo, la preparación de los destinatarios se reduce a 15,5 minutos. Esta técnica reduce la complejidad de la operación y no requiere práctica adicional o el uso de un dilatador vascular. Se puede aplicar en todas las investigaciones inmunitarias de trasplante, especialmente para verificar la tolerancia inmune de terceros durante la cual el receptor recibe dos aloinjertos cardíacos, uno dentro del abdomen y el otro en el cuello¹¹. También recomendamos la cooperación entre dos cirujanos calificados para establecer este modelo, con un cirujano preparando el animal receptor y el otro cosechando e implantando el corazón del donante. Dicha colaboración puede reducir el tiempo de operación a 25 minutos. Usando este procedimiento optimizado, hemos establecido modelos de trasplante de corazón de ratón singéneo, alogénico^{12,,,13, 14,,,1315,16,,,17,18,,19,}y xenogéneo^{ratón 20}.

La razón para el desarrollo de la técnica del tubo interno fue reducir el tiempo de operación para el establecimiento de un modelo de trasplante de corazón de ratón con una alta tasa de éxito. La optimización del modelo de trasplante de corazón cervical facilita la adquisición de altas tasas de éxito en un corto período de tiempo de cirugía en comparación con la técnica tradicional de sutura y manguito²¹. Además, el modelo de cooperación puede reducir aún más el tiempo isquémico cálido del corazón del donante en comparación con las cirugías realizadas con un solo operador.

Protocolo

Los animales (BALB/c, C57BL/6, macho, 8-12 semanas) se alojan en una instalación específica libre de patógenos en el Centro Animal del Laboratorio de la Universidad de Xiamen. C57BL/6 se utiliza como receptor y BALB/c se utiliza como donante. Todos los procedimientos se realizan de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC).

NOTA: Para la operación son necesarios un conjunto de instrumentos microquirúrgicos, que incluyen una micro tijera, microppps rectos, microvócilos curvos y micropetas de agujas (Tabla y materiales, Figura 1B, C, D, E). Se necesita un par de abrazaderas bulldog de un solo uso (Figura 1F). Dos manguitos para la vena yugular externa y la arteria carótida se preparan cortando los tubos de poliamida personalizados con un bisturí No. 10 bajo un microscopio. El diámetro de la vena y del manguito de la arteria es de 0,9 mm y 0,55 mm, respectivamente. Además, el diámetro del tubo interno para el manguito venoso correspondiente es de 0,6 mm, y estos del tubo interno para el manguito de la arteria correspondiente es de 0,28 mm(Figura 1G).

1. Preparación del destinatario

1. Anestfetizar el ratón receptor con pentobarbital (60 mg/kg, i.p). Usa cortadoras mecánicas atraumáticas para quitar el cabello en la región cervical lateral derecha.
2. Utilice un aplicador de punta de algodón estéril para limpiar el área quirúrgica con antiséptico de yodo seguido de 70% de etanol.
3. Coloque el ratón en la posición supina en la plataforma de operación. Cubra el ratón con gasa estéril.
4. Usa una tijera oftálmica para hacer una incisión transversal desde la mitad inferior del cuello de un tercio hasta la articulación derecha del hombro-clavícula.
5. Aísle la vena yugular externa derecha con micro fórceps curvos para exponer suficiente longitud, corte las ramas a través de la electrocoagulación y ligar el recipiente en el extremo distal usando una sutura de seda 6-0.
6. Sujete la vena yugular externa proximally usando una abrazadera bulldog y luego transecte la vena proximally a la ligadura usando una micro tijera.
7. Lavar el lumen del vaso con solución salina heparinizada de 100 U/ml 0-4 oC para eliminar cualquier sangre residual.
8. Tire de la vena yugular externa a través del manguito de la vena utilizando micro fórceps rectos; insertar el tubo interior de la vena en el lumen como un stent, y evert la pared del vaso sobre el manguito con micro fórceps rectos (Figura 2A).
9. Fijar el endotelio del vaso everted en el extremo proximal del manguito usando un circunferencial 8-0 sutura de seda (Figura 2B).
10. Utilice micro fórceps rectos para extraer el tubo interno de la vena del vena vaso.
11. Realice una disección contundente con micro pinzas curvadas para aislar la arteria carótida derecha adyacente al borde interno del esternocleidomastoideo.
12. Sujete la arteria carótida derecha proximally usando una abrazadera de bulldog, ligar la arteria carótida distalmente usando una sutura de seda 6-0, y utilizar una micro tijera para transecto la arteria carótida proximally a la ligadura.
13. Lavar la arteria carótida con solución salina heparinizada de 100 U/ml 0-4 oC para eliminar cualquier sangre residual.
14. Pase la arteria carótida a través del manguito de la arteria e inserte el tubo interno de la arteria en el vaso de la arteria utilizando micro fórceps rectos(Figura 2C).
15. Evert el recipiente sobre el manguito utilizando micro fórceps rectos; arreglar el endotelio del recipiente everted usando un 8-0 circunferencial sutura de seda (Figura 2D).
16. Retire el tubo interno de la arteria del vaso arterial con micro fórceps rectos.
    NOTA: Conservar la glándula submandibular del receptor.

2. Preparación del donante

1. Anestesar el ratón donante con pentobarbital (60 mg/kg, i.p). Usa cortadoras mecánicas atraumáticas para eliminar el cabello en la región abdominal.
2. Coloque el ratón en la posición supina en la plataforma de operación. Cubra el ratón con gasa estéril.
3. Utilice un aplicador de punta de algodón estéril para limpiar el área quirúrgica con antiséptico de yodo seguido de 70% de etanol.
4. Haga una incisión de línea media abdominal con una tijera oftálmica y exponga la cavidad abdominal.
5. Utilice micro fórceps curvos para exponer la vena cava inferior, y luego inyecte por vía intravenosa 200 ml de 100 U/ml 0-4 oC de solución salina heparinizada por cada 20 g de peso corporal a través de la vena cava inferior.
6. Realizar toracotomía con tijeras oftálmicas, cortar las costillas a través de las incisiones bilaterales de la línea media axilar, voltear la pared anterior del pecho hacia afuera para exponer la cavidad torácica.
7. Exintervó el timo con micro fórceps curvos.
8. Exponga la aorta, y luego perdone 200 l de 100 U/ml 0-4 oC solución salina heparinizada a la arteria coronaria a través del arco aórtico.
   NOTA: Evite perfunder burbujas de gas en el corazón del donante.
9. Utilice una micro tijera para transeccular la aorta ascendente al principio del arco aórtico.
10. Transecta la arteria pulmonar al principio de las dos ramas principales con una micro tijera.
11. Ligar la vena cava superior y la vena cava inferior proximally usando una sutura de seda 6-0 y utilizar una micro tijera para transecto vena distalmente a la ligadura.
12. Ligar las venas pulmonares juntas, circunferencialmente, usando una sola sutura de seda 6-0, y cortar las ramas de la vena distalmente a la ligadura usando una micro tijera.
13. Retire el injerto cardíaco de los tejidos blandos circundantes; conservarlo en solución salina heparinizada de 0-4oC.

3. Implantación cardíaca

1. Coloque el corazón del donante boca abajo en la región del cuello derecho del receptor.
2. Introduzca la arteria pulmonar del corazón del donante en un lazo de seda 6-0 con micro fórceps rectos.
3. Envuelva el lumen del vaso alrededor del manguito de la vena, y luego apriete los bucles de sutura de seda 6-0 alrededor del manguito para auralizar la articulación del vaso.
4. Realizar anastomosis de la aorta del injerto y el manguito de la arteria siguiendo los pasos descritos en el paso 3.2.
5. Suelte la vena yugular sujeta seguida de la arteria yugular sujeta. Mantenga la articulación del vaso sin torcido y asegúrese de que el flujo sanguíneo no esté obstruido.
   NOTA: El ritmo sinusal que vuelve a más de 200 veces en 1 min se considera normal.
6. Humedezca el corazón del donante con solución salina tibia (37 oC) e inspeccione si el injerto está sangrando. Ajuste el injerto cardíaco pulsante en el espacio subcutáneo y, a continuación, sutura la incisión.

4. Cuidado postoperatorio y evaluación del injerto

1. Registre el tiempo al ritmo sinusal normal y la preservación del ritmo sinusal normal durante al menos 5 minutos después de la liberación de la abrazadera para monitorear la función del injerto postoperatorio.
2. Coloque el recipiente solo en una manta caliente hasta que el receptor se despierte de la anestesia. Administrar analgesia de buprenorfina, 0,05 mg/kg, s.c, al final de la cirugía y cada 12 horas durante 72 horas después de la cirugía.
3. Registre diariamente el peso y el estado de recuperación postoperatorio del destinatario. En caso de pérdida de peso >15% en relación con la fecha de la cirugía, parálisis hemipléjica, o infección, eutanasiar al receptor a través de la inhalación de isoflurano terminal²¹.
4. Supervise diariamente la supervivencia del injerto por palpación. La cirugía se considera exitosa si el aloinjerto murino sobrevive por >72 horas. Califique la función del injerto, como se informó previamente²²: Escala 3 - vigorosamente pulsa y frecuencia; Escala 2 - menos pulsada; Escala 1- fibrilación y rechazo inminente; o Escala - 0, pérdida de latidos del corazón y rechazo completo.

Resultados

Tiempo de operación quirúrgica

Después del entrenamiento, un cirujano experto puede realizar con éxito la operación dentro de los 35 minutos utilizando la técnica del tubo interno, en la que se requieren aproximadamente 15,5 minutos para la preparación del receptor, se requieren 10,9 minutos para la preparación del donante y 4,4 minutos para las anastomosas del corazón del donante. El tiempo de isquemia fría y caliente (desde la preparación del donante hasta la impl...

Discusión

Los modelos de trasplantes de corazón de ratón son herramientas importantes para la investigación de inmunología de trasplantes, ya que existen herramientas y materiales para evaluar los mecanismos inmunológicos de este modelo y un gran número de ratones modificados genéticamente. Sin embargo, los desafíos técnicos microquirúrgicos, como la sutura y la eversión de los buques, han limitado su uso generalizado. En el presente estudio, hemos investigado ciertos desafíos técnicos básicos del trasplante de coraz...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artery cuff	Self-made		Polyamide tube. diameter: 0.55 mm,length: 1.0 mm
Artery inner tube	Self-made		Polyamide tube. Diameter: 0.28mm
Micro curved forceps	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	WA3050	1/8 arc, 0.3-mm tip without a hook
Micro needle holders	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	WA2050	0.2-mm tip
Micro scissors	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	WA1050	Straight, blade length: 10 mm
Micro straight forceps	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	WA3060	0.15-mm tip without a hook
Scanlan Vascu-Statt Bulldog Clamps	Scanlan International Inc	1001-531	Clamping pressure 20–25 grams
Vein cuff	Self-made		Polyamide tube. diameter: 0.9 mm,length: 1.2 mm
Vein inner tube	Self-made		Polyamide tube. Diameter: 0.6 mm